Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и способы предупреждения ее развития 17
1.2 Применение комбинаций антибиотиков при лечении желудочно-кишечных заболеваний телят 18
1.3 Ципрофлоксацин 21
1.4 Апрамицин 25
1.5 Синбиотики 29
1.6 Перспективы использования пробиотиков и синбиотиков в ветеринарии 31
1.7 Заключение по обзору литературы 35
2 Собственные исследования 37
2.1 Методология и методы исследования 37
2.1.1 Объекты исследований 37
2.1.2 Доклинические исследования (ДИ) 38
2.1.3 Клинические испытания (КИ) 44
2.2 Результаты исследований 48
2.2.1 Обоснование эффективного состава синбиотика (метабиотик + БАД на основе биомассы дрожжей) и антибактериального препарата Ципровентор. 48
2.2.1.1. Синбиотик - комплекс метабиотика и БАД на основе биомассы дрожжей
2.2.1.2 Комбинированный антибактериальный препарат Ципровентор 50
2.2.2. Усовершенствование технологии изготовления БАД 56
2.2.3 Технология производства препаратов и изготовление опытных серий 58
2.2.3.1 Метабиотик 58
2.2.3.2 БАД 61
2.2.3.3 Препарат Ципровентор
2.2.4 Доклинические исследования препарата Ципровентор 65
2.2.5 Изучение стабильности препарата Ципровентор 77
2.2.6 Клинические испытания препарата Ципровентор 80
2.2.6.1 Переносимость препарата Ципровентор для телят 80
2.2.6.2 Терапевтическая эффективность препарата Ципровентор, определение оптимальной дозы 82
2.2.6.3 Определение остаточных количеств (ОК) ципрофлоксацина и апрамицина после применения Ципровентора 89
2.2.7 Эффективность комплексного применения синбиотика и препарата Ципровентор при лечении желудочно-кишечных заболеваний телят 97
3 Обсуждение 100
4. Заключение 112
4.1. Выводы 112
4.2 Практические рекомендации и перспективы разработки темы 114
5 Список литературы
- Применение комбинаций антибиотиков при лечении желудочно-кишечных заболеваний телят
- Клинические испытания (КИ)
- Усовершенствование технологии изготовления БАД
- Эффективность комплексного применения синбиотика и препарата Ципровентор при лечении желудочно-кишечных заболеваний телят
Введение к работе
Актуальность темы. Интенсивный характер современного промышленного животноводства обусловлен использованием генетического потенциала продуктивных пород и кроссов, увеличением численности поголовья. Это обстоятельство обусловливает уязвимость организма животного к малейшим изменениям внешних условий и необходимость коррекции его физиологического статуса (Ю. Н. Федоров, 2005; В.А. Антипов и др., 2009; В.А. Гаврилов, 2009; А.Я. Самуйленко и др., 2014, 2015). В настоящее время значительный экономический ущерб наносят желудочно-кишечные заболевания молодняка, что связано со сложной этиологической структурой инфекционных болезней животных, обусловленной, в частности, повышением вирулентности потенциально-патогенных микроорганизмов (С. В. Шабунин, 1999; В.А.Мищенко с сооавт., 2000, 2001; Е.Н. Елисеева, 2011). Традиционным средством лечения животных является использование химиотерапевтических средств, в том числе антибиотиков, терапевтические курсы которых входят в технологию содержания всех видов животных - лечение и профилактика колибактериоза, респираторного микоплазмоза, сальмонеллеза и др. болезней (В.Ф. Ковалев с соавт., 1988; А.В. Голиков с соавт., 1994; Н.Т. Климов с соавт., 2000; И.П.Кондрахин, 2003; Н.С. Егоров, 2004).
Однако длительное и бессистемное применение препаратов приводит, наряду с положительным действием, к появлению ряда побочных эффектов (М.И. Немченко, 1987; И.Х. Рахмонов, 1988; А.Г. Шахов с соавт.,1996; В.И. Дорожкин с соавт., 2004): доминирование условно-патогенных микроорганизмов из-за нарушения микроэкологического равновесия кишечного биотопа; появление резистентных к данному антибиотику штаммов патогенных микроорганизмов; снижение иммунного статуса за счет подавления активности полезной нормофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ); ускорение темпов изменчивости условно-патогенных микроорганизмов, обусловленной усилением генетического обмена и скорости формирования клонов, несущих плазмиды лекарственной устойчивости и нередко включающих гены, детерминирующие адгезивные, цитотоксические и энтеротоксические свойства условно-патогенных бактерий.
Это вызывает необходимость поиска путей и методов совершенствования существующих и изыскания новых эффективных средств их лечения и профилактики.
Одним из путей повышения эффективности антибиотиков является создание комбинированных препаратов, сочетающих лекарственные субстанции одной или разных групп химических веществ. Такие композиции позволяют получать препараты с новыми полезными свойствами, достичь синергического эффекта, сократить затраты на лечение (М.Д. Машковский,1998; С.В.Шабунин, 1999; Т.Н.Ракова, 1999; M.V. Kaminska, 2010).
