Содержание к диссертации
Введение
2 Основная часть 23
2.1 Обзор литературы 23
2.1.1 Закономерность организации и функционирования бактериальных сообществ в силосной экосистеме и их роль в ферментационных процессах 23
2.1.2 Роль эпифитной микрофлоры кормовых культур как основы получения качественных и безопасных кормов 36
2.1.3 Проблема присутствия микроскопических грибов и микотоксинов в объемистых кормах 46
2.1.3.1 Биоразнообразие токсигенных микромицетов в кормовом травостое и силосе 46
2.1.3.2 Распространение микотоксинов в кормовом травостое и силосе 55
2.1.3.3 Метаболизм микотоксинов в организме КРС и их воздействие на состояние здоровья и молочную продуктивность 63
2.1.4 Структура и функции микробиоценозов организма жвачных животных и их роль в физиологических процессах 75
2.1.5 Современный подход к получению безопасных консервированных кормов 89
2.1.5.1 Биодеструкция микотоксинов штаммами бактерий: метаболические пути и генетические системы 89
2.1.5.2 Управление микробными популяциями в силосной экосистеме с помощью интродукции штаммов бактерий 96
2.1.5.3 Профилактика и лечение микотоксикозов КРС в животноводстве с помощью метода энтеросорбции 104
2.1.6 Разнообразие существующих методов исследования структуры микробных сообществ экосистем 110
2.1.7 Современные методы исследования содержания микотоксинов 123
2.2 Материалы и методика исследований 130
2.2.1 Объекты исследований 130
2.2.2 Методика отбора образцов 140
2.2.3 Микробиологические методы культивирования, идентификации и исследования антимикробной активности микроорганизмов 142
2.2.4 Молекулярно-биологические методы анализа микрофлоры: T-RFLP, NGS-секвенирование, количественная ПЦР, секвенирование 144
2.2.5 Аналитические методы исследования 150
2.2.5.1 Биохимический анализ кормов, крови, молока 150
2.2.5.2 Анализ содержания микотоксинов методами ИФА и ВЭЖХ 152
2.2.5.3 Анализ спектра метаболитов штаммов бактерий методами ГЖХ-МС и HPLC153
2.2.5.4 Технология производства сорбента микотоксинов 154
2.2.5.5 Методика определения сорбционной емкости сорбента микотоксинов 155
2.2.6 Методика постановки лабораторных экспериментов по биодеструкции микотоксинов 157
2.2.7 Методика постановки модельных экспериментов по консервированию кормов158
2.2.8 Методики проведения научно-хозяйственных экспериментов 159
2.2.9 Математическая и статистическая обработка материалов исследований 167
2.3 Результаты собственных исследований 168
2.3.1 Результаты метагеномного анализа закономерностей организации комплексов микробиоты, важных для создания биологически безопасных кормов 168
2.3.1.1 Закономерности организации комплексов эпифитной микрофлоры 168
2.3.1.1.1 Разнообразие микрофлоры филлосферы в зависимости от вида кормовой культуры 168
2.3.1.1.2 Тенденции формирования структуры эпифитного метагенома кормовых культур под влиянием различных экологических факторов 180
2.3.1.1.3 Вклад состава ризосферной микрофлоры в формирование эпифитного микробиоценоза кормовых культур 188
2.3.1.2 Результаты изучения микроэкологии силосного микробиоценоза 197
2.3.1.2.1 Структура микробиома на разных этапах технологического процесса производства силоса 197
2.3.1.2.2 Особенности состава микробиоценоза сенажа и плющеного зерна 222
2.3.1.3 Связь состава микрофлоры кормов со структурой микробиома жвачных и состоянием здоровья 229
2.3.1.4 Влияние микотоксинов кормов на состав микрофлоры рубца жвачных 239
2.3.2 Результаты исследования содержания микотоксинов и микромицетов - их продуцентов - в травостое и силосе 243
2.3.2.1 Распространение микромицетов - продуцентов микотоксинов - в филлосфере кормового травостоя и силосе 245
2.3.2.2 Результаты анализа распространения микотоксинов в растениях в процессе вегетации 249
2.3.2.2.1 Распространение микотоксинов в фуражном травостое 249
2.3.2.2.2 Распространение микотоксинов в кормах жвачных Арктической зоны РФ 254
2.3.2.3 Мониторинг содержания микотоксинов в консервированных кормах 260
2.3.2.3.1 Распространение микотоксинов в силосах из животноводческих хозяйств Российской Федерации 260
3.2.3.2. Содержание микотоксинов в зависимости от срока хранения и вида корма 269
2.3.2.3.3 Мониторинг содержания афлатоксина М1 в молоке коров 272
2.3.3 Разработка комплексной стратегии получения безопасных кормов 277
2.3.3.1 Создание коллекции перспективных биоконтролирующих агентов для подавления патогенных бактерий и микромицетов 277
2.3.3.2 Исследование способности штаммов-антагонистов к биодеструкции микотоксинов in vitro 281
