Содержание к диссертации
Введение
1. Список сокращений 6
2. Введение 9
3. Обзор литературы 11
3.1. Липосомы 12
3.1.1. Липосомы для доставки лекарств в противораковой терапии 13
3.1.2. Липосомы для доставки лекарств в антибактериальной терапии 19
3.1.3. Липосомы в генной терапии 28
3.2. Наночастицы на основе полисахаридов 34
3.2.1. Ковалено сшитые наночастицы (КСН) на основе полисахаридов 36
3.2.2. Ионно сшитые наночастицы (ИСН) на основе полисахаридов 36
3.2.3. Полисахаридные наночастицы на основе полиэлектролитных комплексов (ПЭК) с
хитозаном 39
3.2.4. Наночастицы на основе самосборки гидрофобных модифицированных полисахаридов 3.3. Дендримеры 53
3.3.1. Использование дендримеров при трансдермальной доставке ЛС 54
3.3.2.Использование дендримеров при пероральной доставке ЛС 55
3.3.3. Использование дендримеров при доставке лекарств в глаз 58
3.3.4. Использование дендримеров при целевой доставки ЛС 58
3.3.5. Дендримеры при доставке генов 59
3.4. Гидрогели
3.4.1. Наногели на основе хитозана 61
3.4.2. Наногели на основе альгината 65
3.4.3. Наногели на основе поливинилового спирта (ПВС) 67
3.4.4. Наногели основе полиэтиленоксида и полиэтиленимина 68
3.4.5. Наногели на основе поливинилпирролидона (ПВП) 69
3.4.6. Наногели на основе других источников 70
3.5. Другие наночастицы для доставки лекарств 71
3.5.1. Магнитные наночастицы 71
3.5.2. Золотые наночастицы (Au-НЧ) 74
3.5.3. Углеродные наноматериалы 75
3.5.4. Полимерные мицеллы (ПМ) 77
3.5.5. Наноструктуры на основе кремнеземных материалов (КМ) 77
3.6. Некоторые результаты исследований наноструктур для транспорта ЛС на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии (Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова –МИТХТ) 80
4. Результаты и обсуджения 92
4.1.Сферические аморфные наночастицы из смеси тритерпеноидов бересты и возможность их использования для доставки лекарственных препаратов 92
4.2.Влияние холестерил гемисукцината на стабильность САНЧ 94
4.3. Сферические аморфные наночастицы в качестве носитетелей мезо-арилпорфиринами, моделей для фотодинамической терапии рака 96
4.3.1. Гидрофобные производные порфиринов 96
4.3.2. Получение нанодисперсий 98
4.3.3. Определение размера наночастиц
4.3.4. Определение дзета-потенциала () 99
4.3.5. Исследование морфологии наночастиц 100
4.3.6. Оценка возможности загрузки САНЧ с порфиринами и стабильности дисперсии 101
4.4. Сферические аморфные наночастицы (САНЧ), загруженные радиозащитном веществом генистеином 105
4.4.1. Исследования радиозащитной эффективности генистеина 105
4.4.2. Получение и изучение характеристик нанопрепарата САНЧ с генистеином 111
4.4.3. Оценка радиозащитной эффективности нанопрепарата САНЧ с генистеином 112
4.4.3.1.Оценка радиозащитной эффективности нанопрепарата САНЧ с генистеином при профилактическом применении 113
4.4.3.2. Оценка радиозащитной эффективности нанопрепарата САНЧ с генистеином при терапевтическом применении препарата 115
4.4.3.3. Определение степени выраженности радиозащитной эффективности нанопрепарата САНЧ с генистеином 118
4.4.4. Оценки токсичности нанопрепарата САНЧ с генистеином 119
4.4.4.1.Определение острой токсичности нанопрепарата САНЧ с генистеином при внутрибрюшинном пути введения 120
4.4.4.2.Определение острой токсичности нанопрепарата САНЧ с генистеином при пероральном пути введения 122
4.4.4.3. Определение острой токсичности нанопрепарата САНЧ с генистеином при подкожном пути введения 124
4.4.4.4.Оценка острой токсичности нанопрепарата САНЧ с генистеином при повторном внутрибрюшинном пути введения 127
4.5.Сферические аморфные наночастицы (САНЧ), загруженные противоэпилептическим препаратом карбамазепином 129
4.5.1.Фармацевтические свойства карбамазепина 129
4.5.2.Получение и изучение физико-химических характеристик нанодисперсии САНЧ с
карбамазепином 132
5.Экспериментальная часть 135
5.1. Материалы и методы 135
5.2. Получение САНЧ 136
5.3. Получение САНЧ с холестерил гемисукцинатом 136 5.4.Получение САНЧ с мезо-арилпорфирилнами 136
5.5. Получение САНЧ c генистеино м 137