Другой путь - применение экологически безопасных эффективных препаратов, к которым относятся пробиотики, пребиотики, и их комплексов – синбиотиков (Т.Н. Грязнева, 2005; Б.А. Шендеров, 2005; A.M. Earll, 2006; В.И. Смоленский, 2007; Л.В. Римарева с соавт., 2008; К. Glebocka, 2008; Н.И. Малик с
соавт., 2009; В.В. Субботин, Н.В. Данилевская, 2009; Г.А. Ноздрин с соавт., 2009; И.В. Тихонов, 2010; В.И. Фисинин с соавт., 2011, Е.М. Серба, 2015). Такие инновационные препараты не дают побочных эффектов, присущих антибиотикам (развитие дисбактериозов, возникновение лекарственной резистентности), физиологичны по действию, безвредны для животных, просты в изготовлении, экономичны, технологичны для группового применения.
Степень разработанности проблемы. В связи с широким распространением инфекционных заболеваний животных проблема ликвидации остается актуальной задачей. Перспективным является создание комбинированных антибактериальных препаратов с широким спектром антимикробной активности и высокой эффективностью (С.В. Енгашев с соавт., 2014), а также пробиотиков на основе микробных метаболитов - метабиотики (М.Ю. Волков с соавт., 2007; П.А. Красочко с соавт., 2009; Ю.В. Сорокина, 2012).
Во ВНИТИБП накоплен значительный опыт разработки синбиотических препаратов и технологии их производства для птицеводства и животноводства (А.Я. Самуйленко с соавт., 2010, 2016; Л.А. Неминущая с соавт., 2012, 2014). Изучена эффективность их применения, обусловленная защитой животных при стрессовых ситуациях (вакцинация, переход на другой вид корма и др.), повышением продуктивности, усвояемости кормов, нормализацией микрофлоры ЖКТ, отказом от использования кормовых антибиотиков. Направление, связанное с исследованием положительной роли инновационных метабиотиков и синбиотиков в снижении последствий антибиотикотерапии, является актуальным для АПК России.
В связи с вышеизложенным представляются актуальными исследования, направленные на разработку новых синбиотиков и антибактериальных препаратов, технологии их производства и схем комплексного применения.
Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в разработке состава нового синбиотика и антибактериального препарата, технологии их производства и оценке эффективности совместного применения в животноводстве телятам.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:
-
Научно обосновать состав нового синбиотика (метабиотик на основе смеси культуральных жидкостей лактобактерий и бактерий рода Bacillus и биологически активная добавка на основе биомассы дрожжей-сахаромицетов) и антибактериального препарата ципровентор (на основе комбинации ципрофлоксацина и апрамицина).
-
Усовершенствовать технологию изготовления биологически активной добавки за счет интенсификации процесса культивирования биомассы дрожжей-сахаромицетов с помощью биокатализаторатора (культуральной жидкости высшего гриба Fusarium sambucinum шт. MKF 2001-3).
-
Разработать технологическую схему производства лабораторных образцов препаратов, изготовить опытные серии препаратов.
-
Провести доклинические исследования (ДИ) препарата ципровентор: исследовать фармако-токсикологические свойства и стабильность; установить срок годности; определить показатели качества препарата.
-
В производственных условиях на молодняке крупного рогатого скота провести клинические исследования (КИ) препарата ципровентор: определить переносимость препарата, терапевтическую эффективность при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях телят, установить оптимальную дозу и определить остаточные количества препарата у животных после его применения; разработать нормативную документацию (НД) на препарат.
-
В производственных условиях оценить эффективность совместного применения синбиотика и препарата ципровентор при лечении желудочно-кишечных заболеваний телят.
Научная новизна работы. Дано научное обоснование разработки нового комбинированнго антибактериального препарата ципровентор на основе ципрофлоксацина и апрамицина. Экспериментально установлено, что сочетание этих препаратов в соотношении 1:4 приводит к уменьшению величин их минимально подавляющей концентрации по сравнению с минимально подавляющей концентрацией исходных антибиотиков, что обуславливает их синергетический эффект и позволяет преодолеть имеющуюся антибиотикорезистентность к ципрофлоксацину. Изучены физико-химические и фармако-токсикологические свойства препарата, показана его эффективность при терапии желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях телят.
Обоснован состав нового (синбиотика: метабиотик + биологически активная добавка БАД), усовершенствована технология изготовления. Установлена эффективность применения нового антибактериального препарата в комплексе с синбиотиком для лечения желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях телят. Установлено, что применение синбиотика снижает негативные последствия антибиотикотерапии.
Новизна исследований подтверждена Патентом РФ №2570389
«Антибактериальная фармацевтическая композиция для лечения
сельскохозяйственных животных и птиц» и заявкой №2016102653/15(003823) от 27.01.2016 на Патент «Способ лечения болезней бактериальной этиологии у сельскохозяйственных животных и птиц».