2.3.3.3 Изучение спектра антимикробных метаболитов штаммов в составе заквасок методами ГЖХ-МС и HPLC 289
2.3.3.4 Применение биоконтроля для снижения микотоксикологической нагрузки в процессе вегетации кормовых культур 294
2.3.3.5 Результаты производственной проверки биоконтролирующих штаммов бактерий в процессе консервирования кормов 297
2.3.3.6 Экономическая эффективность применения силосных заквасок 306
2.3.3.7 Этапы разработки новой полиштаммовой закваски Биотроф2+ 309
2.3.3.7.1 Лабораторные эксперименты по разработке закваски Биотроф2+ 309
2.3.3.7.2 Физиолого-биохимические свойства и анализ токсичности штаммов в составе закваски Биотроф 2+ 315
2.3.3.7.3 Молекулярно-генетическая идентификация штаммов в составе закваски Биотроф2+ 319
2.3.3.7.4 Модельные эксперименты по силосованию с применением новой закваски Биотроф2+ 324
2.3.3.7.5 Производственные испытания новой полиштаммовой закваски Биотроф2+ 332
2.3.3.7.6 Разработка технологии производства закваски Биотроф2+ 334
2.3.4 Разработка комплексных энтеросорбентов микотоксинов для молочного животноводства 337
2.3.4.1 Выбор носителя для энтеросорбентов микотоксинов на основе анализа сорбционой емкости 337
2.3.4.2 Выбор модификаторов и разработка технологических параметров процесса производства Заслона-Фито 341
2.3.4.3 Определение токсичности Заслона-Фито 346
2.3.4.4 Результаты производственных испытаний Заслона-Фито на КРС 350
2.3.4.4.2 Результаты исследования эффективности энтеросорбента фитобиотика Заслона Фито в рационах дойных коров 352
2.3.4.5 Экономическая эффективность применения Заслона-Фито в животноводстве 356
2.3.4.6 Изучение эффективности нового комплексного энтеросорбента Заслон2+ в молочном животноводстве 357
3 Заключение 369
3.1 Обсуждение результатов исследования 369
3.2 Выводы 377
3.3 Рекомендации производству 397
3.4 Перспективы дальнейшей разработки темы 399
Список использованной литературы 400
Приложения 456
- Закономерность организации и функционирования бактериальных сообществ в силосной экосистеме и их роль в ферментационных процессах
- Молекулярно-биологические методы анализа микрофлоры: T-RFLP, NGS-секвенирование, количественная ПЦР, секвенирование
- Распространение микотоксинов в кормах жвачных Арктической зоны РФ
- Изучение эффективности нового комплексного энтеросорбента Заслон2+ в молочном животноводстве
Закономерность организации и функционирования бактериальных сообществ в силосной экосистеме и их роль в ферментационных процессах
Силосная экосистема является искусственно созданной, непрерывно изменяющейся и подвергающейся анропогенному прессу, что делает ее уникальной микробиоэкологической нишей. Обобщая результаты, полученные с использованием традиционных микробиологических методов (Гардер и др., 1935а, Гардер и др., 1935б, Мишустин, 1947, Мишустин, 1964, Федулина, 1965, Мак-Дональд, 1985, Langston, Bouma, 1960, Lindgren et al., 1985, Weinberg, 1987, Jonsson, 1991, Lin et al., 1992, Wiedmann et al., 1994), а также молекулярно-биологических методов (Buxton et al., 2003, Sad et al., 2003, McEniry et al.,2008, 2011, Paola et al., 2011, Li, Driehuis, 2013, Nishino, 2013, Muck, 2013), необходимо подчеркнуть, что для силосной микроэкосистемы характерны очень сложные внутренние связи и специфические закономерности динамики. Резкая смена значений сукцессионных агентов (окислительно восстановительного потенциала, температуры, влажности, уровня рН, порой достигающего экстремальных величин, и др.) определяет уникальность таксономического разнообразия микрообиоценоза, крайне гетерогенного и динамичного. В условиях, искусственно созданных или упрощенных человеком, регуляторные связи ослаблены и, следовательно, в них возможны как неконтролируемое размножение отдельных представителей естественных сообществ микробиоты, так и уменьшение численности других.
Большая часть сведений, касающихся микробного биоразнообразия силоса была получена с использование классических микробологических методов. Так, отечественными учеными: Е.Н. Мишустиным (Мишустин, 1947, Мишустин, 1964)и Л.А. Гардером (Гардер и др., 1935а, Гардер и др., 1935б) - процесс сукцессии силосной микроэкосистемы был разделен на четыре условных основных этапа, имеющих различную временную продолжительность и уровень интенсивности брожения. Позже Барнеттом (Barnett, 1954) были внесены некоторые детали и уточнения хода течения процессов. С развитием микробиологической науки, этапы процесса были пересмотрены Вайнбергом и Маком (Weinberg, Muck, 1996), а также Мерри c соавторами (Merry et al., 1997).