5.6. Получение САНЧ с карбамазепином 138
5.7. Биологические испытания САНЧ с генистеином 138
6. Заключение 139
7. Список литературы
- Липосомы для доставки лекарств в антибактериальной терапии
- Использование дендримеров при доставке лекарств в глаз
- Сферические аморфные наночастицы в качестве носитетелей мезо-арилпорфиринами, моделей для фотодинамической терапии рака
- Определение острой токсичности нанопрепарата САНЧ с генистеином при подкожном пути введения
Липосомы для доставки лекарств в антибактериальной терапии
Авторами Shabbits и Mayer [10] были разработаны липосомы на основе природного липида – церамида в качестве новых противоопухолевых агентов и содержащие в своем составе достаточно большой процент природного липида – церамида. Такие липосомы показали значительную противоопухолевую активность на модели асцитной опухоли J774 в экспериментах in vivo. Ozpolat и соавт. [11] в своем исследовании также показали, что при внутривенной инъекции липосом, содержащих транс-ретиноевую кислоту (ТРК) (рис. 6), наблюдалась повышенная концентрация ТРК в плазме. ТРК с такими благоприятными фармакокинетическими характеристиками может быть эффективным средством при лечении острого промиелоцитарного лейкоза или других видов рака.
Цисплатин (CDDP) (рис. 7) является одним из наиболее эффективных химиотерапевтических агентов, используемых для внутривенного введения при лечении рака яичников, легких, мозга и опухоли шеи [12–14]. Кроме того, CDDP широко используется в лечении перитонеального карциноматоза при внутрибрюшинном способе введения. Использование CDDP в указанных случаях демонстрирует достаточно высокую эффективность при лечении больных, при этом позволяя решать проблемы, связанные с токсичностью. Аналогично другим гидрофобным противораковым соединениям, были проведены исследования эффективности доставки липосомальных структур с CDDP, которые показали положительные результаты в преодолении недостатков и улучшении фармацевтической эффективности традиционных форм препарата.
Такой липосомальной препарат был назван CDDP-Lip. Далее, на основе полученного CDDP-Lip, авторы предложили включить на поверхность липосом молекулы тетрасахарида, который обычно прикрепляется к О-гликанам на поверхности клеток и играет важную роль в процессе клеточного распознавания (Sialyl LewisX) для получения второго препарата с названием CDDP-SLX-Lip. Были произведены биологические испытания с введением CDDP-Lip и CDDP-SLX-Lip мышам с опухолью A549. Полученные результаты показали, что при использовании CDDP-SLX-Lip, коэффициент выживаемости достиг 75% спустя 14 дней. Уменьшение массы тела мышей в испытательном процессе было незначительным. Гистологические аномалии также не выявились. При этом накопление CDDP-SLX-Lip в опухолях было примерно в 6 раз больше, чем CDDP-Lip или свободной CDDP. Таким образом, авторы сделали вывод, что использование препарата CDDP-SLX-Lip приводит к лучшей противоопухолевой активности по сравнению с CDDP-Lip, а также значительно уменьшает токсичности в нормальных тканях.
Долгоциркулирующий липосомальный препарат с названием Lipoplatin на основе CDDP, состоящий из смеси соевого фосфатидилхолина, дипальмитоил-фосфатидилглицерина, холестерина и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина-N [амино(полиэтиленгликоль)-2000] был получен в работе [16]. Данный препарат был разработан с целью уменьшения токсичности CDDP при одновременном улучшении противоопухолевой активности по отношению к первичными опухолям и метастазам за счет повышения времени циркуляции ЛС в жидкостях и тканях организма. Исследования цитотоксической способности Lipoplatin были выполнены на раковых клеточных линиях, происходящих из немелкоклеточного рака легкого, почки и нормальных кроветворных клеток предшественников. Lipoplatin, по сравнению со свободным CDDP, оказывает более сильное цитотоксическое действие на раковых клеточных линиях, а также проявляет более низкую токсичность в нормальных стволовых клетках костного мозга [17].
