Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1 Значение ультрамикроэлемента селена в жизнедеятельности живых организмов 14
1.2 Получение биодоступного селена при помощи микроорганизмов и влияние селенсодержащих соединений на микроорганизмы 29
1.3 Синтез и биологические свойства наночастиц селена 35
1.4 Способы синтеза и свойства используемых селенорганических соединений 45
Глава 2. Материалы и методы 50
2.1 Физико-химические методы анализа, используемые в работе 50
2.2 Способы получения и физико-химические свойства селенорганических соединений 51
2.2.1 Способ получения и физико-химические свойства диацетофенонил-селенида 51
2.2.2 Синтез 4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена 53
2.2.3 Получение 9-фенил-симм. октагидроселеноксантенов 54
2.2.3.1 Синтез 4–фенил-2,3-тетраметилен[3.3.1]бициклононан-3–ол-9-она 55
2.2.3.2 Синтез 9-фенил-симм. октагидроселеноксантена из 4-фенил-2,3 тетраметилен[3.3.1]бициклононан-3-ол-9-она 56
2.2.4 Синтез перхлоратов 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6–дигидроселе нохромилия на основе 2-арил-4-фенил-5,6-дигидро-4Н-бензо[h] селено хроменов 56
2.2.5 Синтез 4-(4-парабромфенил)-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-селено-хромена 57
2.2.6 Синтез (3-(4-бромфенил)-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]селенофен-2-ил) (фенил) метанона и его производных 58
2.2.7 Синтез 2,4-дифенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10b-гексагидро-2Н селенохромена 58
2.3 Исследование влияния Saccharomyces cerevisiaе на диацетофенонилсе ленид 62
2.3.1 Приготовление водно-спиртового раствора ДАФС-25 с концентра-цией 16 мг/мл 62
2.3.2 Методика переработки ДАФС-25 под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде RPMI-1640 63
2.3.3 Методика переработки ДАФС-25 под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде молока 63
2.3.4 Методика переработки ДАФС-25 под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде виноградного сока 64
2.3.5 Методика переработки ДАФС-25 под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде раствора глюкозы 64
2.4 Исследование влияния Saccharomyces cerevisiaе на 4-дифенил-7,8 бензо-5,6-дигидроселенохромен 65
2.4.1 Приготовление раствора 4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидросе ленохромена с концентрацией 16 мг/мл 65
2.4.2 Методика переработки 4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидро-селе-нохромена под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде RPMI-1640 65
2.4.3 Методика переработки 4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселе-нохромена под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде молока 65
2.5 Исследование влияния Saccharomyces cerevisiaе на 9-фенил-симм. ок тагидроселеноксантен 66
2.5.1 Приготовление водно-спиртового раствора 9-фенил-симм. октагид роселеноксантена с концентрацией 16 мг/мл 66
2.5.2 Методика переработки 9–фенил-симм. октагидроселеноксантена под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде RPMI-1640 66
2.5.3 Методика переработки 9-фенил-симм. октагидроселеноксантена под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде молока 67
2.6 Исследование влияние Saccharomyces cerevisiaе на 2,4-диарил-7,8 бензо-5,6-дигидроселенохромилия на основе 2-арил-4-фенил-5,6-дигидро 4Н-бензо[h]селенохроменов 67
2.6.1 Приготовление раствора 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохро милия на основе 2-арил-4-фенил-5,6-дигидро-4Н-бензо[h]селенохроменов с концентрацией 16 мг/мл 67
2.6.2 Методика переработки 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидроселено-хромилия на основе 2-арил-4-фенил-5,6-дигидро-4Н-бензо [h] селенохро-менов под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде RPMI-1640 68
2.6.3 Методика переработки 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидроселено-хромилия на основе 2-арил-4-фенил-5,6-дигидро-4Н-бензо [h]селено-хроменов под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде молока 68
2.7 Исследование влияние Saccharomyces cerevisiaе на 4-(4 парабромфенил)-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-селенохромен 69
2.7.1 Приготовление раствора 4-(4-парабромфенил)-2-фенил-5,6,7,8 тетрагидро-4Н-селенохромен с концентрацией 16 мг/мл 69
2.7.2 Методика переработки 4-(4-парабромфенил)-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-селенохромен под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде RPMI-1640 69
2.7.3 Методика переработки 4-(4-парабромфенил)-2-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-селенохроменпод воздействием Saccharomyces cerevisiaе в питательной среде молока 69
2.8 Исследование влияние Saccharomyces cerevisiaе на 3-(4-бромфенил) 5 4,5,6,7-тетрагидробензо[b]селенофен-2-ил) (фенил) метанона 70
2.8.1 Приготовление раствора (3-(4-бромфенил)-4,5,6,7-тетрагидро бензо[b]селенофен-2-ил) (фенил) метанона с концентрацией 16 мг/мл 70
2.8.2 Методика переработки (3-(4-бромфенил)-4,5,6,7-тетрагидробензо [b]селенофен-2-ил)(фенил)метанона под воздействием Saccharomyces cere visiaе в питательной среде RPMI-1640 70
2.8.3 Методика переработки (3-(4-бромфенил)-4,5,6,7-тетрагидробензо [b] селенофен-2-ил) (фенил) метанона под воздействием Saccharomyces cere visiaе в питательной среде молока 71
2.9 Методика приготовления растворимой в воде формы 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена 71
