Введение к работе
Актуальность темы. Получение индивидуальных биологических молекул из такой многокомпонентной системы как биомасса одна из наиболее важных і: актуальных проблем биотехнологии. Биомасса служит источником целого спьктра продуктов, которые широко применяется в различных отраслях народного хозяйства. Разрабатывая приемы и методы, направляющие метаболизм живой клетки на избирательный синтез тех или иных молекул, биотехнология решает вопросы замены химического синтеза соединений сложного строения с получением биологически адекватных структур.
В органическом синтезе стероидов произошел настоящий переворот, когда в качестве сырья стали использовать стерины из животных и растительных тканей, а также из биомассы микроорганизмов. Циклопентанпергидрофенантреновая структура стериновой молекулы позволила отказаться от многостадийных синтезов циклической части, что значительно удешевило производство. Расширение сфер применения стероидных препаратов а медицине, сельском хозяйстве, косметической и электронной прокишіенностях заставляет искать не только новые источники сырья, но и более удобные стерины для простых химшесь . < модификаций в пирокий класс стероидных соединений.
Микробиологический синтез стериновых молекул инеет ряд преимуществ: более вы -ікуо скорость и селективность образования стеринов, возможность использовать дешевые субстраты и независимость от климатических условий. Особое место занимает дрожжи, которые отличается от других микроорганизмов высоким содержанием стеринов в биомассе. Это определяет использование дрожжей в промышленном получении эргостерина ( ОнаАдкан,1973).
К моменту начала наших исследований было установлено, что помимо эргостерина, другие стериновыа молекулы а дрожжевой клетке содержатся в следовых количествах (Frayberg at al.,1976). Процесс образования эргостерина объединяет боле< 20-ти стадий и состоит из трех основных этапов: синтеза ациклических предшественников, циклизации оксидосквалеііа и
- 4 -синтеза циклических интермеднатов (Parks,1978; Гальцо-ва,1980). Наименее изученным с точки зрения биосинтеза и Генетической регуляции оставался оследний этап, в ходе которого образуются разнообразные стерияы. Это сдерживало разработку методов управления синтезом стериновых молекул в дрожжевой клетке и затрудняло получение из дрожжевой биомассы наряду с эргостеринон других ц> пых ст-.ринов. Поэтому изучение биохимических, генетических и физиологических аспектов образования циклических предшественников эргостерина у дрожжей, а также разработка приемов создания продуцентов стери їв и оценка перспектив использования их в биотехноло-гнчсских процессах актуально и направлено не только на решение теоретических проблем метаболизма биологических молекул, но и служит научной основой биотехологического получения сырья для производства разнообразных стероидных препаратов.
Настоящая работа явилась часть» научных исследований, проводимых по программе ГКНТ СССР 0.74.05."Синтез биологически активных веществ" и "Биотехнология - 2000".
Полью работы явилась разработка научных основ микробиологического синтеза разнообразных стеринрв путем, гчнетическоЯ, метаболической и физиологической регуляции стериногенеэа у дрожжей.
Основные положения, выносимые на зашиту;
Генетический контроль биосинтеза стеринов: селективная система выделения мутантов по синтезу эргостерина; особенности фенотипического проявления мутації' в структурных и регуляторных генах стеринового синтеза: наследование и взаимодействие этих генов и их аллелей.
Биосинтез стеринов у дрожжей: пг ледовательность этапов биосинтеза эргостерина; сходство и особенности стериногенеэа у дрожжей разной систематической принадлежности; закономерности зразования стеринов у мутантов.
Регуляция биосинтеза стеринов: критерий оценки интенсивности стериногенеэа: мутации. влияющие на уровень стери-нообраэования; леханизмы внутриклеточной регулясии биосинтеза сіеринов; связь стериноге еза с ростом дрожжей.
- Управление биосинтезом и продукцией стеринов у дрож-
. 5 . жей: генетические и биотехнологические приемы регулирования стериногенеэа; схема селекции и генетического конструирования штаммов, продуцирующих индивидуальные стерины.
- Методология исследования стериногенеэа у дрожжей, сочетающая генетический, биохимический и физиологический подходы.
