«Создание новых систем доставки противоопухолевых препаратов и исследование их эффективности in vitro и in vivo» Никольская Елена Дмитриевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания занимают второе место по числу смертности. На сегодняшний день лечение опухолевых заболеваний осуществляется по утвержденным протоколам, учитывающим тип новообразования, локализацию и стадию заболевания. Основную составляющую лечения представляет химиотерапия, в которой используется более 50 противоопухолевых лекарственных препаратов (ПП). Определенная группа лекарственных соединений действует зачастую на один тип опухоли или е морфологический вариант, что подчеркивает значимость ПП каждой подгруппы и их незаменимость между собой. Одним из существенных недостатков лечения онкологических больных с помощью химиотерапии является высокая токсичность ПП по отношению к нормально-функционирующим клеткам и тканям организма, что способствует возникновению лекарственной устойчивости.

Данным проблемам уделяют большое внимание во всем мире. Использование новых
системы доставки ПП позволит добиться снижения неспецифической токсичности, а также,
частично или полностью, преодолеть лекарственную устойчивость. В последние годы доставка
лекарств в опухолевые клетки с использованием нанотехнологий стала эффективной стратегией в
лечении онкологических заболеваний. Широко используемым полимером в лекарственных
препаратах является сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA). Известно большое
количество фармацевтических субстанций, инкапсулированных в PLGA. Главными

преимуществами частиц PLGA как систем доставки является пролонгированная, контролируемая и направленная доставка химиотерапевтических препаратов, что увеличивает их терапевтическую эффективность, снижая при этом риск возникновения побочных эффектов, связанных с токсичностью лекарственного препарата.

Одним из наиболее часто применяемых подходов повышения селективности действия ПП в составе систем доставки является создание адресных систем, включающих в свой состав векторные молекулы. Помимо увеличения селективности действия таких систем, использование векторных молекул позволяет частично преодолеть множественную лекарственную устойчивость клеток (МЛУ), поскольку интернализация опухолевыми клетками зачастую происходит за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза. На сегодняшний день активно развиваются направления исследований, в которых рассматриваются опухолево-специфичные антигены в качестве мишеней для диагностики опухолевых заболеваний и лигандов, взаимодействующих с ними, для создания направленных систем доставки лекарственных средств. В качестве одного из таких лигандов может выступать альфа-фетопротеин (AFP) – гликопротеин человека, участвующий в транспорте жирных кислот и эстрогена в фетальном периоде, а также его С-концевой (3-й) домен (AFP3D), способный связываться с рецепторами AFP. Важно отметить, что рецепторы AFP

^* Список сокращений: ПП – противоопухолевый препарат; AFP - альфа-фетопротеин человека; AFP3D - С-концевой (3-й) домен альфа-фетопротеина человека; Alb - альбумин человека; PLGA - сополимер молочной и гликолевой кислот; W - общее содержание активного вещества в полимерных частицах; TMZ - темозоломид, Dtx - доцетаксел, CPt - карбоплатин, DNR – даунорубицин; DM – дактиномицин; IC₅₀ – концентрация, соответствующая гибели 50% клеток; ТРО - торможение роста опухолей; СПЖ - средняя продолжительность жизни животных; УСПЖ – увеличение средней продолжительности жизни животных; LD₅₀ – доза, соответствующая гибели 50% животных; ДСР – спектроскопия динамического рассеяния света; ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия; СЭМ -сканирующая электронная микроскопия; ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия; АСМ - атомно-силовая микроскопия; МЛУ - множественная лекарственная устойчивость; КД – круговой дихроизм; ИФА – иммуноферментный анализ.

экспрессируются в значительных количествах на поверхности 90% линий опухолевых клеток и практически отсутсвуют на нормальных клетках.

Создание новых систем доставки ПП, обладающих адресным действием, может способствовать повышению селективности действия, снижению общей токсичности, а также увеличению противоопухолевого эффекта используемых в настоящее время в клинической практике лекарственных препаратов.

Цель исследования. Создание новых систем доставки противоопухолевых препаратов и исследование их эффективности in vitro и in vivo.

Задачи исследования.

1. Разработать методы получения субмикронных частиц PLGA,
содержащих противоопухолевые препараты (темозоломид, доцетаксел, карбоплатин,
даунорубицин и дактиномицин).

2. Провести анализ физико-химических характеристик полученных субмикронных
частиц, содержащих темозоломид, доцетаксел, карбоплатин, даунорубицин и дактиномицин,
на основе PLGA.

1. Исследовать эффективность in vitro и in vivo полученных субмикронных частиц PLGA в качестве систем доставки противоопухолевых препаратов (темозоломида, доцетаксела, карбоплатина, даунорубицина и дактиномицина).

2. Разработать и оптимизировать биотехнологический метод получения рекомбинантного альфа-фетопротеина (rAFP) и его функционального фрагмента (rAFP3D).