Глава 3. Результаты исследований 73
3.1 Разработка методики определения диацетофенонилселенида и продуктов его преобразования в биологических объектах, образующихся в присутствии Saccharomyces cerevisiae 73
3.2 Разработка методики определения «Селенохромена» и продуктов его преобразования в биологических объектах, образующихся в присутствии Saccharomyces cerevisiae 81
3.3 Разработка методики определения 9-фенил-симм. октагидроселенок-сантена и продуктов его преобразования в биологических объектах, образующихся в присутствии Saccharomyces cerevisiae 89
3.4 Разработка методики определения селенорганических соединений с двумя атомами, имеющими изотопный состав и продуктов их преобразования в биологических объектах 98
Глава 4. Обсуждение результатов 103
4.1 Трансформация диацетофенонилселенида (препарата ДАФС-25) в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae 103
4.1.1 Трансформация диацетофенонилселенида в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae в питательной среде RPMI-1640 104
4.1.2 Трансформация диацетофенонилселенида в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae в питательной среде молока 104
4.1.3 Трансформация диацетофенонилселенида в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae в виноградном соке 109
4.1.4 Трансформация диацетофенонилселенида в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae в растворе глюкозы 110
4.2 Трансформация «Селенохромена» (2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидро 4Н-селенохромена) в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae 112
4.3 Трансформация 9-фенил-симм. октагидроселеноксантена в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae 113
4.4 Трансформация тетрагидроселенохроменов и их производных в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae 115
4.5 Трансформация селенита натрия в присутствии культуры Saccharomy-ces cerevisiae 117
4.6 Разработка водорастворимой формы 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6 дигидроселенохромена 118
Заключение 125
Выводы 127
Практические предложения 129
Список используемой литературы 130
Приложения 155
- Получение биодоступного селена при помощи микроорганизмов и влияние селенсодержащих соединений на микроорганизмы
- Синтез 2,4-дифенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10b-гексагидро-2Н селенохромена
- Разработка методики определения «Селенохромена» и продуктов его преобразования в биологических объектах, образующихся в присутствии Saccharomyces cerevisiae
- Разработка водорастворимой формы 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6 дигидроселенохромена
Введение к работе
Актуальность темы. Селен является незаменимым микроэлементом в жизнедеятельности животных и человека, поэтому поиск новых форм его доставки в организм является актуальной задачей. Недостаток селена в питании животных и человека может привести к ряду заболеваний. Наиболее исследовано положительное влияние селена при лечении рака, гепатита С, диабета, церебро-васкулярной недостаточности, болезни Альцгеймера, отравлений солями тяжелых металлов, болезней щитовидной железы, сердечно-сосудистых заболеваний, астмы и других заболеваний. Также соединения селена могут быть использованы в качестве стимуляторов роста, антиокси-дантов, восстановителей ферментативных функций печени и мозга. (Тутельян В.А. и др., 2002; Ермаков В.В., 2004; Stadtman Thressa C., 2005; Weekley Claire M. and Harris Hugh H., 2013).
Соли селенопирилия и селенопираны, субстратами для которых служат диоксосо-единения, нашли применение в качестве компонентов оптических записывающих сред, фотогальванических элементов, инициаторов фотополимеризации, быстроре-лаксирующих затворов лазеров и для фотодинамического лечения (Gibson Scott L. et аl., 2005).
В настоящее время в медицине и ветеринарии для восполнения дефицита селена в основном используются его неорганические соединения: селенит и селенат натрия (Galbraith M.L. et al., 2016). Используются и препараты, которые получены биотехнологическим методом из селенита натрия, в которых селен представлен чаще всего в виде селенметионина и селенцистеина (Fisinin Vladimir I. еt al., 2009; Schrauzer Gerhard N., Surai Peter F., 2009). Применяемые в России менее токсичные синтетические селенорганические соединения представлены препаратами Селен-Актив (9-фенил-симм.октагидроселеноксантен, «Селенопиран», «Селенес», «Селексен») и ДАФС-25 («Селенобел», «Селенолин», «ДАФС-25к»), активная часть которых относится соответственно к гетероциклическому селенсодержащему соединению (А.с. СССР № 782343, 1981) и селенсодержащему дикетону (Пат. РФ 2051681; Пат. РФ 2171110).
В последние годы было установлено, что наночастицы селена могут усваиваться живыми организмами и могут быть использованы в ветеринарии и медицине (Bangjun Z. аnd Xiaoyu L., 2010; Chaudhary Savita et аl., 2014; Fernandes A.P., Gandin V., 2015; Bhattacharjee A. et аl., 2017), поэтому изучение биологической активности впервые синтезированных селенорганических соединений, их биотрансформации для получения натуральных селенсодержащих продуктов и исследование влияния микроорганизмов на данные соединения с целью более широкого их применения является актуальной задачей. Кроме того, актуальной является проблема создания инъекционных селенсодержащих препаратов.