В работе [18], Boulikas и соавт. исследовали гипотезу, что внутривенное введение Lipoplatin может привести к избирательному поглощению в опухолях при клинических испытаниях. Определение уровня платины в опухолях и нормальных тканях показало, что Lipoplatin может преимущественно накапливаться в злокачественных тканях (в 10-50 раз больше) первичного и метастатического происхождения по сравнению с нормальными тканями после внутривенного введения пациентам. Двухстадийное исследование было выполнено с целью проверки максимально переносимой дозы (МПД) и ограничивающей дозу токсичности (ОДТ). Первые испытания были проведены с использованием комбинации Lipoplatin и гемцитабина (рис. 8) у больных с раком поджелудочной железы, которые в предшествующей химиотерапии не получили терапевтический эффект от гемцитабина. Полученные результаты показали отсутствие нефротоксичности после сочетанного использования Lipoplatin в дозах 100 мг/м2 (МПД) и 125 мг/м2 (ОДТ) и гемцитабина в дозе 1000 мг/м2. Однако, при использовании повышенной дозы Lipoplatin, в ходе исследования МПД (стадия I) проявлялись такие симптомы как : тошнота, рвота, усталость, диарея, нейротоксичность и тромботические осложнения, а при изучении ДОТ (стадия II) проявлялась нейтропения. Таким образом, МПД и ДОТ для Lipoplatin в комбинации с гемцитабином (1000 мг/м2) составили соответственно 100 и 125 мг/м2.
Для лечения немелко клеточного рака легкого, в работе [19] Lipoplatin и гемцитабин также были совмещены и использованы в различных терапевтических схемах : Lipoplatin в 2 дозе 120 мг/м (использовали на 1, 8 и 15 день) и гемцитабин в дозе 1000 мг/м (использовали на 1 и 8 день). Полученные результаты были положительными в отношении лекарственного ответа у пациентов – 31.7 % (больше чем у пациентов, которых лечили с вариантом комбинации CCDP и гемцитабина – 25.6%). Кроме того, использование Lipoplatin также показало пониженную нефротоксичность по сравнению с СDDP в свободной форме.
В работе [20], Farhat и соавт. исследовали совместное использование Lipoplatin и винорелбина (рис. 9) в лечении HER2/Neu-отрицательного метастатического рака молочной железы. Клинические испытания на пациентах показали хорошую фармацевтическую эффективность лекарства с полным ответом у 9.4% пациентов, частичным ответом у 43.8% пациентов, стабилизацией заболевания у 37.5% пациентов и прогрессирующим заболеванием у 9.4% пациентов. Кроме того, при исследовании не была обнаружена нейротоксичность и нефротоксичность.
Использование дендримеров при доставке лекарств в глаз
Присутствие в гидрофильных полимерных цепях гидрофобных фрагментов обуславливает их возможность к самоорганизации в водных средах. Когда гидрофильные полимерные цепи соединяются с гидрофобными сегментами, тогда образуются амфифильные сополимеры. При контакте с водной средой амфифильные полимеры самопроизвольно образуют мицеллы или мицеллоподобные агрегаты через внутри- или межмолекулярные связи между гидрофобными остатками. Полимерные мицеллы обладают уникальными характеристиками в зависимости от гидрофильных/гидрофобных составов, такими как необычные реологические свойства, небольшой гидродинамический радиус, и термодинамическая устойчивость. Также, полимерные мицеллы были признаны в качестве перспективного носителя для доставки ЛС и могут быть использованы в качестве консерванта для различных гидрофобных лекарственных средств.