Теоретическая и практическая значимость исследований. Разработан, стандартизирован и предложен для применения в животноводстве новый комбинированный антибактериальный препарат ципровентор (регистрационное удостоверение Россельхознадзора РФ № 77-3-12.15-2909№ПВР-3-12.15/03236).
На опытном производстве ВНИТИБП освоена технология изготовления препаратов, входящих в состав синбиотика.
В производственных условиях установлена эффективность применения синбиотика в комплексе с препаратом ципровентор при лечении желудочно-кишечных и респираторных болезней телят, повышения резистентности и продуктивности животных.
Методология и методы исследований. Методология включает стандартные
для данной области знаний процедуры с использованием различных материалов и
естественно-восприимчивых животных. Объекты исследований –
зарегистрированные во Всероссийской коллекции промышленных микроогрганизмов (ВКПМ) штаммы пробиотических микроорганизмов (L. рlantarum, штамм 8РА3, ВКПМ № В-11007 и B. subtilis. штамм М-8, ВКПМ № B-
1948), дрожжей (Saccharomyces cerevisiae diastaticus, штамм ВКПМ–-1218) и препараты на их основе; высшего гриба (F. sambucinum, штамм MKF 2001-3), используемого в качестве биокатализатора при культивировании дрожжей-сахаромицетов; антибактериальные препараты: ципрофлоксацин (группа фторхинолонов), апрамицин (группа аминогликозидов) и их комбинации. Согласно современным требованиям к разработке и внедрению новых лекарственных средств, включенным в ФЗ № 61 "Об обращении лекарственных средств" от 12.04.2010 (действующая редакция, 2016; реализована схема доклинических (ДИ) и клинических (КИ) исследований с использованием стандартных критериев и методических подходов.
ДИ ципровентора проводили на лабораторных животных в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического Государственного комитета «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005) по показателям: острая токсичность (на белых мышах обоего пола и белых крысах); кумулятивные свойства; влияние на токсическую функцию печени (белые мыши); местно-раздражающее действие (морские свинки и крысы); аллергенные и иммунотоксические свойства (мыши линии СВА); переносимость и субхроническую токсичность (белые беспородные крысы-самцы); антимикробная активность (макрометод серийных разведений в бульоне); стабильность антибактериального препарата определяли методом «ускоренного старения».
В ДИ синбиотика определяли: химический состав КЖ и БАД (физико-химические методы); безопасность (на белых нелинейных мышах); антагонистическую активность (АА) метабиотика и количество жизнеспособных микроорганизмов (высев на селективные питательные среды).
КИ препарата ципровентор проводили в племзаводе ООО «Авангард» Рязанского района Рязанской области на телятах голштинской породы. Переносимость и субхроническую токсичность оценивали на здоровых телятах (клинические наблюдения, гематологические и биохимические показатели крови). Эффективность ципровентора - на телятах с симптомами катарального воспаления верхних дыхательных путей, бронхопневмонии и энтероколита (показатели -общее состояние, двигательная активность, аппетит, симптомы первичного заболевания, температура тела, частота пульса, дыхания и руминации). Динамику выведения остаточных количеств ципрофлоксацина и апрамицина в образцах органов и тканей (печень, почки, мышцы и жир) - по результатам их содержания (высокоэффективная жидкостная хроматография с флуоресценцией) в сравнении максимально допустимым уровнем (МДУ), установленным Техническим Регламентом Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034/2013).
Эффективность сочетанного применения ципровентора и синбиотика определяли на базе ОАО «Возрождение» Витебского района Витебской области на телятах черно-пестрой породы с симптомами катарального воспаления верхних дыхательных путей, бронхопневмонии и энтероколита по симптомам первичного
заболевания, клиническим показателям, срокам выздоровления, восстановления динамики привесов, показателям крови.
Основные положения работы, выносимые на защиту:
- научное обоснование применения в ветеринарии синбиотика (метабиотик на
основе смеси культуральных жидкостей лактобактерий и бактерий рода Bacillus и
биологически активная добавка на основе биомассы дрожжей-сахаромицетов) и
антибактериального препарата ципровентор (на основе комбинации
ципрофлоксацина и апрамицина);
- технологические схемы производства препаратов, показатели качества и
методы их контроля;
- результаты ДИ и КИ препарата ципровентор;
- терапевтическая эффективность сочетанного применения синбиотика и
ципровентора при лечении желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях
телят.
Степень достоверности и апробация результатов. Полученные результаты экспериментальных исследований и производственных испытаний, выводы и рекомендации не противоречат современным теоретическим представлениям по решению проблемы терапии желудочно-кишечных и респираторных болезней телят со сложной этиологической структурой и основаны на общепринятых закономерностях.
Статистическую обработку результатов (с числом повторов 3) проводили методами Кербера в модификации Ашмарина, достоверность результатов КИ (количество животных в опыте не менее 7) оценивали по критерию Стьюдента (t-критерий) с использованием стандартных программ MATHCad-2001.