Степень разработанности проблемы. В настоящее время для восполнения дефицита селена в основном используются его неорганические соединения (Galbraith M.L. et al., 2016) или продукты переработки селенита натрия Saccharomyces сerevisiae (Fisinin Vladimir I. еt al., 2009; Schrauzer Gerhard N., Surai Peter F., 2009). Исследование биологической активности органических соединений селена и использование последних для получения биологических форм селенсодержащих соединений интенсивно ведутся в последние 10-15 лет, однако практического применения пока не нашли (Tsivileva O., Perfileva A., 2017; Lazard M. еt al., 2017; Chalissery J. еt al., 2017).
Цель и задачи исследований: исследовать возможность создания новой технологии получения наночастиц селена и его биодоступных форм из селенорганических соединений под воздействием Saccharomyces cerevisiaе; разработать методики синтеза
селенорганических соединений и создания на их основе мицеллярных форм препаратов.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:
-
Провести анализ существующих методов и технологий создания селенсодержа-щих препаратов и кормовых добавок.
-
Разработать методы анализа селенорганических соединений и продуктов их биотехнологической переработки, чтобы установить фрагменты механизма их усвоения.
-
Исследовать влияние Saccharomyces cerevisiae в различных питательных средах на селенорганические соединения арилалифатического и гетероциклического рядов.
-
Установить строение продуктов биотехнологической переработки селеноргани-ческих соединений в различных питательных средах и определить пути биотрансформации селенорганических соединений в изучаемых системах.
-
Определить влияние питательной среды (природной и искусственной) на протекание исследуемого биотехнологического процесса.
-
Разработать способы получения селенорганическихсоединений и синтезировать на их основе конкретные субстраты, для создания мицеллярной (инъекционной) формы селенсодержащего препарата.
Научная новизна. Разработаны методы анализа при помощи газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ/МС) селенсодержащих соединений и продуктов их биотехнологической переработки за счет использования изотопного состава элементов, которые могут быть использованы при контроле технологических процессов по производству селенсодержащих лекарственных субстанций и кормовых добавок.
Впервые обнаружено образование наночастиц селена в результате воздействия Saccharomyces cerevisiae на селенорганические соединения.
Установлено образование ацетофенона в качестве побочного продукта при биотрансформации под воздействием Saccharomyces cerevisiae из диацетофенонилселе-нида, что свидетельствует о его восстановлении при его преобразовании. Аналогичные результаты получены для 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидро-4Н-селенохроменов, 9-фенил-симм.октагидроселеноксантенов и тетрагидроселенохроменов.
Впервые проведены реакции восстановления ряда селенсодержащих гетероциклических соединений, что было необходимо для изучения процесса их биотрансформации микроорганизмами.
Установлена возможность создания водорастворимых композиций за счет нерасво-римых в воде селенорганических соединений.
Теоретическая и практическая значимость. Установлено преобразование селе-норганических соединений и их отличие от неорганических форм селена под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в различных питательных средах. Преобразование идет в наночастицы селена и остальные продукты биотрансформации, которые не характерны для метаболизма дрожжей.
Разработаны основы технологических процессов получения новых водорастворимых мицеллярных форм для их наиболее эффективного введения в питательные среды и использования в качестве инъекционной формы препарата (Пат. РФ № 2572716).
Синтезированы новые селенорганические соединения, пригодные по своей структуре для введения в питательные среды.
Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных исследователей по вопросам синтеза селенорганиче-ских соединений, наночастиц и их биотрасформации (Блинохватов А.Ф., Цивиле-
ва О.М., Панкратов А.Н. - Россия; Detty Michael R. - USA; Comasseto Valdir -
Brazil и Engman Lars - Sweden и др.).
Для установления структуры и состава полученных веществ и наночастиц использовалась газовая хроматография с масс-селективным детектором, высокоэффективная жидкостная хроматография со спектрофотометрическим детектором, ядерный магнитный резонанс и электронно-просвечивающая микроскопия.
Для установления достоверности полученных результатов каждый эксперимент проводился минимум в трех повторностях.
Оборудование и методы. Размер и элементный состав нано- и микрочастиц определяли на просвечивающем электронном микроскопе Zeiss марки Libra 120 на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии «Симбиоз» Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов).
Процесс протекания реакций и индивидуальность полученных соединений на первоначальном этапе контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Идентификацию соединений производили при помощи элементного анализа и ЯМР-спектрометрии. ЯМР !Н спектры получены на спектрометре Varian FT-400.