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) широко используется в фармацевтических и биомедицинских областях из-за его превосходных физико-химических и биологических свойств, таких как гидрофильность, растворимость, нетоксичность, легкая химическая модификация и отсутствие антигенности и иммуногенности. ПЭГ также часто используется в качестве растворимого полимерного модификатора в органическом синтезе и в качестве фармакологического полимера с высокой гидрофильностью, биосовместимостью и способностей к биоразложению. Использование ПЭГ является идеальным вариантом для профилактики бактериального поверхностного роста, снижения белкового плазматического связывания, агрегации эритроцитов и предотвращение от опознавания клетками иммунной системы. В последние годы, многими исследователями был изучен комплекс ПЭГ-г-хитозан. Так, например Yoksan и соавт. [98] получили комплекс ПЭГи мети лового эфи ра (ПЭМЭ) с цепью N-фталоил-хитозана. Такие привитые сополимеры были использованы для получения сферообразных НЧ. Когда длина цепи ПЭМЭ выше чем 5 103 Да, размер наносфер становится малым (80-100 нм).В результате регулировки гидрофобности/гидрофильности хитозановых цепей, могут быть получены стабильные наносферы. Jeong и соавт. [99] синтезировали комплекс метокси-полиэтиленгликоль - хитозан для разработки полимерных мицелл с целью доставки лекарственных препаратов к опухолям головного мозга. Такие мицеллы инкапсулировали транс-ретиноевую кислоту на основе полианионного комплексообразования. Эффективность загрузки мицелл для всех композиций была выше 80% (w/w). В другом исследовании Park и соавт. [100] обнаружили, что НЧ, инкапсулированные транс-ретиноевой кислотой были более эффективными в ингибировании инвазии опухолевых клеток по сравнению с использованием свободной транс-ретиноевой кислоты.
Yang и соавт. [101] синтезировали конъюгаты на основе комплекса метокси-поли этиленгликоля/хитозана с соединением с формальдегидом. Критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) конъюгатов в воде составила 0.07 мг/мл. Конъюгаты формировали монодисперсные самоагрегируемые наночастицы со сферической формой и средним диаметром 261.9 нм. Плохо растворимый противораковый препарат в воде – метотрексат (рис. 33) был инкапсулирован внутрь НЧ. Рис. 33. Структура метотрексата.
Opanasopit и соавт. [102] синтезировали амфифильные сополимеры на основе соединения N-фталоил хитозана с ПЭМЭ. Сополимеры образовывали мицеллоподобных НЧ с ККМ в воде 28 мк/мл. Наночастицы имели сферическую форму с размером в диапазоне 100-250 нм. В качестве модельного лекарственного средства в ядро мицелл был загружен камптотецин (рис. 34).
Некоторые длинноцепочечные жирные кислоты, такие как гексановая, декановая, линолевая, линоленовая, пальмитиновая, стеариновая, олеиновая кислоты были также использованы для модификации полисахаридов. Choisnard и соавт. [103] синтезировали деканоат - циклодекстриновый эфир (ДЦ 2-7) и гексаноат -циклодекстриый эфир (ДЦ 4-8) из коренного -циклодекстрина и винилгексаноата или винилдеканоата с помощью биокатализатора термолизина. НЧ формировались из обоих эфиров по методу наноосаждения. В другом исследовании Chen и соавт. [104] модифицировали хитозан путем соединения с линолевой кислотой через опосредованную реакцию с 1-этил-3-(3-диметиламино пропил) карбодиимидом для повышения его амфипатичности. Образование мицелл на основе этого модифицированного хитозана в растворе 0,1М уксусной кислоты усиливалось эмульгированием (o/w) масляной фазы с метиленхлоридом. Концентрация самоагрегации была от 1 г/л до 2 г/л. Добавление 1М раствора NaCl могло ускорять самоагрегацию молекул модифицированного хитозана. Мицеллы образовывали наноразмерные частицы с размером в диапазоне от 200 до 600 нм. Такие НЧ затем инкапсулировали модельный растворимый липидный компаунд и ацетат ретинола с эффективностью 50%.