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: в виде отчетов по темам госзаданий на Ученом совете и методической комиссии ВНИТИБП (20132016гг.); на Международных конференциях 2013-2016 гг. (Москва, Екатеринбург, Щелково, Душанбе, Саратов).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 1 патент РФ на изобретение.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Результаты исследований соответствуют п.п 2,3,11 паспорта специальности 03.01.06 и п.п. 2, 3, 9 паспорта специальности 06.02.02.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, предложений для практики, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 48 таблицами и 11 рисунками. Список использованной литературы содержит 260 источников, в том числе - 53 иностранных автора.
Личный вклад соискателя заключается в формулировании основных положений диссертации, постановке целей и задач исследований, планировании и реализации эксперимента, обобщении результатов и использовании их в практике. Диссертация является совокупностью исследований, проведенных автором лично и при его непосредственном участии в качестве ответственного исполнителя.
Благодарности. Диссертант выражает благодарность директору ВНИТИБП, академику РАН А.Я. Самуйленко; научному консультанту академику РАН, доктору биологических наук, профессору В.И. Дорожкину; научному руководителю доктору биологических наук, доценту Л.А. Неминущей; а также за консультативную и практическую помощь член-корреспонденту РАН, доктору ветеринарных наук, профессору С.В. Енгашеву; доктору ветеринарных наук, профессору Э.Х. Даугалиевой; доктору медицинских наук, профессору В.В. Михайлову; кандидату биологических наук Г.И. Павленко; заведующему лабораторией микробиологии ООО «АВЗ С-П» И.В. Ульянову; доктору биологических наук, профессору Г.И. Воробьевой; доктору биологических наук, профессору, член-корреспонденту РАН Ю.Н. Федорову; доктору биологических наук, доценту Т.А. Скотниковой; доктору биологических наук, профессору В.И. Клюкиной; доктору биологических наук, профессору П.А. Красочко и другим.
Применение комбинаций антибиотиков при лечении желудочно-кишечных заболеваний телят
Комбинированная антибиотикотерапия за последние годы стала основным видом терапии при лечении большинства инфекций бактериального характера. Поэтому важно изучить принципы, согласно которым происходит применение комбинаций антибактериальных препаратов, которые показаны к применению с целью получения клинических и экспериментальных результатов.
Обоснование целесообразности одновременного применения нескольких антибактериальных препаратов строится на основании следующих факторов: 1) тяжелое состояние в связи с инфекцией, из-за чего возникает необходимость приступить к антибактериальной терапии до того, как был поставлен бактериологический диагноз; 2) полимикробная этиология инфекции, где различные компоненты микробной ассоциации имеют разную степень чувствительности к антибиотикам; 4) профилактика или необходимость уменьшения подобного и токсического действия применяемых препаратов; 5) предупреждение или замедление развития резистентности возбудителя; 6) возможность увеличения эффекта проводимой терапии в расчете на то, что скажется синергидное действие различных препаратов [22, 35, 86, 107, 110, 170; 176, 180].
Первые из представленных доводов часто приводятся с тем, чтобы расширить спектр действия препаратов антибактериального типа. В этих случаях необходимость применения комбинированной терапии ни в коем случае не оспаривается.
Желудочно-кишечные заболевания в полной мере соответствуют этому описанию. При этом невозможно охватить сразу всех возможных возбудителей посредством использования нескольких препаратов. 100%-ного воздействия на возбудителей в этом случае добиться не удастся, да и с экономической точки зрения такое действие совершенно не оправдано.
Довод по поводу того, как можно предупредить или уменьшить развитие токсического действия препарата, связан с возможностью уменьшения дозировки с целью его совместного применения с другим препаратом. Однако во многих случаях при использовании препаратов в субтерапевтических дозах есть опасность появления резистентной группы организмов. Поэтому чаще всего наблюдается сочетание препаратов в полной терапевтической дозировке.
Один из примеров по снижению дозозависимой токсичности в условиях сочетания разных препаратов является применение 5-флуцитозина с амфотерици-ном В; причем она позволяет снизить дозировку другого препарата, обладающего токсичностью.
Важный довод в пользу применения терапии комбинированного типа – это предупреждение формирования устойчивости возбудителя в том случае, если проводится лечение. При этом производится снижения in vitro в 8–10 раз для выявления резистентных мутантных клеток путем использования комбинации антибиотиком, если проводить сравнение с селективным действием одного отдельно взятого препарата. В наибольшей степени этом относится к тем микроорганизмам, для которых характерна быстроразвивающаяся резистентность (стафилококки, микробактерии), а также к антибиотикам, имеющих высокую квоту по резистентности (ри-фампицин, фузидин). Одним из примеров второго случая можно считать замедление, с которой развивается резистентность возбудителя туберкулеза, при этом наблюдается использование сразу нескольких препаратов против туберкулеза.
При этом отмечается значительное усиление антибактериального эффекта в расчете на то, что будет происходить усиления действия антибиотиков с учетом их совместного применение, что является важным основанием для того, чтобы применить комбинированную антибиотикотерапию [86, 110].