В целом, в процессе силосной сукцессии растительного сырья можно выделить три основные фазы процессов брожения: аэробную, основного брожения и покоя (Мишустин, 1947, Мишустин, 1964, Гардер и др., 1935а, Гардер и др., 1935б, Barnett, 1954, Weinberg, Muck, 1996, Merry et al., 1997).
При закладке на хранение растительный субстрат претерпевает уплотнение не сразу, а через несколько часов. Присутствие атмосферного кислорода провоцирует активные процессы размножения эпифитных облигатных и факультативных аэробных микроорганизмов, прежде всего, дрожжей. В фазу аэробного брожения биохимические изменения, происходящие в хранящемся субстрате возникают не только вследствие деятельности микроорганизмов, но и в результате действия растительных ферментов. В процессе дыхания, происходящего в свежескошенном субстрате под действием растительных ферментов, большая часть энергии окисленных моносахаров преобразуется в тепловую. Параллельно наблюдается процесс протеолиза в результате деятельности растительных протеаз, которые инициируют разложение белков до аминокислот и амидов.
При вытеснении атмосферного кислорода из силосного субстрата происходит создание низкого окислительно-восстановительного потенциала (условий, близких к анаэробным), что инициирует начало второй фазы силосной сукцессии – фазы основного брожения. Продолжительность этой фазы составляет от 1 до 4 недель, в зависимости от генотипа кормовой культуры и специфических условий силосования. Во второй фазе силосной сукцессии происходят кардинальные сдвиги в структуре микробиоценоза: при соблюдении технологии закладки и хранения растительного субстрата главенствующую роль начинают играют молочнокислые бактерии. Согласно исследованиям Мерри с соавторами (Merry et al., 1997), увеличение скорости размножения молочнокислых бактерий тесно коррелирует с темпом снижения уровня рН и накопления молочной кислоты. На данном этапе силосной сукцессии некоторые факультативные и облигатные анаэробные микроорганизмы, такие как энтеробактерии, клостридии, бациллы и дрожжи, в определенных случаях способны вступать в конкуренцию с молочнокислыми бактериями за питательные вещества, освобождающиеся из коллапсирующих растительных клеток и тканей.
Третья, конечная фаза (фаза покоя) обусловлена низкими значениями уровня рН, окислительно-восстановительного потенциала, а также сокращением содержания водорастворимых углеводов в силосной экосистеме. На данном этапе силосной сукцессии наблюдается снижение содержания молочнокислых бактерий в логарифмической прогрессии. Исследователи (Мак-Дональд, 1985, Langston, Bouma, 1960, Buxton et al., 2003) регистрируют присутствие некоторых количеств кислото-толерантных видов дрожжей в слабо активном состоянии, а также эндоспор бацилл и клостридий.
На данном этапе процессы изменения в физико-химическом составе и питательной ценности растительного субстрата сводятся к минимуму. Теоретически, при условии отсутствия контакта консервированного силосного субстрата с атмосферным кислородом, продолжительность данной фазы может стремиться к бесконечности.
При вскрытии хранилища атмосферный кислород проникает в массив консервированного субстрата в количествах, достаточных, чтобы инициировать рост нежелательных микроорганизмов и, как следствие, вторичную аэробную ферментацию. Наиболее часто ответственны за возникновение аэробной нестабильности дрожжи и микроскопические грибы. Возрастание численности данных микроорганизмов способствует резкому увеличению температуры силосного субстрата и провоцирует снижение концентрации молочной кислоты, повышение уровня рН, а также существенное уменьшение питательной ценности. По данным Хонига и Вульфорда (Honig , Woolford, 1980) эти потери могут достигать 30-50 г/кг сухого вещества в день.
Доминирование молочнокислых бактерий в фазы основного брожения и покоя при соблюдении технологии закладки и хранения растительного субстрата связано с их устойчивостью к уровню pH до 3,0—3,5, что делает их крайне конкурентоспособными в условиях силосной экосистемы.
Хотя эта группа морфологически гетерогенна (включает длинные и короткие палочки, а также кокки), в физиологическом отношении ее можно охарактеризовать в значительной степени целостно. Все относящиеся к ней бактерии грамположительны, не образуют спор и в подавляющем большинстве неподвижны. По потребности в кислороде они занимают промежуточное положение между облигатными анаэробами и цитохромсодержащими факультативными и облигатными аэробами. Несмотря на то что они не способны к синтезу гемопротеинов (таких, как цитохромы и каталаза), лактобактерии способны поддерживать жизнедеятельность в присутствии атмосферного кислорода благодаря возможности продуцировать антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу, а также накапливать ионы марганца внутри клетки; будучи анаэробами, они все же аэротолерантны (Axelsson L. et al., 2004).