Jiang и соавт. [105] синтезировали водорастворимый N-пальмитоил хитозан, способный образовывать мицеллы в воде. Такие молекулы образовывались при обработке хитозана пальмитиновым ангидридом в диметилсульфоксиде. Степень замещения N- пальмитоила хитозана находилась в диапазоне 1.2-14.2 %, а ККМ мицелл на основе N-пальмитоила хитозана была в диапазоне от 2x103 до 37.2x103 мг/мл. Степень загрузки гидрофобного модельного лекарственного средства ибупрофена (рис. 35) ( нестероидный противовоспалительный препарат) в мицеллах была примерно 10% (w/w). Высвобождение лекарства сильно зависило от рН и температуры. При низком рН и высокой температуре, скорость высвобождения ЛС заметно ускорялась.
Hu и соавт. [106] синтезировали комплекс стеариновой кислоты с олигосахаридом хитозана с помощью 1-этил-3-(3- диметиламинопропил)карбодиимида. ККМ мицелл, образующихся из данного сополимера составила около 0.06 мг/мл. Для повышения устойчивости мицелл в испытаниях in vivo и контроля высвобождения ЛС, оболочки мицелл были сшиты глутаральдегидом. В качестве модельного ЛС для включения в мицеллы был использован паклитаксел. При этом была выявлена высокая эффективность загрузки препарата (выше 94%).
Zhang и соавт. [107] разработали самоорганизующиеся НЧ на основе хитозана, модифицированного олеиновой кислотой со средним диаметром 255.3 нм. Уровень гемолиза наночастиц также находился в допустимом пределе (5%). Использование наночастицы не проявило цитотоксичность на эмбриональных мышиных фибробластах. Следовательно, противораковое средство - доксорубицин было загружено в наночастицы с эффективностью загрузки 52.6%. Препарат быстро высвобождался из наночастиц при рН 3.8 , в то время как при рН 7.4 высвобождение было медленнее.
Сферические аморфные наночастицы в качестве носитетелей мезо-арилпорфиринами, моделей для фотодинамической терапии рака
Высвобождение лекарственных средств из углеродных нанотрубок может быть контролировано. Для предотвращения нежелательного высвобождения ЛС, 2 открытых конца УНТ были закупорены полипиррольными пленками [176]. Приводный агент (фолиевая кислота) и эпидермальный фактор роста были присоединены к УНТ для улучшения селективности транспортных лекарственных систем.
Токсичность углеродных наноматериалов также зависит от их уникальной определенной геометрической структуры. Потенциал токсичности углеродных нанотрубок является результатом отношения между длиной и диаметром, а также токсичностью использованного материала (часто является графитом). Кроме того, некоторые примеси, такие как металлы и аморфные углероды также могут вызывать повышение активных кислородных форм (АКФ), и таким образом, вызывает окислительный стресс в клетках. Недавние исследования указали на сходные проблемы с канцерогенным потенциалом УНТ. Углеродные нанотрубки, как было показано, вызывают некроз или апоптоз с клеточными линиями и изменение морфологии клеток макрофагов. Radomski и соавт. [177] изучали влияние инженерных углеродных наночастиц (МСУНТ и ОУНТ) на агрегацию тромбоцитов человека в условии in vitro и сосудистый тромбоз крыс в условии in vivo. Инкубация тромбоцитов с углеродными наноматериалами вызвала агрегацию тромбоцитов с малым высвобождением. Инкубация бронхиальных эпителиальных клеток и кератиноцитов с высокой дозой ОУНТ привела к окислительному стрессу, генерации АКФ, липидному перекисному окислению и митохондриальной дисфункции. Кроме того, немодифицированные МСУНТ вызвали провоспалительный ответ в клеточных линиях кератиноцитов, высвобождение цитокина интерлейкин-8 (ИЛ-8) и образование цитоплазматических вакуолей.