Существует несколько вариантов для взаимодействия антибиотиков в определенном сочетании. Индифференцией принято называть независимость эффекта любого из компонентов при их определенном сочетании; аддитивный эффект (суммация) – это комбинированный эффект двух препаратов, эквивалентный сумме раздельных эффектов каждого из них; синергизм (воздействие потенцированного характера) – это комбинированный эффект для двух препаратов, превышающий сумму эффектов каждого из них; антагонизм – комбинированный эффект для двух препаратов, который заметно ниже, чем эффект каждого препарата в отдельности. Синергизм или антагонистический эффект сочетаний препаратов против микробов связан с отражением их взаимодействия на уровне молекул, причем он определяется особенности механизма, при помощи которого происходит взаимодействие.
Установление синергизма или антагонизма in vitro – это далеко не гарантия их проявления в клинических условиях. Эффекты, полученные in vitro, благодаря особенностям фармакокинетики при сочетаниях антибактериальных компонентов, могут существенно отличаться от наблюдаемых у животных.
Основные принципы комбинирования антибиотиков были сформулированы еще в 50-е годы [91]. В дальнейшем они множество раз уточнялись и корректировалась при помощи раскрытия и детализация механизмов действия для антибиотиков с учетом их антибактериального воздействия в широком спектре, а также свойств возбудителей, фармакокинетическим свойствам и др. [86; 110].
Сегодня известны несколько базовых механизмов взаимодействия препаратов антибактериального назначения, приводящих к появлению синергетического эффекта [88, 115] повышение для одного из препаратов проницаемости клеточной стенки бактерии в отношении другого препарата; подавление одним препаратом процесса образования бактериями ферментов, которые способны разрушить действие другого препарата или привести к угнетению процесса образования ферментов в результате конкурентной или не конкурентной ингибиции; двойное блокирование каждым из компонентов сочетания различных этапов метаболизма микробной клетки и возникновение постепенного подавления синтеза клеточной стенки бактерии.
В ряде случаев действие препарата синергидного или аддитивного характера, которое было получено in vitro, не проявляется в организме животного, причем причиной для этого является особенности фармакокинетики для каждого компонента и их последующее взаимодействие. Получается, что компоненты препарата следует подбирать таким образом, чтобы для них были характерны примерно равные фармакокинетические параметры и чтобы в интервалы между временем, когда был введен препарат, для очага инфекции обеспечивалась бактерио-статическая или бактерицидная концентрация [76, 77]. К примеру, комбинация окситетрациклина с канамицином оказывает более выраженное лечебное действие у животных при пероральном применении в соотношении 3:1, а при парентеральном - 2:1 [80].
Клинические испытания (КИ)
Для характеристики химического состава КЖ и БАД в аналитической лаборатории ГосНИИСинтезбелок определяли: массовую долю сухих веществ (по ГОСТ 28561-90); массовую долю золы (по ГОСТ 12572-67); массовую долю ли-пидов (по ГОСТ 13496.15-97); общий белок (по ГОСТ 26889-86); общее содержание углеводов (по ГОСТ 26176-91); макро- и микроэлементы методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии (на приборе ААS-1N); органические кислоты методом хроматографии (на хроматографе Хьюлетт - Паккард, колонка - поли-сорб); витамины (флюорометрическим методом по ГОСТ 29138-91, 19139-91, 29140-91); состав и содержание аминокислот (на аминокислотном анализаторе Биотроник LC-7000).
Показатели безопасности и качества препаратов определяли: безопасность -на белых нелинейных мышах; антагонистическую активность пробиотика - по величине задержки роста патогенных микроорганизмов в опытах in vitro (Биргер М.О., 1982); количество жизнеспособных бактерий - высевом на среды MRS-4 и сусло-агар (по ГОСТ Р 54065-2010); контроль готовых препаратов - в соответствии со стандартами организации (СТО) на препараты, входящие в состав син-биотика.
ДИ Ципровентора проводили на лабораторных животных в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического Государственного комитета «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [148] по показателям: острая токсичность; кумулятивные свойства; влияние на токсическую функцию печени; местно-раздражающее действие; аллергенные и иммунотоксические свойства; переносимость и субхроническая токсичность; антимикробная активность; физико-химические свойства; стабильность.
Фармако-токсикологические свойства препарата изучали в опытах на белых крысах и белых мышах. Исходный вес лабораторных животных колебался в пределах: для крыс – 180-190 г; для мышей – 18-20 г. В опыт брали клинически здоровых животных, которые предварительно находились на пятнадцатидневном карантине. Статистические группы состояли из 6 – 10 животных.
Определение параметров острой токсичности исследуемого препарата проводили на белых мышей обоего пола массой 19-21 г и белых крысах массой 200-240 г. Перед опытом животных в течение 6 часов выдерживали на голодной диете, после чего взвешивали и распределяли по группам.
Для установления параметров острой токсичности препарат в виде суспензии насильно вводился белым мышам и белым крысам в желудок с помощью металлического зонда. Было испытано 4 дозы: 3, 6, 8 и 10 г/кг массы тела. Каждую дозу испытывали на 6 животных, контрольным животным вводили воду в том же объеме. За животными вели наблюдение в течение 14 суток после введения, отмечая сроки гибели или выздоровления животных. В первые сутки наблюдение вели непрерывно. Учитывали общее состояние животных, сохранение двигательных функций, аппетита, состояние шерстного покрова, дыхания, реакцию на внешние раздражители.