Первая попытка классификации молочнокислых бактерий была сделана Орла Йенсеном в 1919 г. (Orla-Jensen, 1919), который дифференцировал их на две категории в зависимости от способности сбраживать гексозы: гомоферментативные и гетероферментативные. В последующее время ряд исследователей (Nilsson et al., 1956; Whittenbury, 1965; Whittenbury, 1966; Kandler, 1983, Kandler, Weiss, 1986, Axelsson et al., 2004) подверг данную классификацию пересмотру. В настоящее время группу молочнокислых бактерий принято подразделять на три категории в зависимости от их физиологических и биохимических свойств.
1. Облигатно-гомоферментативные молочнокислые бактерии -, ферментируют глюкозу и другие гексозы, а также некоторые дисахариды преимущественно до молочной кислоты (более 85%). При этом образуются 2 моля лактата на 1 моль глюкозы: С6Н12О6 = 2СН3СН(ОН)СООН Из остатков сахара эти бактерии образуют лишь незначительное количество побочных продуктов брожения (летучие кислоты и углекислоту).
Молекулярно-биологические методы анализа микрофлоры: T-RFLP, NGS-секвенирование, количественная ПЦР, секвенирование
Выделение тотальной ДНК для проведения молекулярно-биологических анализов осуществляли согласно методике, описанной в Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., 1984), Ильиной (Ильина, 2013) и Ушаковой с соавторами (Ушакова и др., 2013), в собственной модификации. Тотальную ДНК из исследуемых образцов выделяли с использованием набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas, Inc.», Литва) следуя рекомендациям производителя. Концентрацию полученной ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit («Invitrogen, Inc.», США) с использованием наборов «Quant-iT dsDNA Broad-Range Assay Kit» («Invitrogen, Inc.», США), согласно рекомендациям производителя.
T-RFLP-анализ проводили согласно методике, описанной в трудах Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., 1984), Ильиной (Ильина, 2013) и Ушаковой с соавторами (Ушакова и др., 2013), в собственной модификации. Амплификацию ДНК для проведения T-RFLP-анализа осуществляли с использованием ДНК-амплификатора Verity («Life Technologies, Inc.», США) с помощью эубактериальных праймеров: 63F (CAGGCCTAACACATGCAAGTC) – с меткой на 5 -конце (флуорофор D4 – WellRed) и 1492R (TACGGHTACCTTGTTACGACTT), которые позволяют амплифицировать фрагмент гена 16S pРНК с позициями от 63 до 1492 (нумерация указана для гена 16S pРНК E. Coli). Флуоресцентно меченные ампликоны гена 16S pРНК очищали с помощью раствора 3 М гуанидин-изотиоционата по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). Концентрацию ампликонов в растворе определяли с помощью флуориметра Qubit («Invitrogen, Inc.», США) с использованием наборов «Quant-iT dsDNA Broad-Range Assay Kit» («Invitrogen, Inc.», США), согласно рекомендациям производителя. Рестрикцию 40 нг ампликонов 16S pРНК проводили в течение 2 ч при температуре 37С с использованием рестриктазам HaeIII, HhaI и MspI, следуя рекомендации изготовителя (“Fermentas”, Литва). Продукты рестрикции осаждали этанолом, затем смешивали с добавлением 0,2 мкл маркера молекулярного веса Size Standart-600 (“Beckman Coulter”, США) и 10 мкл формамида Sample Loading Solution (“Beckman Coulter”, США). Анализ проводили с помощью прибора CEQ 8000 (“Beckman Coulter”, США) согласно рекомендациям производителя. Погрешность прибора CEQ 8000 составляла не более 5%. Вычисление размеров пиков и их площади проводили в программе Fragment Analysis (“Beckman Coulter”, США), на основании чего выделяли подтипы (филотипы) с принятой в исследовании погрешностью в 1,5 нуклеотида и определяли их процентное содержание в микробном сообществе. Принадлежность бактерий к определенной филогенетической группе определяли с использованием программы Fragment Sorter (ohiostate.edu/trflpfragsort/index.php).
Амплификацию для последующего проведения NGS-секвенирования проводили с использованием ДНК-амплификатора Verity («Life Technologies, Inc.», США) с помощью эубактериальных праймеров (IDT), 343F (5 -CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3 ) и 806R (5 -GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3 ), фланкирующих участок V1V3 гена 16S рРНК. Метагеномное секвенирование осуществляли на геномном секвенаторе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с набором MiSeq Reagent Kit v3 («Illumina, Inc.», США). Максимальная длина полученных последовательностей составила 2 х 300 нт. Химерные последовательности были исключены из анализа с помощью программы «USEARCH 7.0» (http://drive5.com/usearch/). Обработка полученных ридов 2 х 300 нт происходила с помощью биоинформатической платформы «CLC Bio GW 7.0» («Qiagen», Нидерланды) и включала в себя перекрывание, фильтрацию по качеству (QV 15), триммирование праймеров. Определение таксономической принадлежности микроорганизмов до рода проводили с применением программы RDP Classifier (https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp).