Полимерные мицеллы (ПМ) образуются когда амфифильные поверхностно-активные вещества или полимерные самопроизвольные молекулы ассоциируются друг с другом в водной среде с образованием структуры ядро-оболочка. Внутреннее ядро мицеллы является гидрофобным, и окружается оболочкой из гидрофильных полимеров, таких как ПЭГ . Гидрофобное ядро ПМ является резервуаром для плохо-водорастворимых и амфифильных лекарственных средств. В то же время гидрофильная оболочка ПМ стабилизирует ядро, продлевает время циркуляции в крови и увеличивает накопление в опухолевых тканях. До сих пор, большое количество различных лекарственных видов были включены в ПМ путем либо физической инкапсуляции, либо ковалентного присоединения. Genexol-PM, ПЭГ-поли (Д,Л- лактид) были использованы для получения ПМ, загруженных паклитакселом. Результаты испытаний in vivo у мышей показали, что при максимальной переносимой дозе, фармацевтическая эффективность мицеллярного препарата увеличилась в три раза и уровень распределения также увеличился в два-три раза по сравнению с активностью свободного паклитаксела в различных тканях опухолей. Результаты клинических испытаний на пациентах и показали, что использование паклитаксела в мицеллярной форме на основе Genexol-PM было более преимущественным чем свободный паклитаксел и не оказало токсичности [178]. В последнее время, было разработано ряд новых мицеллярных систем на основе самоорганизующего сополимера гиалуроновой кислоты - октадецила и конъюгата фолиевой кислоты - октадецила. Паклитаксел был успешно инкапсулирован в данные полимерные мицеллы с высокой эффективностью загрузки 97.3%. Таким образом, мицеллы с биосовместимостью и специфическим нацеливанием к раковым клеткам становятся перспективными наноструктурными носителями для доставки гидрофобных противоопухолевых препаратов.
Кремнеземные материалы (КМ) также используются в лекарственных транспортных систем. КМ классифицируются как ксерогели и мезопористые кремнеземые наночастицы (МКН) (например МСМ-41 (Mobil Composition of Matter) и SBA- 15 (Santa Barbara University mesoporous silica material). КМ обладают несколькими преимуществами, такими как: высокая пористая структура и легкая функционализация. Среди неорганических наночастиц, КМ являются носителями, которые чаще всего используются для биологических целей.
Кремнеземные ксерогели (КК) являются аморфными структурами с высокой пористостью и большой площадью поверхности. Пористая структура (форма и размер пор) зависит от параметров синтеза. Метод золь-гель часто используется для формирования КК. Изменение условий синтеза, например, соотношения реагентов, температуры, концентрации катализатора позволяет изменять свойства ксерогелей, используемых при контролируемом высвобождении лекарственных средств. Фенитоин, метронидазол, нифедипин, диклофенак и гепарин являются примерами лекарственных средств, которые были загружены в ксерогели с помощью этого метода (рис. 57).
Наиболее известные виды мезопористых кремнеземных наноматериалов (МКН) являются МСМ-41 с гексагональным расположением мезопор и SBA-15 с хорошей упорядоченной гексагональной соединённой системой пор [179]. МКН, по сравнению с ксерогелями, имеют более однородную структуру, низкую полидисперсность и большую площадь поверхности для адсорбции терапевтических или диагностических агентов. Механизм загрузки лекарственных средств в МКН является химической или физической адсорбцией. В МКН были загружены различные виды лекарств как: противоопухолевые препараты, антибиотики сердечные препараты. Высвобождение лекарств обычно контролируется диффузией. Силикаты и МКН также представляют собой потенциальные материалы для использования в фотодинамической терапии.
Из за своих свойств, МКН являются отличным материалом для различных фармацевтических и биомедицинских применений. Структура МКН позволяет включить небольшие и большие молекулы, адсорбировать ДНК и переносить гены.
По некоторым данным, кремнеземные наноразмерные частицы (КНЧ) имеют биологическую совместимость и большой потенциал в различных диагностических и терапевтических применениях в медицине. Однако, недавние исследования показали, что использование КНЧ в условии in vitro и in vivo вызывает токсичность и побочные эффекты. Это связано с типом клеток и размером наночастиц. КНЧ влияют на генерацию окислительного стресса в клетках через образование активных форм кислорода, повышенное производство малондиальдегида, снижение уровня глутатиона, и индукцию антиоксидантных ферментов как супероксиддисмутазы (СОД) и гемоксигеназы-1 (OH-1). Предыдущие работы показали, что воздействие КНЧ при высоких концентрациях вызвало активацию NF-kB в эндотелиальных клетках [180] или Nrf-2 МАР-киназы сигнального пути в бронхиальных эпителиальных клетках человека. В работе [181] Zhao и соавт. показали влияние наночастиц (в зависимости от свойства поверхности, структуры и размера) на кровяные клетки человека (эритроциты). Поглощение больших КНЧ эритроцитами показало сильную локальную мембранную деформацию и приводило к деформации эритроцитов, интернализации частиц и возможному гемолизу. Напротив, адсорбция мелких частиц не влияла на мембрану или морфологию эритроцитов.