Регистрировали сроки развития интоксикации и гибели мышей, проводили макроскопическое исследование внутренних органов и тканей после введения препарата (степень кровенаполнения, наличие кровоизлияний, изъязвлений слизистой оболочек и др.). Оценку степени опасности лекарственного препарата проводили согласно ГОСТ 12.1.007-76.
Изучение субхронической токсичности препарата проводили на 18 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 140-150 г. Животным в желудок ежедневно в течение 2-х месяцев через желудочный зонд вводили препарат в виде суспензии на крахмальном клейстере в дозах 1/10 и 1/100 от ЛД50, что соответствовало 1г/кг и 0,1 г/кг по действующему веществу. Каждая подопытная и контрольная группы состояли из 8 животных. Животным контрольной группы, при тех же условиях содержания и кормления, вводили равный объем крахмального клейстера.
Кумулятивные свойства препарата исследовали методом, принятым для нетоксичных соединений [103], который предусматривает введение препарата в условиях повторного 2-х недельного эксперимента в дозе, составляющей 1/5 от максимально-переносимой дозы, т.е. от 10 г/кг массы тела. Таким образом, ежедневно животные получали дозу 2 г/кг. Препарат вводился в желудок белых крыс в постоянной дозе, составляющей 1/5 от максимально-введённой дозы (10 г/кг). Ежедневно вводимая доза составляла 2,0 г/кг (0,8 мл 50% суспензии на 200 г м.т.), с постоянной корректировкой дозы в зависимости от массы тела животных. Длительность эксперимента 19 дней.
Для выявления токсического действия лекарственных веществ использовали гексеналовую пробу, основанную на определении длительности гексеналового сна и провели опыт на белых мышах. Длительность гексеналового сна обусловлена, в первую очередь, функцией печени и зависит от времени, необходимого для концентрации гексенала в крови ниже уровня, вызывающего наркоз. При поражении печени какими-либо токсическими веществами обезвреживание гексенала замедляется, что приводит к увеличению длительности сна.
Определение функционального состояния печени у белых мышей при оральном введении препарата Ципровентора раствора проводили на 90 нелинейных белых мышах массой 18 – 20 г, которых разделили на 6 групп по 10 мышей в каждой: 3 группы – контрольные, 6 групп – опытные. Контрольным животным перорально вводили физиологический раствор в дозе 1 мл на голову. Половине подопытных животных вводили Ципровентор перорально в дозе равной ЛД50 10г/кг массы тела. Ципровентор мышам вводили натощак и через 1, 3 и 6 часов вводили гексенал внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг массы тела. Продолжительность гексеналового наркоза учитывали с момента принятия мышами бокового положения до первых попыток его изменить.
Усовершенствование технологии изготовления БАД
Реакция дегрануляции тучных клеток. Реакцию дегрануляции тучных клеток (таблица 27) провели на 6 мышах линии СВА, которым задавали Ципровентор разведенный в крахмальном клейстере 1:10 в дозе 2,5 г/кг. Через 2 дня мышей убили, собрали сыворотку крови. Тучные клетки выделяли из перитонеальной жидкости 2 крыс-самцов массой 180-200 г после внутрибрюшинного введения физраствора с гепарином в количестве 10 мл.
Затем на предметные стекла, покрытые 0,3% нейтральротом на абсолютном спирте наносили по 1 капле тучных клеток, сыворотки крови от подопытных мышей и препарата в разведении 1:10. В контрольную пробу брали тучные клетки и сыворотку крови от тех же мышей (по 1 капле) и по разнице процента дегрануля-ции тучных клеток в опыте и в контроле судили о сенсибилизации организма. Для контроля достоверности полученных данных подсчитывали процент дегрануля-ции тучных клеток в перитонеальной жидкости (10%) и с комплементом (8%).
Иммунотоксические свойства препарата Ципровентор. Под иммуноток-сическим действием традиционно понимают модифицирующее влияние ксенобиотиков и лекарственных средств на иммуногенез, включая иммуносупрессию и гиперстимуляцию иммунитета, способное привести к снижению резистентности организма к инфекции, повышению риска онкологических заболеваний, развитию аутоиммунной патологии и аллергизации организма.
Основная задача доклинического изучения влияния потенциальных лекарственных средств на иммунную систему состоит в том, чтобы в эксперименте на животных доказать или исключить возможность развития иммунотоксического действия, вызванного фармакологическим средством или его метаболитами.
Иммунотоксические свойства препарата изучены в 2 опытах на 40 мышах линии СВА массой 18-20 г.
Оценку клеточного иммунитета проводили с использованием реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при введении в качестве антигенов эритроцитов барана (таблица 28).