Научная новизна. Впервые проведено разностороннее исследование генетического контроля стеринообразования у дрожжей: разработаны селектиьные системы выделения рецессивных (в структурных генах) и доминантных (в регуляторних генах) мутаций; изучена экспрессия мутаций при различных условиях культивирования; получены новые данные о.межгенных и межал-лельных взаимодействиях генов, контролирующих превращения циклических ингермедиатов. Для генов серии NYS обнаружено явление эпистаза (NYS1>NYS2>NYSJ>NYS4). В гене NYS2 выявлена межаллельная комплементация.
Исследованы метаболические пути синтеза стеринов и механизмы регуляции интенсивности стериногенеэа. Для Saccharo-nyces cerevisiae показано, что гены NYS контролируют превращение ланостерика в эргостерин: HYS1 - С24-метилирование боковой цепи; NYS2 - Д5-^1-изомеризацию; NYS3 - 5(б)-дегидри-рование и NYS4 - 22(23)дегидрирование. У Candida r.altosa впервые генетически маркированы шесть разных стадий превращения- циклических интермедиатов биосинтеза эргофтерина: гидрирование С14(15), 14"-деметилирование, метилирование боковой цепи по С24, ДВ-»Д7-изомеризация, С5(б)-дегидрирование и гидрирование С24(28).
Генетич скип подход в совокупности с результатами биохимического анализа выявил новые особенности метаболизма стериновых молекул в дрожжевой клетке. Получены важные доказательства в пользу существования у дрожжей строгой последовательности реакций синтеза эргостерина иэ ланостерика. Впервые для C.maltosa построена схема биосинтеза эргостерина. Наряду с гомологией в биосинтезе стеринов у Sacch.cerevisiae и C.maltosa выявлены различия в последовательностг отдельных этапов.
Установлена количественная связь между уровней устойчивости дрожжей Sacch.oerevisiae к нистатину, содержанием сте-ринов в клетке и их качественный оставок. Оценен вклад некоторых функциональных групп сгериновых молекул в формирование уровня устойчивости дрожжей к нистатину. Уровень устойчивости дрожжей к данному г.г ибиотику можно использовать в качестве оценки интенсивности стеринообразов»ния.
Обнаружены различные механизмы регулирования биосинтеза етєринов: ретроингибирование и ньспеці 'ическое С24-метилирование . ериновых молекул. Впервые показано, что регуляция биосг теза по принципу обратной связи происходит на уровне циклического предшественника ланостерина и осуществляется эргостерином и зимостерином. Предложен способ селективного выделения мутаций, влияющих на интенсивность стеринового биосинтеза. Установлены закономерности образования и накопления различных стеринов при ферментации дрожжей в периодической культуре, выявлена связь стеринообразования с ростом дрожжей.
Практическая значимость. результаты фундаментальных исследований биосинтеза ст-ринов явились основой универсаль-гой схемы селекции продуцентов различных стеринов, применение которой позволило отобрать уникальные продуценты различных стеринов, многие из которых не имеют зарубежных аналогов. Внедрение этих продуцентов в производство значительно расширит ассортимент продуктов стероидной природы для нужд медицины и сельского хозяйства. Микробиол< ическии способом можно получать: зимостерин (А.С.1450^69, 1531478), фекосте-рин (А.С. 1360198, 1446921, 1S38514), эргоста-7,22-ДИ-ен-3|}-ол (А.С. 1347464, 1445182, 16125""?, ПОЛ.реш. ПО заявке N 46441792/13), эргоста-5,7-ДИен-Зр-ол (А.С. 1267785, 1378369), ХОЛеста-7,24-диеН-Э&-ол (А.С.1510364, 158617В), 4,14-диметилэг>госта-8,24(28)-диен-Зр-ол (А.С. 1С 4334), хо-лєста-5,7,24-триєн-3[5-ол и холеста-5,7,22,24-тетраен-3{5-ол (А.С.1391098, 1496262, 178^72), а также сквален (А.С. 1586179). Выделен и защищен патентом штамм Sacch.cerevisiae - новый продуцент эргостеринл (Патент РФ SU 1828566 A3).