Размер наночастиц играет ключевую роль с проблемой токсичности. Cho и соавт.[182] исследовали влияние размера частиц КНЧ на фармакокинетические параметры (распределение в тканях и экскреция КНЧ) с различными размерами через внутривенную инъекцию у мышей. Они наблюдали возникновение воспалительного ответа в печени в течение 12 ч после введения КНЧ с размерами 200 и 100 нм. Однако этот эффект не был обнаружен с более мелкими частицами (50 нм). Все виды частиц выделялись через мочу и желчь. Наночастицы КНЧ также аккумулировались макрофагами в печени и селезенке и остались там на 4 недели после первой инъекции с разовой дозой [183].
Определение острой токсичности нанопрепарата САНЧ с генистеином при подкожном пути введения
В исследовании [233] авторы изучали радиозащитную эффективность терапевтического применения природного генистеина. Препарат в дозе 50 мг/кг вводили подкожно 7-недельным крысам линии Fisher сразу после облучения и спустя 2 недели после лучевого воздействия курсом однократно в день в течение 26 недель. При этом животные подвергались острому местному (область грудной клетки) облучению в дозе 12 Гр. Оценивали уровень провоспалительных цитокинов, секретируемых активированными макрофагами, показатели оксидантного стресса и фиброза в течение 48 недель после облучения. Показано, что генистеин снижал показатели окислительного повреждения на 50%, уменьшал активность транскрипционного фактора TGF1 на 75% и фиброза на 60-80% по сравнению с контролем.
В работе [234] проведено изучение влияния комбинированного применения природного генистеина с ингибитором иАПФ на течение и исход острой лучевой болезни у мышей линии C57BL/6J. Для моделирования радиационного поражения животных подвергали общему однократному -облучению в дозе 8.25 Гр. Генистеин в дозе 200 мг/кг в растворе ПЭГ-400 вводили подкожно за 24 ч до облучения. Каптоприл растворяли в подкисленной воде и давали животным в поилках в дозе 110 мг/кг/сут курсом в течение 30 сут после облучения, первый прием препарата осуществлялся уже спустя 1 ч после воздействия радиации. Оценку эффективности изолированного введения препаратов или их комбинации проводили по критериям 30-сут выживаемости, темпу восстановления клеток крови, клеток-предшественников гемопоэза, повреждению ДНК и продукции эритропоэтина. Показано, что в группе контроля облученных животных регистрировалась 100% летальность. Однако, изолированное введение генистеина обеспечило выживаемость 72% мышей, а каптоприла – 55%. После применения комбинации препаратов на фоне облучения выживаемость животных составила 95%. Более высокие показатели выживаемости облученных животных на фоне введения им комбинации препаратов по мнению авторов было связано со снижением радиационно-индуцированной анемии, улучшением восстановления ядерных клеток костного мозга, селезенки и циркулирующих эритроцитов. Комбинация препаратов способствовало более раннему восстановлению клеток-предшественников костного мозга: эритроидных (CFU-E и BFU-E), и миелоидный (CFU-GEMM, CFU-GM и CFU-M). Изолированное введение генистеина и в комбинации с каптоприлом способствовало защищите клеток-предшественников гемопоэза от образования в них радиационно-индуцированных микроядер, однако при изолированном применении каптоприла подобного эффекта обнаружено не было. В тоже время, применение каптоприла изолированно и в комбинации с генистеином обеспечивало подавление радиационно-индуцированную продукцию эритропоэтина. Авторы подчеркивают, что это наблюдение может иметь не только краткосрочный эффект в аспекте предотвращения быстрого истощения пула гемопоэтических клеток-предшественников, но и долгосрочный, задерживая при этом восстановление гемопоэтических клеток.