Качественный и количественный анализ состава реакционных смесей, а также определение индивидуальности и идентификация получаемых соединений осуществляли с помощью метода ГХ/МС и ВЭЖХ с УФ детектором. Анализ методом ГХ/МС проводили на приборе HP - SMS 5890/5972 при условиях: температура инжектора хроматографа - 200 оС; время действия начальной температуры термостата колонки -3 мин.; начальная температура термостата колонки - 50 оС; конечная температура термостата колонки, при которой проводится анализ, - 280 оС; скорость повышения температуры термостата после удаления легкокипящих компонентов - 10 оС/мин.; газ-носитель - гелий, скорость подачи v = 1 мл/мин., а также путем ВЭЖХ на приборе Стайер Аквилон с УФ детектором иУ-104(колонка Луна С-18; элюент - 0,1 н раствор Н2804-ацетонитрил (3:2); скорость потока - 1,2 мл/мин.; объем пробы - 20 мкл; длина волны света - 254 нм).
Для определения концентрации методом ВЭЖХ предварительно строяли градуиро-вочный график по стандартным растворам, содержащим 50, 100 и 200 мкг/мл исследуемого соединения.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Методы анализа селенорганических соединений и продуктов их биотехнологического превращения в биологических объектах.
-
Данные экспериментов по биотрансформации под воздействием Saccharomyces cerevisiae в различных питательных средах: диацетофенонилселенида; 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена; 9-фенил-симм.октагидроселеноксантена; перхлоратов 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия и 2-(п-метоксифенил)-4-фенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия; 2-фенил-4-(4-п-бромфенил)-5,6,7,8-тет-рагидро-4Н-селенохромена; (3-(4-бромфенил)-4,5,6,7-тетрагидробензо-[b]селенофен-2-ил)-(фенил)-метанона и (3-фенил-4,5,6,7-тетрагидробензо-[b]селенофен-2-ил) (п-хлорфенил)-метанона.
-
Строение продуктов, образующихся при биотрансформации исследованных селенорганических соединений.
-
Строение органических соединений, образующихся в качестве промежуточных продуктов при биотрансформации исследованных селенорганических соединений.
-
Методики синтеза новых селенорганических соединений.
6. Способ получения оптимальной водорастворимой формы 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена для введения в питательную среду селенорганического соединения и создания инъекционной формы препарата.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность выводов основывается на значительном объеме полученных экспериментальных данных. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили общепринятым методом (Лакин Г.Ф., Биометрия, 1990). Расчеты и построение технологических таблиц и схем осуществляли с помощью программы «Micr s ft Office Excel 2010», входящей в пакет программ «Micr s ft Office 2010».
Результаты, полученные в ходе выполнения данной работы, были представлены на Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2013 г.); Конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской, учебно-методической и воспитательной работы за 2012, 2013, 2014, 2016 годы (Саратов, 2013, 2014, 2015, 2017 г.г.); Конкурсе научно-инновационных работ молодых ученых, посвященном 100-летию университета (Саратов, 2013 г.);VIII Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2013 г.); Конкурсе научных работ в рамках Всероссийской молодежной научной конференции «Новые материалы и технологии: состояние вопроса и перспективы развития» (Саратов, 2014 г.); Всероссийской молодежной научной конференции «Современные биоинженерные и ядерно-физические технологии в медицине» (Саратов, 2014 г.); Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы" (Саратов, 2014 г.); Конкурсе молодых ученых «Грант Ректора» (Саратов, 2015 г.); УМНИКе (Участник молодежного научно-инновационного конкурса; Саратов, 2015 г.).
Публикации. По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано 15 научных работ, из них 1 статья в журналах, рецензируемых в БД Scopus и Web of Science, 2 статьи в журналах, рекомендованных перечнем ВАК, 1 патент РФ на изобретение.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Результаты научных исследований соответствуют пунктам 7 и 11 паспорта специальности 03.01.06.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, описания результатов исследований, обсуждения результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 181 источник. Диссертация изложена на 163 страницах, включает 52 рисунка и 10 таблиц.
Получение биодоступного селена при помощи микроорганизмов и влияние селенсодержащих соединений на микроорганизмы
Известно, что при помощи Saccharomyces cerevisiae получали при переработке селенита натрия, обогащенную селеном субстанцию, которая получила название Sel-Plex и была использована для создания обогащенной селеном сельскохозяйственной продукции (Fisinin Vladimir I. et al., 2009).
Применение данного селенсодержащего продукта хорошо обосновывается в обзоре (Schrauzer Gerhard N., Surai Peter F., 2009).
Биоаккумуляция селена микроорганизмами хорошо представлена во многих статьях. В частности, указывается на хорошие характеристики для использования Saccharomyces cerevisiae (Kieliszek M. et al., 2015). Однако, известны и другие микроорганизмы, которые могут накапливать данный микроэлемент (Pieniz, S. et al., 2017; Kieliszek, M. et al., 2017; Kieliszek, M., Kot, A.M. et al., 2017).
Основное количество селена при его усвоении представлено в виде селен-содержащих белков, синтез которых зависит от мРНК. Причем последние зависят от системы тиоредоксина (Yang, J. et al., 2017), а работа пары тиоредоксин – тиоредоксинредуктаза нарушается при недостатке селена (Yang, J., Hamid, S. et al., 2017).
При идентификации селенсодержащих белков чаще всего осуществляется через анализ, встроенного в них селенметионина, однако некоторые белки не могут быть идентифицированы данным образом. Поэтому разрабатываются другие методы их определения. Например, для количественного определения селенгомолантионина (SeHLan) в дрожжевых добавках был разработан метод ХИЛК - ICP MS с пределом обнаружения 146 нг/г (Bierla, K. et al., 2017).