5. Разработать метод получения адресных систем доставки на основе частиц PLGA и
белковых векторных молекул. Провести анализ полученных адресных систем доставки.

6. Исследовать эффективность полученных адресных систем доставки, содержащих
противоопухолевые препараты, in vitro и in vivo.

Научная новизна работы.

Были разработаны и оптимизированы методы получения полимерных частиц, содержащих доцетаксел, темозоломид, даунорубицин, дактиномицин и карбоплатин, позволяющие получать частицы размером менее 300 нм, состав полимерной композиции является уникальным и не встречающимся в литературных источниках. Был разработан способ очистки полимерных частиц с использованием гель-эксклюзионной хроматографии. Исследовано влияние типа сополимера молочной и гликолевой кислот на общее содержание препарата и его степень сорбции, обнаружена корреляция величины константы связывания и образование комплекса полимер-вещество со скоростью высвобождения субстанций из состава частиц.

Была разработана схема получения конъюгата полимерных частиц с белковыми векторными молекулами, позволяющие сократить время реакции без снижения эффективности и уменьшения выхода целевого продукта. Применение rAFP и rAFP3D позволяет получать высокоэффективные системы доставки противоопухолевых препаратов непосредственно в опухолевые клетки и ткани с минимальным токсическим действием на нормальные клетки. Данный способ конъюгации является новым, а полученные конъюгаты уникальными. Данный метод позволяет получать адресные системы доставки различных противоопухолевых препаратов для лечения большого количества злокачественных новообразований, поскольку эффективность и избирательность их действия была доказана в различных экспериментах in vitro и in vivo.

Практическая значимость работы.

Были оптимизированы методы получения рекомбинантных белков. В результате был увеличен выход rAFP3D до 80 мг с 1 литра культуры, упрощен метод рефолдинга и концентрирования белка. Были подобраны условия проведения очистки и выделения rAFP, позволяющие проводить процесс в одну стадию, достигая при этом чистоты конечного продукта не менее 95%.

Разработанные методы получения полимерных частиц, содержащих доцетаксел, темозоломид, даунорубицин, дактиномицин и карбоплатин, позволяют получать до 500 мг лиофилизата частиц за 1 лабораторно-технологический цикл с сохранением всех физико-химических характеристик полученных частиц. Был получен патент на изобретение, содержащий способ получения и состав полимерной композиции для частиц, содержащих доцетаксел.

Разработанную технологию синтеза конъюгата полимерных частиц и белковых векторных молекул, в частности rAFP и rAFP3D, можно полностью автоматизировать и легко масштабировать. Были подобраны условия по сокращению времени реакции до 1 ч. Была показана противоопухолевая эффективность полученных конъюгатов и селективность их действия в отношении опухолевых клеток. Был получен патент на изобретение, содержащий технологию получения конъюгата полимерных частиц с белковыми векторными молекулами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработаны эффективные технологические методы получения субмикронных частиц PLGA, содержащих противоопухолевые препараты (темозоломид, доцетаксел, карбоплатин, даунорубицин и дактиномицин).

2. Проведен анализ физико-химических характеристик полученных субмикронных частиц PLGA, содержащих темозоломид, доцетаксел, карбоплатин, даунорубицин и дактиномицин.

3. Биологические исследования продемонстрировали увеличение эффективности
темозоломида, доцетаксела, карбоплатина, даунорубицина и дактиномицина, входящих в состав
субмикронных систем доставки в виде частиц PLGA.

4. Разработан и оптимизирован биотехнологический метод получения rAFP и rAFP3D.

5. Разработан метод получения адресных систем доставки на основе частиц PLGA и
белковых векторных молекул. Проведен анализ их физико-химических свойств.

6. Доказано избирательное действие полученных адресных систем доставки, содержащих
противоопухолевые препараты, на опухолевые клетки и увеличение эффективности в сравнении с
немодифицированными препаратами in vitro и in vivo.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XX Курчатовской молодежной научной школе (Россия, Москва, 2012), Первой Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Россия, Москва, 2012), Международной конференции «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2013), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Медико-биологические аспекты химической безопасности» (Россия, Санкт-Петербург, 2015), X Международной конференции молодых учных по химии “Менделеев-2017 (Россия, Санкт-Петербург, 2017), 21-й Международной Пущинской Школе-конференции Молодых Учных "Биология - наука 21 века" (Россия, Пущино, 2017).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 8 статей в реферируемых научных журналах, 9 тезисов докладов на российских и международных конференциях, получено 2 патента.

Личный вклад автора. Постановка цели и задач исследования, обобщение литературных данных, проведение научных экспериментов и оценка полученных результатов, подготовка и написание научных статей в соавторстве выполнены лично автором.

Структура и объм диссертации. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, описания методов исследования, заключения, выводов и списка литературы, который включает 171 источник. Диссертация содержит 87 рисунков и 24 таблицы.