ПЦР в реальном времени проводили с использованием амплификатора детектирующего ДТ Lite-4 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) с помощью «Набора реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя EVA Green» (ЗАО «Синтол», Россия) и праймеров (5 -3 ), перечень которых приведен в таблице 13. Условия амплификации для бактерий соответствовали каждому праймеру согласно исследованиям.
Для анализа количества микроскопических грибов и дрожжей применяли следующие праймеры (5 -3 ):
универсальные праймеры на общее количество микромицетов - ITS If TCCGTAGGTGAACCTGCGG, 5.8s CGCTGCGTTCTTCATCG,
отдельно грибов Aspergillus sp. - Aspl CGGCCCTTAAATAGCCCGGTC, Asp2 ACCCCCCTGAGCCAGTCCG,
Fusarium sp. - ITS-Fu-f CAACTCCCAAACCCCTGTGA, ITS-Fu-r GCGACGATTACCAGTAACGA,
Penicillium sp. - otapksPVfor TACGGCCATCTTGAGCAACGGCACTGC, otapksPVrev ATGCCTTTCTGGGTCCAGTA,
дрожжей Saccharomyces cerevisiae - Salb28SF ATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGATACTGCCAGCCTAGACC, Salb28S CGCTCTTCCAGCCATAAGAC,
Candida sр. -CaLb28SF ATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGATACTGCCAGCCTAGACC, Calb28S CGCTCTTCCAGCCATAAGAC (Zhao et al., 2009).
При этом использовали следующие условия амплификации: 95С-3 мин. (1 цикл), 95С-1 мин., 57,6С-1 мин., 72С-1мин. (40 циклов),72С-5мин (1 цикл).
Секвенирование проводили согласно методике, описанной в трудах Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., 1984) и Ильиной (Ильина, 2013), в собственной модификации. Выделение ДНК проводили из 1,5 мл ночной культуры бактерий.
Смесь для проведения ПЦР-амплификации включала следующие компоненты: праймеры - 5 пМ: 27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG и 1525r AAGGAGGTGWTCCARCC (ДНК-синтез, Москва); Taq-полимеразу - 2,5 единиц (Fermentas, США); Х10 буфер для Taq-полимеразы (Fermentas, США); MgCl2 - 2,5 мМ; смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов - до концентрации 150мкМ; ДНК - 10 нг. Деионизированной водой пробу доводили до объема 20 мкл. Реакции проводили в автоматическом амплификаторе iCycler (Bio-Rad, США) и MaxyGene (Axygen, США) при следующем режиме: 95С - 3 мин; 94С - 30 с, 55С - 30 с, 72С - 1 мин (34 цикла); 72С - 25 мин.
Далее проводили электрофорез амплификата в 1%-ном агарозном геле. Очищенные фрагменты, содержащие гены 16S рРНК (1000 п.н.), клонировали в векторе рTZ-57R (Fermentas) в компетентные клетки E.coli штамма DH5А. Скрининг трансформантов проводили с помощью метода бело-голубой селекции (Маниатис, 1984).
Для этого проводили ПЦР-амплификацию колоний белого цвета с помощью праймеров М13: М13: 5 -GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3 , гМІЗ: 5 GAGCGGATAACAATTTCAC ACAGG-3. Секвенирование проводили с использованием секвенатора CEQ8000 (Beckman Coulter) следуя рекомендациям производителя. Идентификацию микроорганизмов проводили сравнением нуклеотидной последовательности фрагментов гена 16S рРНК с последовательностями, представленными в базе данных NCBI BLAST.
Для изучения относительной экспрессии генов, связанных с иммунитетом проводили экстракцию РНК и синтез кДНК.
Тотальную РНК из образцов выделяли с помощью набора Auram Total RNA Mini Kit («BioRad», США) согласно инструкции производителя.
При помощи набора iScript Reverse Transcription Supermix («BioRad», США) осуществляли реакцию обратной транскрипции для получения кДНК на матрице РНК.
Реакцию амплификации с праймерами генов проводили при помощи набора SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix («BioRad», США) согласно протоколу производителя (El Khoury et al, 2016). Список праймеров для оценки экспрессии генов, участвующих в иммунном ответе представлен в таблице 14.
Распространение микотоксинов в кормах жвачных Арктической зоны РФ
Оленеводство занимает ведущую роль для регионов Арктической зоны Российской Федерации, как в качестве продовольственной базы, так и в качестве источника шкурной, пантовой и эндокринно-ферментной продукции. Рацион питания Rangifer tarandus составляют преимущественно малопитательные скудные растительные корма. В зимне-весенний период в рационе R. tarandus доля лишайников возрастает до 70%, лишь 30% приходится на представителей Embryophyta. В летне-осенний период основу кормовой базы животных составляют до 300 видов высших растений (представители семейств Salicaceae, Poаceae, вида Bеtula nаna и др.), доля лишайников составляет не более 15%.