В исследовании [235] авторы изучали влияние природного генистеина на апоптоз и пролиферацию нормальных клеток у мышей с опухолью толстой кишки на фоне сеанса лучевой терапии. Раковые клетки СТ26 толстой кишки мыши (107 клеток в 100 мкл фосфатного буфера на 1 животное) подкожно вводили мышам-реципиентам линии BALB/с. В дальнейшем, для создания модели лучевой терапии рака толстой кишки мышей облучали фотонами высокой энергии в дозе 5 или 10 Гр. Животным профилактически вводили генистеин в дозе 200 мг/кг за 24 ч до радиационного воздействия. Через 12 ч после облучения в дозе 5 Гр генистеин значительно уменьшилось количество апоптотических телец в клетках крипт тощей кишки по сравнению с облученным контролем. Кроме того, у защищенных генистеином облученных животных наблюдалась увеличение Ki-67-положительных пролиферирующих клеток в криптах кишки по сравнению с контролем. А средний вес опухоли СТ26 был меньше в группе, получавшей генистеина на фоне облучения по сравнению с группой контроля.
И так, по литературным данным, генистеин обладает радиозащитной эффективностью, которая, как полагают, в значительной степени определяется сильной антиоксидантной активностью этого соединения. Эффект от применения генистеина в значительной степени зависит от времени введения препарата и его дозы. Кроме того, использование генистеина также не вызывает токсичность и побочные эффекты в исследованиях in vivo.
До настоящего времени еще не существует коммерческого препарата на основе генистеина для радиозащитной цели и широкого использования в медицине, поскольку существует еще ряд неизученных вопросов, требующих отдельного рассмотрения, например, его фармакологическая активность и потенциальная токсичность при использовании в организме человека. Кроме того, генистеин является гидрофобным соединением и практически не растворяется в воде. Это также вызывает много трудностей для разработки и получения препаратов на его основе. Следовательно, параллельно с изучением и оценкой радиозащитной эффективности генистеина в обычной форме, одним их перспективных исследовательских направлений, которое может привести к положительным результатам в плане оптимизации и повышения фармацевтической эффективности, химической устойчивости, растворимости и дисперсности генистеина, является его комбинированное использование в составе наноструктур. Таким образом, учитывая гидрофобные свойства генистеина и возможность доставки субстанции с помощью САНЧ, целью следующего раздела работы явилась получение и изучение свойств нового радиозащитного нанопрепарата на основе САНЧ с генистеином, а также оценка его биологической активности в опытах in vivo.
На основе полученных ранее результатов эффективности загрузки САНЧ с мезо-арилпорфиринами (раздел 4.3) и оптимальной используемой концентрации CНS, а также необходимой концентрации субстанции для обеспечения дозы испытаний in vivo, был предложен способ получения и изучены свойства нанопрепарата САНЧ с генистеином с концентрацией субстанции 10% (0.05мг/мл буфера) и 2% СHS (0.01мг/мл буфера) в качестве стабилизирующей добавки. Концентрация генистеина и CHS в нанопрепарате рассчитана по отношению к содержанию СТБ. Нанопрепарат был получен при диспергировании смеси, состоящей из следующих растворов: генистеина в ТГФ (1мг/мл), СТБ в ТГФ (5 мг/мл), CHS в ТГФ (1мг/мл) (в качестве стабилизатора), фосфатного буфера (10 мМ, рН 7.5). Дисперсию после перемешивания концентрировали до объема 10 мл. После частичного удаления растворителя, полученная нанодисперсия была использована для исследования физико-химических характеристик и оценки радиозащитной активности в испытаниях in vivo.
С помощью методов динамического светорассеяния, cканирующей электронной микроскопии и УФ-спектрофотометрии определяли основные параметры наноформы генистеина на основе САНЧ. Исходя из полученных данных (рис. 77) видно, что наночастицы имеют сферическую форму и обособлены друг от друга с дзета-потенциалом поверхности (-34.74 мВ), средний размер САНЧ, содержащих 10% генистеина (0.05 мг/мл буфера) и 2% СHS (0,01мг/мл буфера) составляет 137 нм. Возможность загрузки САНЧ с генистеином была подтверждена, исходя из УФ-спектра поглощения вещества в нанодисперсии при длине волны 262 нм.