Следует отметить, что при использовании жидкостной хроматографии с электрораспылением и детектором в виде время пролетной масс спектрометрии обнаружено более 100 метаболитов селена в селенизированных дрожжах (Gilbert-Lоpez, B. et al., 2017).
Необходимо подчеркнуть, что селен усваивается живыми организмами превращаясь не только в селенсодержащие аминокислоты и белки, но и в соответствующие полисахариды, которые оказывают положительное влияние на животных в качестве противовоспалительного препарата (Gao, Z. et al., 2017). К тому же интенсивно ведутся работы по биоаккумуляции селена растениями, грибами и водорослями (Tsivileva O. et al., 2017; Schiavon, M. et al., 2017; Hu, Y. et al., 2017).
Однако, при использовании селенита натрия для получения дрожжевого селена, данный микроэлемент накапливается в виде селенметионина и селенцистеина и их производных, что может вызвать нежелательный эффект при их использовании (Plateau, P. et al., 2017; Takahashi, K. et al., 2017). Следует добавить, и положительное действие указанных селенсодержащих аминокислот на организм (Liu, J. et al., 2017; Tanko, Y. et al., 2017).
Биоактивность селена в основном зависит от его химической формы. Исследования селенита натрия, селенметионина и селенцистеина, в отношении их потенциальной ДНК повреждающего воздействия на Saccharomyces cerevisiae, которую использовали в качестве модельной системы для тестирования токсичных и мутагенных эффектов, а также ДНК двухцепочечную активность этих соединений селен в обоих экспоненциально растущих и стационарных клеток дрожжей. У селенита натрия проявляются значительные токсические эффекты с дрожжами, которые были более выражены в экспоненциально растущих клетках, чем в клетках в стационарной фазе роста. Токсические эффекты селенита натрия сопровождаются про-мутагенным эффектом в стационарной фазе клеточного роста. Токсические и мутагенные эффекты селенита натрия, вероятно, связано со способностью этого соединения генерировать ДНК двухцепочечного разрыва и действует как окислитель в S. cerevisiae как супероксид и увеличивает окислительное повреждение ДНК и как следствие гибель клеток. Для селенметионина и селенцистеина авторами не было обнаружено явных токсических эффектов на примере S. cerevisiae (Letavayov, L. et al., 2008). Впоследствии был уточнен механизм восстановления ДНК после окислительного повреждения (Chalissery, J. et al., 2017).
Органические селеновые комплексы и селенсодержащие аминокислоты считаются наиболее биодоступными. При соответствующих условиях дрожжи способны накапливать большое количество микроэлементов, таких как селен в составе органических соединений. Было установлено, что введение водорастворимой селенсодержащей соли в качестве компонента культу-ральной среды для дрожжей приводит в результате стандартной пакетной обработки к значительному количеству селена, поглощаемого дрожжами. Использование культуральной среды, содержащей 30 мкг/мл селенита натрия, добавляемого в ходе экспоненциальной фазы роста приводит к накоплению селена в диапазоне 1200-1400 мкг/г сухих пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), установленную методом ICP-AES. А высокая концентрация селенита натрия в культуральной среде оказывает сильное ингибирующее действие на рост дрожжей. В результате различий в условиях культивирования, авторами получены селенсодержащие дрожжи с различной концентрацией неорганического селена (Suhajda, А. et al., 2000).
Хотя селен является незаменимым элементом, его чрезмерное потребление обладает негативным воздействием на живые организмы. Тем не менее, принцип токсичности селена не до конца понятен. Применение капиллярного электрофореза и время пролетной масс-спектрометрии при анализе дрожжевых клеток, с селенметионином показали, что количество внутриклеточных серосодержащих соединений уменьшилось, а селенсодержащих соединений увеличилось. Установлено, что дифенилдиселенид (DPDS) обладает антиок-сидантной активностью, и таким образом, оказывает защитное действие на функции печени, почек и желудка, в дополнение к его нейропротективной активности. А воздействие на центральную нервную систему, DPDS имеет ли-пофильные свойства, увеличивая активность аденилатциклазы и ингибирова-ния глутамат и МК-801 связывания с синаптической мембраной (Rosa R.M. et аl., 2007).
