Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы. Культуры клеток животных и человека получили широкое применение в вирусологической практике, а также в производстве диагностических, лечебных и профилактических препаратов. Для получения и поддержания клеточных культур необходимы различные виды питательных сред, солевые и диспергирующие растворы. В настоящее время ферментативные белковые гидролизаты, благодаря своим питательным свойствам, доступности, простоте изготовления, относительно невысокой стоимости и перспективности для получения разнообразных клеточных культур, находят все более широкое применение в качестве аминокислотно-пептидной основы вирусологических питательных сред. Применение ферментативных гидролизатов позволяет не только заменять дорогостоящие импортные аминокислоты, но и за счет низкомолекулярных пептидов интенсифицировать обменные процессы в клетках, а также использовать их для частичной или полной замены сыворотки крови животных в составе ростовых питательных сред.
Традиционно ВПС для культур клеток в промышленных масштабах готовят в жидкой форме методом стерилизующей фильтрации. Существенными недостатками жидкой формы ВПС является нестабильность при длительном хранении, потребность в больших объемах посуды , холодильного оборудования, а также затрат, связанных с транспортировкой. В последние годы все большую популярность приобретают сухие формы ВПС и растворов для культур клеток. Они стабильны, сохраняют высокие ростстимулирующие свойства на протяжении всего срока хранения, не требуют существенных затрат на транспортировку и хранение. Следует также отметить, что сухие стерильные ВПС за рубежом не выпускают, а предлагают для использования лишь сухие коммерческие нестерильные композиции, предполагающие наличие у потребителя специального оборудования и материалов для стерилизующей фильтрации.
* Список сокращений приведен на с.28.
В России в сухой стерильной форме в промышленном масштабе выпускают следующие ВПС на основе индивидуальных компонентов: Игла, 199, RPMI-1640, 199 М, МЕМ-4, а также диспергент — трипсин. Аналогичная форма ВПС на основе гидролизатов в промышленных объемах не выпускается, а исследования по изготовлению сухих стандартных образцов — референс-препаратов гидролизатных ВПС не вышли за рамки лабораторных исследований. Поэтому задача разработки технологии изготовления сухой стерильной формы гидролизатных ВПС квалификации «для культур клеток» является актуальной и экономически обоснованной.
Крупный вклад в решение вышеуказанных проблем внесли отечественные (Е.Ф. Калинина, 1963; Д.Ф.Осидзе, 1974; В.А. Сергеев, 1976; И.Д. Сперанская, 1979; Л.П. Дьяконов,1984, 1994; Н.Д. Скичко, 1983; И.Г. Ермишина, 1989, 1996; А.И. Коренева, А.С. Пригода, 1991, 1996; Н.А. Башашкина, 1994 и др.) и зарубежные исследователи (J. Morgan, 1950; I. Melnik, Riordan, 1952; A. Freeman, 1973; С. Waymouth, R. Ham, 1979; К. Lambert, J. Birch, 1989; R. Heidemann, 1999). Многие вопросы данного направления не решены и нуждаются в теоретическом обосновании, дальнейшей разработке и внедрении в практику.
1.2. Цель и задачи исследований. Целью исследований была разработка технологии изготовления, методов оценки качества сухих стерильных питательных сред на основе гидролизатов и их апробация при получении широкого спектра культур клеток и вирусов.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
определить общие требования к качеству исходных ингредиентов: ферментативных гидролизатов и неорганических солей, пригодных для изготовления сухой стерильной формы гидролизатных ПС;
разработать технологию изготовления, подобрать оптимальные условия стерилизации сухих стерильных форм гидролизатных ПС;
разработать экспресс метод оценки качества ПС;
оценить пригодность сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов для производства ряда первичных и перевиваемых культур клеток;
испытать сухие стерильные ПС на основе ферментативных гидролизатов в производстве противовирусных препаратов;
определить условия и сроки хранения сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов;
разработать НТД на изготовление, контроль и применение сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов.
1.3. Научная новизна. Впервые получены научно обоснованные данные, положенные в основу разработки опытно-промышленной технологии производства «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной», отвечающей требованиям квалификации «для культур клеток».
Впервые экспериментально обоснованы условия стерилизации многокомпонентного препарата «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной» ускоренными электронами и показана возможность оценки стандартности препарата спектрофотометрическим методом. Отработаны методы контроля и определены предельно допустимые показатели качества «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной».
Научно обоснована трехкомпонентная форма выпуска препарата. Показано, что при длительном хранении происходит снижение качества вирусологических питательных сред за счет химического взаимодействия реакционно-активных аминокислот и глюкозы с образованием токсических продуктов. Определены оптимальные условия и сроки хранения препарата. Показана возможность применения метода «ускоренного старения» для прогнозирования длительности хранения препарата.
Доказана пригодность и перспективность применения препарата для получения широкого спектра первичных, перевиваемых культур клеток и противовирусных препаратов.
Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены авторским свидетельством (а. с. № 1566723 от 22.01.1990 г.) и патентом РФ (приоритетная справка № 99105439 от 15.03.1999 г.).
1.4. Практическая значимость работы. В ГНЦ ВБ «Вектор» раз
работана и внедрена в производство технология изготовления «Среды
питательной на основе гидролизатов сухой стерильной». Экономически
и практически обосновано применение препарата в биотехнологии. По
материалам диссертации разработана и утверждена нормативная доку
ментация на препарат. Для вирусологической практики предложены 4
новых коммерческих препарата:
среда питательная на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная;
среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков сыворотки молока сухая стерильная;
среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков крови сухая стерильная;
среда питательная на основе ферментативного гидролизата лактальбумина сухая стерильная.
1.5. Апробация работы. Основные результаты доложены и
получили положительную оценку на Всесоюзной конференции по
актуальным вопросам разработки препаратов медицинской биотех
нологии (Махачкала, 1989г.); Всесоюзной конференции по питательным
средам и сывороткам для культивирования клеток (Новосибирск, 1991г.);
симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1995г.);
конференции «Перспективы развития производства биопрепаратов для
медицины и сельского хозяйства« (Степногорск, 1995г.); V симпозиуме
«Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1998г.); 7 междуна
родной конференции «Новые информационные технологии в медицине
и экологии» (Гурзуф, 1999 г.).
-
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, получено а.с. № 1566723, подано заявление о выдаче патента РФ (приоритетная справка № 99105439 от 15.03.1999 г.).
-
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.
По результатам выполненных исследований на защиту выносятся следующие положения:
технология изготовления и контроль сухих стерильных форм ВПС на основе ферментативных гидролизатов;
экспресс метод оценки стандартности состава ВПС;
целесообразность и перспективность применения сухих стерильных ВПС на основе ферментативных гидролизатов для культивирования широкого спектра первичных и Перевиваемых культур клеток и получения противовирусных препаратов.
1.8. Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на
190 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор лите
ратуры, материалы и методы, собственные исследования, обсуждение
результатов, выводы, практические предложения, список литературы,
включающий 185 источников, приложения. Работа иллюстрирована
25 таблицами,11 рисунками.
Основные разделы работы выполнены автором самостоятельно под руководством доктора биологических наук, профессора Ночевного В.Т. и кандидата химических наук,с.н.сТрошковой Г.П. При выполнении отдельных этапов работы принимали участие:
Децина А.Н., Камший Л.П., Мазуркова Н.А., Кондрахин Ю.В.,
Мартынец Л.Д., Сорокина Е.А., Величко А.В.