Физиология северных оленей, в том числе, состояние рубцовой микрофлоры, претерпевает гораздо меньшее антропогенное вмешательство в отличие от крупного рогатого скота. Так, например, по мнению ряда исследователей (Palo, 1993, Sundset, 2009), анаэробные микроорганизмы рубца северных оленей проявляют способность к детоксикации усниновой кислоты (Лузина, Салахутдинов, 2016) и микотоксинов (Толпышева, 2005, Буркин, Кононенко, 2013, 2014), содержащихся в лишайниках.
Публикации, касающиеся содержания токсичных метаболитов микромицетов в составе летних пастбищных рационах северных оленей полностью отсутствуют как в отечественной, так и зарубежной литературе, поэтому изучение данной проблемы представляет значительный научный интерес. Содержание микотоксинов в тканях высших растений, составляющих основу летнего рациона северных оленей, ранее в мире не изучали. Это связано с тем, что проведение научных экспедиций в Арктику сопряжено с рядом серьезных трудностей. Однако в 1964 г. исследователям (Kingsbury, 1964 и др.) удалось зафиксировать возникновение интоксикации организма Rangifer tarandus вследствие потребления кормов.
Как видно из таблицы 37, практически во всех исследованных пробах компонентов летнего рациона северных оленей (как лишайников, так и высших растений) нами было выявлено присутствие микотоксинов. В России в настоящее время уровни предельно-допустимых концентраций микотоксинов для кормов северных оленей не установлены. В Единых ветеринарных (ветеринарно-санитарных) требованиях, предъявляемых к фуражным кормам для жвачных животных: зерну, овсу, пшенице и ячменю, - подлежащим ветеринарному контролю (надзору) (утверждены Решением Комиссии таможенного союза ЕврАзЭС от 18 июня 2010 года № 137) обозначены следующие уровни ПДК для АФЛА – 0,004 мг/кг, охратоксина А – 0,005 мг/кг, Т-2– 0,06 мг/кг, ЗЕН – 0,1 мг/кг, дезоксиниваленола – 1 мг/кг. Проводя сравнение с данными Единых ветеринарных требований, следует отметить, что в большинстве исследованных проб компонентов летнего рациона оленей было зафиксировано превышение уровней ПДК по АФЛА, ОТА, Т-2, ЗЕН и дезоксиниваленолу. Наблюдалось множественное загрязнение микотоксинами (минимум тремя) всех исследованных проб, что, как известно, усиливает их токсическое действие на организм животных
При этом содержание микотоксинов варьировало в значительной степени в зависимости от таксономической принадлежности изучаемого объекта. Наибольшее количество токсичных метаболитов микромицетов было обнаружено в пробах представителей Embryophyta по сравнению с пробами лишайников родов Cladonia и Nephroma. Более высокое содержание микотоксинов по сравнению с лишайниками в чистом виде было обнаружено и в многокомпонентных пробах, повторяющих усредненные летние рационы.
Необходимо отметить, что практически во всех пробах представителей высших растений было обнаружено присутствие таких микотоксинов как Т-2, ЗЕН и дезоксиниваленол, продуцируемых возбудителями фузариоза, поражающего вегетирующие растения, так и АФЛА и ОТА, являющихся метаболитами микромицетов Aspergillus sp., Penicillium sp., считавшимися не адаптированными для роста и размножения на растительных тканях в период вегетации. Однако, АФЛА и ОТА были наименее представленными практически во всех из исследованных проб. Интересен факт того, что присутствие микотоксина ОТА не было выявлено ни в одном из исследованных образцов лишайников.
При этом практически во всех исследованных пробах доминирующими являлись фузариотоксины дезоксиниваленол с уровнем накопления в лишайниках до 150 мкг/кг, пробах Embryophyta – до 33770 мкг/кг, а также зеараленон с содержанием - до 122,7 мкг/кг и 2543 мкг/кг соответственно.