Клеточный ответ на применение селенита натрия вызывает очень разнообразные процессы, в том числе и реакции репарации клетки. Поскольку в неорганической форме селен, достаточно хорошо изучен и широко используется в качестве пищевой добавки в мире, установлены механизмы селен-индуцированной токсичности у дрожжей Saccharomyces cerevisiae с использованием комбинации систематического генетического и транскриптом анализа. Во - первых, проведен скрининг дрожжей с гаплоидным удалением гена для роста в присутствии селенита натрия и идентифицировано 39 высокочувствительных на селен частей гена. Соответственно в удаленных генах закодированы в основном белки, ответственные в ДНК при повреждении и ремонте, функции вакуолей, глутатиона (GSH), транскрипции и метаболизма хроматина. ДНК ответ на повреждения и генетические отклонения были рассмотрены более подробно. Обнаружено синергетическое взаимодействие между пострепликацией (ПРР) и гомологичной рекомбинацией (HRR) при восстановлении. Кроме того, эффект комбинированных дефектов в ПЧР и GSH метаболизма анализировался, и аналогично было найдено синергиче-ское взаимодействие. Анализ микрочипов использовался, чтобы выявить изменения профиля экспрессии после воздействия селенитом натрия. При индуцированной токсичности селена замечено повреждение ДНК, что является важным аспектом в реагировании и восстановлении ДНК, и в защите клеток от токсического воздействия селенита натрия. Установлено, что причиной токсичности является повреждение клеточных белков, в том числе тех, которые участвуют в ДНК реагировании и устранении повреждений (Mаnikovа, D. et аl., 2012).
Оптимальная концентрация селенита натрия для выращивания Saccharomyces cerevisiae была установлена и равнялась 19 мкМ/л (-3,3 мг/л) (Ahmed H.H. et аl., 2013).
Однако установлено замедление роста индуцированного селенметио-нином извлеченного внеклеточным добавлением цистеина и путем генетической модификации клеток дрожжей, которые имели дополнительный DeNovo путь синтеза цистеина. А поскольку цистеин является промежуточным тиоловым соединением, данные результаты свидетельствуют, что потери в восстановленной форме тиоловых соединений вследствие применения селенме-тионина вызывает дефект роста дрожжевых клеток (Kitajima, T. et аl., 2012, 2013).
Наночастицы селена в белковой оболочке являются дополнением к токсичному воздействию данного микроэлемента на человека. Многие микроорганизмы могут снижать концентрацию селена как внутриклеточного, так и внеклеточного. Изучение влияния растворенного кислорода на вывод внеклеточных наночастиц селена стабилизированных белковой оболочкой, продуцируемых в Saccharomyces cerevisiae показало их образование только при насыщении кислородом и отсутствие в аэробных или анаэробных условиях. Установлено, что наночастицы селена стабилизированных белковой оболочкой, синтезированные в естественных условиях были выведены из клеток с помощью везикул-подобных структур в микроаэрофильной среде. Данные результаты исследований подтверждены с помощью SEM, TEM, EDX иИК – Фурье (Zhang, L. et аl., 2012).
Синтез 2,4-дифенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10b-гексагидро-2Н селенохромена
чРеакции восстановления двойных связей у селенсодержащих соединений каталитическим гидрированием и водородом в момент выделения не описаны в литературе. Однако известен метод ионного гидрирования (Курсанов Д.Н. и др., 1979), которым были восстановлены без разрушения гетеро-цикла арилзамещенные 4Н-селенопираны и симм. октагидроселеноксантены с образованием соответствующих селенациклогексанов (Древко Б.И. и др., 2009), которые получали с преимущественным образованием одного изомера и пергидроселеноксантенов (Блинохватов А.Ф. и др., 1981), изомерный состав которых не изучался.
Нами впервые было осуществлено ионное гидрирование соответствующих 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохроменов с использованием триэтилсилана и трифторуксусной кислоты, причем последняя выступала и в роли растворителя (Древко Я.Б. и др., 2015).
К 0,001 моль 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидро-4Н-селенохромена при постоянном перемешивании в течение 10 мин добавляют 0,3 мл триэтилсилана и далее в течение 20 мин 0,37 мл трифторуксусной кислоты. Полученную смесь перемешивают 40 мин. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и промывают 22 мл охлажденного этанола.
В результате реакции были синтезированы и охарактеризованы: 2,4-ди-фенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10Ь-гексагидро-2Н-селенохромен IV, 2-(п-хлор-фенил)-4-фенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10Ь-гексагидр-2Н-оселенохромен V и 2-Фенил-4-(п-хлорфенил)-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10Ь-гексагидро-2Н-селенохромен VI с выходами 88%, 80% и 82% соответственно. Их структура была подтверждена данными ГХ/МС, ЯМР 1Н спектрометрии и элементного анализа.
Методом ГХ/МС установлено, что соединения IV, V, VI существуют в основном в виде двух изомеров с содержанием 48 % - 50 % каждого, которые проявлялись на хроматограмме в виде двух отдельных сигналов с разным временем удерживания. Масс-спектры изомеров были идентичными и отличались только соотношением интенсивностей между молекулярным ионом и ионами фрагментов. Молекулярные ионы для соединения IV были представлены в виде шести сигналов, интенсивность которых соответствовала содержанию изотопов селена в природе.
Аналогичная картина наблюдалась и для соединений V и VI, молекулярные ионы которых проявлялись в виде восьми сигналов, что было связано с наличием двух изотопов хлора. Кроме того, в составе продукта имелись примеси исходного соединения и частично дегидрированного и частично гидрированного продукта. При анализе кристаллов V установлено его существование в виде четырех изомеров, два из которых получены с суммарным выходом около 1%.