Важной частью работы явился продуцент аналогов провитамина D3 (А.С.135293/,1499915). Этот штамм стал основой для разработки нового кормового препарата витамина D3, который в настоящее время находится в стадии внздрения в производство (пол.реш.по заявке N4950047/13). На основании изучения биохимии и физиологии продуцента совместно с сотрудниками ВНИИ-Гидролиз, ХБО РАН и спбАВМ созданы опытно-проиышленннй регламент и опытная установка по производству кормового препарата. Производственные испытания препарата на птицефабриках показали значительный экономический эффект. В 1991 г. данная разработка была отмечена Золотой медалью ВДНХ.
Разработанная в . диссертации методология исследования биосинтеза стеринов у дрожжей может быть рекомендована для других микроорганизмов, а также растений и животных.
Место проведения,работы. Работа выполнялась до 1989 г. на кафедре молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (зав.каф.,д.х.н. проф.Гинак А.И.), затем во ВНИИгидролиэ (директор, д.т.н., проф.Шаповалов О.И.). Часть экспериментов проводилась совместно с д.х.н., проф.Вьюновым К.А., при соруководстве с которым подготовлено четыре кандидатских диссертации. Ряд результатов был получен студентами Сак т-Петербургского Казанского госуниверсигетов, СП6ТИ в ходе выполнении курсовых и дипломных работ под руководством соискателя. Отдельные фрагменты исследований осуществлены совместно с сотрудниками института биологии АН Латвии, ГНИТИАФ, ИБФМ РАН, ЦРБС АН Украины. Основные результаты п тучены в соавторстве с огород-никовой Т.Е., Дурасовой Е.Н., Жаковской З.А., Синицкой Н.А.,Орловым А.И., Камиловой Т.А., Ехваловой Т.В., Андреевым А.В., Сороколетовой Е.Ф., Хромовым-Борисовым Н.Н. Разработка кормового препарата витамина D3, его испытание и подгс :овка к внедрению.осуществлялась совместно с сотрудниками СПбАВМ, ВНИИГидролиэ, ХБО РАН, СПбТК И ГНИТИАФ.
Апробация работы И публикации: Результаты исследований были представлены на: конференции нолодых ученых "Микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ" (Рига, 1984); III Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Рига, 1984): V Всесоюзной конференции по аналитической химии органичс их соединений (Москва, 1984); Всесоюзной конференции "Контроль и у; авлениг биотехнологи- : ческими процессами" (Горький, 1985); Всесоюзном симпозиуме "Инструментальные методы исследования о биохимии и физиологии" ( ^нинград, 19S5); Всесоюзной конференции "Перспективы полу"-чия новых лекарственных препаратов с помощью биотехнологии" (Москва, 1985); секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" МНТМ при ГКНТ (Орджоникидзе, 1986; Киев, 1988); V съезде ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Москва, 1987); Всесоюзной конференции "Биосинтез вторичных метаболитов" (Пущино, 1987); V Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических реактивов (Рига, 1987); XHth International specialized synposium of yeast: Genetics of nonconventlonal yeast (Weimar, 1987); Всесоюзном совещании "Метаболизм липидов эукариотических микроорганизмов" (Пущино, 1988); VII съезде Украинского микробиологического общества (Черновцы, 1989); Всесоюзной конференции (Пущино, 1989) ^международном симпозиуме "Строение, гидролиз и биотехнология растительной биомассы" ( Санкт-Петербург,1992); International conference "Biotechnology St.Petersburg'94". (St.Petersburg,1994); съезде ВОГиС (Саратог,1994). По теме диссертации опубликовано 54 работы, получены: патент, 2 пол.реш. по заявке на патент, 21 авторское свидетельство ка изобретение.
Объем и построение работы. Диссертация состоит из введения, восьми глав (обзор литературы, материалы и методы, пять глав результатов исследований, обсуждение) и выводов обтим объемом 318 страниц мааинописного текста. В работу входит 29 рисунков и 44 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 539 наименований.