На следующие сутки после накожных аппликаций препарата мышей первой группы иммунизировали подкожно в межлопаточную область 10% суспензию эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 0,5 мл. Животные 2-й группы (10 гол) служили контролем, им вводили только 10% суспензию ЭБ. Через 5 дней после окончания введения препарата всем животным вводили разрешающую дозу 2%-ю взвесь эритроцитов барана в количестве 0,02 мл в правую лапку, а в левую стерильный физиологический раствор в дозе 0,02 мл. Через 24 часа животных умерщвляли, отрезали лапки на уровне голеностопного сустава и взвешивали на аналитических весах маркиDV 114C (OHAUS) для учета индекса реакции по формуле: Р Мопыт-Мконтроль И = 100%, где Мконтроль ИР - индекс реакции; Мопыт _ масса опытной лапы; Мконтроль - масса контрольной лапы. Таблица 28 – Результаты реакции гиперчувствительности замедленного типа. Препарат Доза ИР Ципровентор 6 мг/кг 18,2±1,2 Контроль 10% суспензия ЭБ 1,4±1,2 Примечание. - достоверно по отношению к контролю (Р 0,05). Оценку влияния препарата на гуморальный иммунный ответ изучали путем определения числа антителообразующих клеток (АОК) после иммунизации эритроцитами барана мышей.
Для определения АОК в селезенке мышам перорально вводили в терапевтической дозе препарат одновременно с внутрибрюшинной иммунизацией их эритроцитами барана (ЭБ) – 2 % взвесь в объеме 0,5 мл/мышь. На 4-е сутки извлекли селезенки, получали лимфоциты и проводили исследование. Вокруг каждой анти-телообразующей клетки возникает зона гемолиза, которая видна на агаре в виде прозрачной точки. Увеличение числа продуцентов антител в селезенке мышей, которым введен препарат, свидетельствует о стимулирующем действии препарата на антителообразование, снижение их числа по сравнению с контролем (ЭБ) - об его угнетении. Индекс стимуляции (ИС) определяли как отношение числа АОК в опыте к числу АОК контроле (введение только ЭБ). ИС 1,5 и выше -стимулятор, ниже 0,7 - иммунодепрессант. Результаты этого опыта представлены в таблице 29.
Судя по полученным данным, введение препарата приводит к активизации трансформации В-лимфоцитов в АОК по сравнению с контролем, что выражалось в статистически достоверном увеличении количества АОК в селезенке. ИС увеличился в 3,8 раза, что говорит о стимулирующем воздействии препарата на антите-логенез, т.е. Ципровентор усиливает гуморальный иммунный ответ у животных. Увеличение содержания АОК предшественников В-лимфоцитов, связано с активизацией функциональной активности Т-лимфоцитов.
Установлено, что препарат в терапевтической дозе вызывают индукцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей, т.е. местную воспалительную реакцию, которая обусловлена инфильтрацией клетками воспалительного очага, а не сосудистой реакцией. У мышей это полиморфноядерные лейкоциты, моно-нуклеары, которые через несколько дней превращаются в тканевые макрофаги. Введение препарата вызывало сдвиг ИС на 1,82 %, что достоверно отличалось от показателей контрольных животных – 1,40 %. Усиление реакции гиперчувствительности замедленного типа пол влиянием препарата Ципровентор указывает на способность препарата стимулировать продукцию лимфокинов - медиаторов клеточного иммунитета. Интенсивность синтеза и секреции лимфоцитами факторов клеточного иммунитета соответствует степени выраженности воспалительной реакции в месте введения разрешающей дозы антигена (ЭБ) и характеризует активность популяции хелперных клеток, ответственных за проявление реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Переносимость и субхроническую токсичность определяли на 18 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 140-150 г. Животным в желудок ежедневно в течение 20 дней через желудочный зонд вводили препарат в виде суспензии на крахмальном клейстере в дозах 1/10 и 1/100 от ЛД5о, что соответствовало 1г/кг и 0,1 г/кг по действующему веществу. Каждая подопытная и контрольная группы состояли из 8 животных. Животным контрольной группы, при тех же условиях содержания и кормления, вводили равный объем крахмального клейстера.
Признаков токсикоза и гибели животных, не наблюдали, что дает основание говорить об отсутствии у препарата в указанных дозах эффекта кумуляции по токсическому признаку.
Обследование животных, получавших в течение 20 дней Ципровентор в дозе 1 г/кг и 0,1 г/кг по действующему веществу с использованием клинико-биохимических методов, не показало статистически значимых отличий опытных и контрольных групп. Анализы проводили 30-й день опыта после декапитации животных. Препарат не влиял на прирост массы тела животных (таблица 30).
Эффективность комплексного применения синбиотика и препарата Ципровентор при лечении желудочно-кишечных заболеваний телят
Одним из основных направлений биотехнологии в сельском хозяйстве является разработка высокоэффективных препаратов для лечения и профилактики болезней ЖКТ, технологических процессов их изготовления и способов применения с помощью микробиологических, биохимических и молекулярно-генетических методов [147, 161, 164, 225, 226, 237, 238, 242].