ЯМР 1Н спектры получены на спектрометре Varian FT-400 при температуре 25 оС, рабочая частота – 400 МГц. Внутренний стандарт ТМС.
Следует отметить, что в продуктах реакции, полученных при гидрировании соединения I, методом ГХ/МС в незначительных количествах обнаружено исходное соединение с хроматографическим выходом 2,9 %. Наряду с соединением I в составе продуктов реакции присутствует соединение VII в количестве 2,8 %, как результат дегидрирования бензодигидроселенохромена (молекулярный ион представлен в виде шести сигналов с интенсивностями, соответствующими содержанию изотопов в природном селене - m/z = 398 для Se80) в количестве 1,5 % соединение VIII, как результат частичного восстановления бензодигидроселенохромена (молекулярный ион представлен в виде шести сигналов с интенсивностями, соответствующими содержанию изотопов в селене - m/z = 402 для Se80) (рисунки 2.1-2.3).
На хроматограмме реакционной смеси после гидрирования соединения II имелись сигналы и других селенсодержащих соединений: около 1 % - не полностью прогидрированного продукта IX и соответствующих селенофенов: X (2,5 %) и XI (7,5 %) (молекулярный ионs представлены в виде восьми сигналов с интенсивностями, соответствующими содержанию изотопов в природных селене и хлоре).
Образование производных селенофенов говорит о том, что в реакционной среде могли находиться соответствующие соли селенохромилия, возникающие в CF3COOH в результате реакции диспропорционирования, которая известна для арилзамещенных селенопиранов (Харченко В.Г., Древко Б.И., 1984). На инжекторе хроматографа соли бензодигидроселенохромилия, вероятно претерпевали термическую перегруппировку, аналогичную описанной в работе (Древко Б.И. и др., 2006) для арилзамещенных солей селенопи-рилия.
При гидрировании соединения III вторичные продукты реакции идентифицировать не удалось.
Таким образом, была впервые проведена реакция гидрирования 2,4-ди-арил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохроменов и получены первые представители новых гетероциклических систем - бензаннелированных гексагидро-селенохроменов.
Разработка методики определения «Селенохромена» и продуктов его преобразования в биологических объектах, образующихся в присутствии Saccharomyces cerevisiae
Методы контроля протекания процессов мы решили использовать такие же, как и в предыдущем подразделе. Однако, «Селенохромен» при анализе методом ГХ/МС разлагается на инжекторе хроматографа с образованием сложной смеси продуктов (рисунок 3.12). Основным продуктом при этом на хроматограмме является соединение, полученное при элиминировании элементарного селена. При этом сигналы молекулярного иона имеют довольно слабую интенсивность по сравнению ионами фрагментов (рисунок 3.13).
Карбоциклические соединения в сложной смеси продуктов идентифицировать не удалось. Соединение с молекулярным весом 324 не было представлено на хроматограмме, а соединение с молекулярным весом 326 ретушировалось большим количеством сигналов (рисунок 3.14) (аналогичное явление наблюдалось на всех хроматограммах).
Одним из вероятных продуктов может быть 2,4-дифенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10b-гексагидро-2Н-селенохромен, поэтому было решено синтезировать указанное соединение из «Селенохромена» в качестве свидетеля. Подобные соединения в литературе не описаны и впервые опубликованы нами (Древко Я.Б. и др., 2015).
При анализе данных ГХ/МС было решено записывать хроматограммы с использованием программы “Extract Ion Chromatograms” по молекулярным ионам 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена с m/z 404 и 402 (для изотопов Se80 и Se78), интенсивность которых должна соотноситься как 2:1.
Через 10 минут после начала эксперимента в среде RPMI-1640 гекса-гидроселенохромен не был обнаружен. При наличии сигнала с m/z 402, сигнал с m/z 404 отсутствовал (рисунки 3.15, 3.16).
Через 30 минут после начала эксперимента гексагидроселенохромен не был обнаружен (рисунок 3.17).
Однако через 60 минут после начала эксперимента были обнаружены сигналы гексагидроселенохромена (рисунки 3.18, 3.19).
В данном случае соотношение интенсивностей ионов 404 и 402 было два к одному при абсолютно одинаковом времени удерживания (рисунок 3.19).
Через 120 минут гексагидроселенохромен в пробе не был обнаружен (рисунок 3.20). Это можно объяснить или слабой общей интенсивностью сигнала данной пробы, вызванной сбоем в ее подаче (рисунки 3.21, 3.22), которые характеризуют общую интенсивность сигнала) или тем, что данное соединение расходуется при протекании эксперимента.
Однако метод ГХ/МС не позволяет определить количественное содержание селенсодержащих соединений в исследуемой смеси, поэтому для установления данных параметров был проведен анализ бензольных вытяжек и самой питательной среды методом ВЭЖХ с УФ детектором (рисунок 3.23).
Для подтверждения полученных результатов нами были предприняты попытки провести аналогичный эксперимент с 2,4-дифенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10Ь-гексагидро-2Н-селенохроменом, однако достоверных результатов в данном случае получить не удалось из-за низкой чувствительности приборов.