Загрязнение токсинами плесневых грибов образцов лишайников рода Cladonia практически не имело географических различий. Тогда как содержание микотоксинов в пробах таких представителей высших растений как V. uliginosum и многолетних трав варьировало в значительной степени в зависимости от места произрастания. Так, содержание микотоксинов было наименьшим в пробах смеси многолетних трав, отобранных на пастбищах лесотундры в поселении Пушной Мурманской области, по сравнению с образцами, произраставшими на пастбищах тундры в поселке Харп Ямало-Ненецкого АО и поселок Нельмин-Нос Ненецкого АО. В образцах V. uliginosum, произраставших на пастбище тундры поселка Нельмин-Нос Ненецкого АО, присутствие ОТА и Т-2 не было выявлено, тогда как в аналогичных пробах, отобранных на пастбище тундры в поселке Харп Ямало Ненецкого АО, содержание данных микотоксинов составляло 0,0371 и 1,969 мг/кг соответственно. При этом содержание АФЛА, ЗЕН и дезоксиниваленола в пробах V. uliginosum из поселка Нельмин-Нос, было соответственно в 26,1, 5,2, 79,2 раза больше, чем в пробах, отобранных в поселке Харп. Поскольку лето 2017 г. в Ямало-Ненецком, Ненецком АО и Мурманской области характеризовалось сходными метеорологическими параметрами, географические различия в уровнях загрязнения микотоксинами могут быть связаны с различием почв по химическому составу и содержанию питательных веществ. Кроме того, описанные региональные различия могут быть связаны со специфичностью структурных организаций эпифитных бактериальных сообществ высших растений. Широко известно, что многие бактерии, в том числе, эпифитные, могут осуществлять биодеструкцию вторичных метаболитов микромицетов, а также обладать антибиотической активностью в отношении продуцентов данных метаболитов.
Приведенные нами данные, касающиеся содержания микотоксинов в пробах лишайников, совпадают с полученными ранее результатами Буркина и Кононенко (Буркин, Кононенко, 2013). Так, например, авторами было выявлено присутствие в пробах лишайников Cladonia и Nephroma ЗЕН в количестве до 90 и 150 нг/г соответственно.
Вопрос об источниках загрязнения лишайников микотоксинами до настоящего момента не изучен. Одной из гипотез, выдвинутых Толпышевой (Толпышева, 2014), загрязнение лишайников микотоксинами происходит в результате контакта с микромицетами Aspergillus sp., Penicillium sp., Fusarium sp., обнаруживаемыми в почве под лишайниками (Girlanda et al., 1997). Так, например, Гришкан и Теминой (Grishkan, Temina, 2017) было выявлено присутствие микромицета Asр. glaucus на лишайниках, произрастающих на базальтовых камнях. Толпышевой (Толпышева, 2005) было выявлено присутствие значительных количеств микромицетов рода Penicillum в почвах под лишайниками. По мнению Толпышевой (Толпышева, 2014) лишайники способны поглощать микотоксины, содержащиеся в почвенных растворах. Как объясняет автор, лишайники – это пойкологидридные организмы, которые пассивно впитывают влагу. Большинство лишайников произрастает на почве куртинами, в которых наблюдается тесное соприкосновение слоевищ и дольше сохраняется влага. Это активизирует капиллярный подъем воды с растворенными в ней веществами из почвы вверх по лишайниковой куртине.
Вопрос содержания токсичных метаболитов микромицетов в листьях древесных и кустарниковых растений не исследован. В зарубежной литературе существуют лишь отдельные указания, касающиеся обнаружения микотоксинов в листьях древесных культурных растений (Watanabe, 2007). Таким образом, содержание микотоксинов на Sаlix borеalis, Vaccinium uliginosum, Bеtula nаna, B. pendula - компонентах летних пастбищных рационах северных оленей, было изучено нами впервые.
Таким образом, в ходе микотоксикологической оценки компонентов летней кормовой базы (как лишайников, так и высших растений) северного оленя, произрастающих на тундровых и лесотундровых пастбищах из населенных пунктов трех регионов Арктической зоны Российской Федерации, нами обнаружена множественная контаминация исследованных объектов микотоксинами. Продемонстрировано, что проблема загрязнения высших растений микотоксинами стоит значительно острее, чем проблема контаминации лишайников. Загрязнение микотоксинами образцов рода Cladonia практически не имело региональных различий. Тогда как содержание микотоксинов в пробах смеси многолетних трав и V. uliginosum варьировало в значительной степени в зависимости от места произрастания. Выявленные микотоксины обнаружены в концентрациях, которые могут представлять угрозу для здоровья животных.
Изучение эффективности нового комплексного энтеросорбента Заслон2+ в молочном животноводстве
За рубежными исследователями существуют попытки уже разработки значительное биосорбентов, отличительной особенностью которых является иммобилизация на их носителях культур живых микроорганизмов.
Нами разработан (ТУ 9291-028-50932298-2016 от 18.11.2016) комплексный энтеросорбент микотоксинов для крупного рогатого скота Заслон2+ с полифункциональными свойствами, которые обусловлены адсорбционными характеристиками диатомита и биологически активными свойствами эфирных масел тимьяна, лимона, чеснока, шалфея. Кроме того, принципиальным отличием данного энтеросорбента от Заслона-Фито является присутствие в его составе модификаторов - штаммов бактерии Bacillus subtilis 105 КОЕ/г и B. megaterium 105 КОЕ/г. Штаммы бактерий в составе препарата обладают выраженной пробиотической активностью и способностью к биодеструкции микотоксинов до безопасных соединений. Пробиотические свойства штаммов позволяют формировать состав микробиома рубца, усиливая резистенстность макроорганизма к воздействию токсических соединений и подавляя патогенные формы.