В настоящее время ведущую роль в обеспечении эффективности современного промышленного животноводства и птицеводства играют две группы факторов: технология содержания животных и состояние окружающей среды. Эта роль особенно велика, если учитывать интенсивный характер современного сельскохозяйственного производства, обусловленный использованием максимально продуктивных пород и кроссов, наращиванием поголовья и постоянной модернизацией технологии содержания. В таких условиях организм животного становится очень уязвимым к малейшим изменениям внешних условий и нуждается в коррекции его физиологического состояния (в том числе с помощью биопрепаратов и биологически активных веществ) [7, 32, 60].
Следует иметь в виду, что высокопродуктивные животные и птица характеризуются повышенной чувствительностью к стрессам и нарушениям в режимах кормления и содержания, низкой иммунокомпетентностью, а увеличение поголовья приводит к значительному усилению техногенной и микробиологической нагрузки на организм животного. Интенсивные технологии выращивания и большая концентрация поголовья являются основными причинами снижения жизнеспособности, увеличения заболеваемости и летальности молодняка.
Среди причин отхода молодняка, основное место занимают болезни, связанные с нарушением функций желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). На предприятиях с высокой концентрацией поголовья они являются основной причиной гибели молодняка. Сдвиги в количественном и качественном составе нормальной и условно-патогенной микрофлоры приводят к дисбактериозу, снижению усвояемости питательных веществ корма и, как следствие, к диарее и падежу [46].
Интенсивный характер современного промышленного животноводства обусловлен использованием максимально продуктивных пород и кроссов, наращиванием численности поголовья. Это приводит к тому, что организм животного становится уязвимым к малейшим изменениям внешних условий и нуждается в коррекции его физиологического статуса [7, 14, 32]. В настоящее время в связи с появлением инфекций сложной этиологии, обусловленной повышением вирулентности условно-патогенных микроорганизмов, в лечении и профилактике болезней животных возрастает значение фармакопрофилактики [54, 128, 129, 185, 186]. Огромный экономический ущерб, причиняемый животноводческим хозяйствам желудочно-кишечными заболеваниями, вызывает необходимость поиска путей и методов совершенствования и изыскания новых эффективных средств их лечения и профилактики.
В комплексе мероприятий по борьбе с желудочно-кишечными болезнями бактериальной этиологии у молодняка сельскохозяйственных животных широкое применение нашли такие химиотерапевтические средства, как сульфаниламиды, антибиотики, нитрофураны и др. [41, 79, 86].
Терапевтические курсы антибиотиков (лечение и профилактика колибакте-риоза, респираторного микоплазмоза, сальмонеллеза, диареи и др. болезней) входят в технологию содержания всех видов животных. Однако длительное и бессистемное их применение привело, наряду с положительным действием, к появлению ряда побочных эффектов [115, 144, 188, 189, 190, 191]: доминирование условно-патогенных микробов из-за нарушения микроэкологического равновесия кишечного биотопа; появление резистентных к данному антибиотику штаммов патогенных микроорганизмов; снижение иммунного статуса за счет уничтожения вместе с патогенной микрофлорой полезной нормофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ); ускорение темпов изменчивости условно-патогенных микроорганизмов, обусловленной усилением генетического обмена и скорости формирования клонов, несущих плазмиды лекарственной устойчивости и нередко включающих гены, детерминирующие адгезивные, цитотоксические и энтеротоксиче-ские свойства условно-патогенных бактерий.
Одним из путей повышения эффективности антибиотиков является создание комбинированных препаратов, сочетающих несколько лекарственных субстанций одной или разных групп химических веществ. Такие композиции позволяют получать препараты с новыми полезными свойствами (например, создание депо действующих веществ в месте введения препарата при использовании про-лонгатора), достичь синергического эффекта, сократить затраты на лечение [95, 185, 188].
АБ применяют в животноводстве и птицеводстве как для лечения и профилактики болезней (колибактериоза, респираторного микоплазмоза, сальмонеллеза, диарреи). Терапевтические курсы АБ входят в технологию содержания всех видов сельскохозяйственных животных [53, 54].
От использования АБ в лечебных целях отказаться в условиях промышленного животноводства и птицеводства невозможно, хотя их широкое использование также влияет на появление резистентных к ним возбудителей (в том числе и опасных для человека), особенно когда их применение становится результатом плохого менеджмента, несбалансированного кормления и низкого гигиенического статуса хозяйства.
Наиболее приемлемый и целесообразный метод, повышающий эффективность химиотерапии бактериальных инфекций и замедляющий развитие резистентности у микроорганизмов, — рациональное применение сочетаний антимикробных препаратов. При этом решают следующие задачи:
1. Максимальное расширение спектра антимикробного действия при тяжелом течении инфекции, требующем немедленного начала лечения до установления бактериологического диагноза, или при смешанной инфекции, когда возбудители микробной ассоциации имеют разную чувствительность к антибактериальным препаратам.
2. Предупреждение развития токсического действия за счет достижения быстрого и более полного эффекта при одновременном введении двух или нескольких препаратов в меньших, чем обычные, курсовых дозах.