Аналогичные результаты получены при проведении экспериментов с перхлоратами 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия 2-(п-ме-токсифенил)-4-фенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия.
Таким образом показано, что усвоение селенсодержащих соединений в присутствии Saccharomyces cerevisiaе происходит при восстановлении органической части молекулы.
Разработка водорастворимой формы 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6 дигидроселенохромена
Нами разработан инъекционный препарат на основе 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена, который обладает высокой биологической активностью и низкой токсичностью. В данном препарате применяются фармакопейные растворители и ПАВ, что позволило создать стабильную мицел-лярную форму на водной основе.
Препарат «Селенохромен» - гомогенный прозрачный раствор от бледно– до темно–желтого цвета со слабым специфическим запахом, легко разбавляемый в воде. Относительная вязкость составляет 112,4; плотность – 1,071 г/мл; pH – 6,73.
Исследуем доклиническое изучение безопасности формообразующих веществ, входящих в состав прототипа препарата «Селенохромен» и предоставление наиболее полной информации об острой токсичности компонентов прототипа препарата, который предлагается для применения в качестве инъекционной формы для сельскохозяйственных животных.
Объектом исследования послужили белые нелинейные мыши (самцы) в возрасте 2 - 2,5 месяца и массой тела 20 - 25 г. Животные были разведены специально и ранее не участвовали в опытах. Прежде чем приступить к опыту животных в течение 7 суток содержали в клетках в отдельном помещении, во время карантинного периода контролировали клинические показатели состояния здоровья. Содержали мышей в контролируемых условиях при температуре воздуха 20-22 С, относительной влажности 60-70% и естественно-искусственном освещении в поликарбонатных клетках по 10 голов. Индивидуальные значения массы тела не отклонялись от среднего значения в группе более чем на 10%. В качестве подстила использовали древесные опилки. Кормление производили сухим брикетированным кормом для грызунов. Воду для питья мыши получали из стандартных нипельных поилок. Каждое животное имело отчетливо детектируемую метку (раствором пикриновой кислоты), на клетке размещали этикетку в которой указывали название опыта, его продолжительность, номер группы и количество животных.
Было сформировано 36 групп по 10 голов нелинейных белых мышей, которым вводили внутрибрюшинно с помощью одноразовых шприцев для инъекций четыре комбинации формообразующих веществ в следующих дозах: 14000; 13000; 12000; 11000; 10000; 9000; 7000; 6000; и 5000 мг/кг. Схема опыта представлена в таблице 4.1.
В течение 15 суток после введения комбинаций прототипа препарата проводили наблюдение за животными и возможной гибелью, а также проявлением симптомов интоксикации; отмечали особенности поведения, приема корма и воды; учитывали состояния волосяного покрова, видимых слизистых оболочек. Павших мышей вскрывали и подвергали макроскопическому исследованию. При аутопсии детально исследовали внешнее состояние тела, грудную и брюшную полости с находящимися в них органами и тканями.
Острая токсичность компонентов изучаемых комбинаций прототипа препарата представлена в таблицах 4.2 – 4.5.
Как видно из таблицы 4.2, большинство из испытанных дозировок привело к гибели мышей, причем, дозы 14000; 13000; 12000; 11000; 10000 мг/кг были абсолютно смертельными – LD100. Доза 7000 мг/кг массы тела является среднесмертельной при однократном внутрибрюшинном введении комбинации – LD50. Наименее токсичной оказалась доза – 5000 мг/кг массы тела, вызвавшая гибель двух голов мышей из десяти.
Как видно из таблицы 4.4, в третьей комбинации компонентов близкой к LD 50 является доза 12000 мг/кг массы тела. Доза 14000 мг/кг массы тела, при которой пало девять животных из десяти, является близкой к абсолютно смертельной дозе. Доза 9000 мг/кг массы тела является максимально переносимой, где падеж животных не наблюдался.
Как видно из таблицы 4.5, доза 14000 мг/кг массы тела и более в данной комбинации является близкой к среднесмертельной дозе – LD50. Доза 10000 мг/кг массы тела являются максимально переносимой. Так же необходимо отметить, что 100% гибели мышей не наблюдалось при введении всех исследуемых дозировок этой комбинации компонентов.
На основании полученных данных статистически пробит-анализом (метод Прозоровского) определили значения LD50 и других параметров острого токсического действия компонентов всех четырех комбинаций прототипа препарата «Селенохромен». Результаты представлены в таблице 4.6.
Результаты статистической обработки значений LD50 компонентов четырех комбинаций прототипа препарата «Селенохромен» свидетельствуют о том, что они достоверно различаются и составляют для первой комбинации компонентов 6580,18±598,13, для второй - 8192,84±499,99, третьей -12426,19±526,26 и четвертой комбинации - 17813,06±1211,12 мг/кг массы тела.
Исходя из полученных результатов, разработана технологическая схема получения растворимой в воде формы препарата «Селенохромена» (рисунок 4.12).
На основании полученных данных можно утверждать, что вспомогательные вещества, входящие в состав препарата «Селенохромен» оказывают токсическое действие на организм животных в определенном сочетании и процентном соотношении.