Результаты изучения уровня сорбционной ёмкости носителя диатомовой горной породы приведены в разделе 2.3.4.1. У штамма Bacillus subtilis в составе Заслона 2+ при проведении экспериментов in vitro был отмечен высокий уровень биодеструкции Т-2 токсина и ДОН. Для штамма Bacillus megaterium был определен один из самых высоких уровней ИБМmin в отношении микотоксинов ОТА, Т-2 и ДОН. Результаты данного эксперимента подробно описаны в главе 2.3.3.2.
Было проведено секвенирование нуклеотидных последовательностей 16S региона рРНК штаммов бактерий B. subtilis и B. megaterium, идентифицированных ранее с использованием культуральных методов, в составе нового сорбента Заслон2+.
В результате постановки ПЦР были амплифицированы фрагменты гена 16S рРНК протяженностью около 700 п.н.
По результатам секвенирования штамма B. subtilis длина проанализированных нуклеотидных последовательностей 16S региона рРНК составила 541 п.н. (исключая последовательности праймеров):
1 GTGAGATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT GATCTTAGTT GCCAGCATTC 61 AGTTGGGCAC TCTAAGGTGA CTGCCGGTGA CAAACCGGAG GAAGGTGGGG ATGACGTCAA 121 ATCATCATGC CCCTTATGAC CTGGGCTACA CACGTGCTAC AATGGACAGA ACAAAGGGCA 181 GCGAAACCGC GAGGTTAAGC CAATCCCACA AATCTGTTCT CAGTTCGGAT CGCAGTCTGC 241 AACTCGACTG CGTGAAGCTG GAATCGCTAG TAATCGCGGA TCAGCATGCC GCGGTGAATA 359 301 CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACACCACGAG AGTTTGTAAC ACCCGAAGTC 361 GGTGAGGTAA CCTTTTAGGA GCCAGCCGCC GAAGGTGGGA CAGATG
Нуклеотидная последовательность 16S rRNA гена Bacillus subtilis при идентификации в BLAST имела максимальный процент совпадения (98%) с нуклеотидными последовательностями Bacillus subtilis subsp. natto BEST195 DNA, и Bacillus subtilis strain S20511 16S.
По результатам секвенирования штамма B. megaterium длина проанализированных нуклеотидных последовательностей 16S региона рРНК составила 583 п.н. (исключая последовательности праймеров):
AGGATAACGCGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCTGAACTGATTAGAAGCTTGC TTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGG GATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGAT TGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGA GGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACT GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACT CTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCA GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTCAT CCGGAATCATTGGGCGTAAAGCGCGCCCAGGCGGTTTCTTAAGTCTG
Нуклеотидная последовательность 16S rRNA гена Bacillus megaterium при идентификации в BLAST имела максимальный процент совпадения (98%) с нуклеотидными последовательностями B. megaterium strain IHB B 14109, B. megaterium strain IARI-BHI-19, B. megaterium strain HDDMM01.
В АО «ПЗ «Пламя»» были проведены производственные эксперименты по скармливанию Заслона2+ коровам дойного стада.
В результате проведенного ИФА-исследования было показано присутствие в кормах коров значительного количества микотоксинов (АФЛА, Т-2, дезоксиниваленол и др.) с превышением уровня ПДК в некоторых случаях. Так, содержание АФЛА превышало ПДК в кормосмеси, сене и силосе, Т-2 превышал уровень ПДК в комбикорме и кормосмеси, содержание ЗЕН было выше уровня ПДК в силосе. Концентрация дезоксиниваленола была выше уровня ПДК во всех образцах исследованных кормов (таблица 79).
Результаты исследования молочной продуктивности коров и качества молока представлены в таблице 80. Удой молока в группе с применением Заслона2+ был достоверно выше, чем в контроле. Так, суточные удои молока, переведенные на молоко 4% жирности, составляли в контрольной группе 31,5 кг, в опытной – 35 кг (таблица 80). В молоке коров контрольной группы содержание жира составляло в среднем 3,82%, группы с Заслоном2+ - 3,91%, однако разница была не достоверна. Важно, что содержание соматических клеток в молоке в группе с применением энтеросорбента также было достоверно ниже, чем в контроле (р=0,049).
Результаты исследований содержания АФЛАM1 показали достоверное снижение количества микотоксина на 21,0% в молоке коров опытной группы (37,36±1,3 ppt) по отношению к контрольной группе (47,26±1,8 ppt).
В крови коров группы с применением энтеросорбента показано увеличение уровня глюкозы на 18,4%, снижение уровня билирубина на 11,1%, мочевины на 7,2 ммоль/ л, - по сравнению с контролем (таблица 81).