Введение к работе
Актуальность темы: В течение ряда последних лет для улучшения генетического потенциала крупного рогатого скота широко применяют новый метод разведения животных - трансплантацию эмбрионов. Он позволяет получать от генетичесют выдающейся коровы-донора 20 и более эмбрионов в год. Это достигается тем, что самка освобождается от необходимости плодоношения и вырашивания потомства в послеотельный период. Кроме того, проводится стимуляция самок с целью увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекает на стадии ранних зародышей и пересаливают менее ценным в генетическом отношении реципиентам. Таким образом, при применении метода трансплантации эмбрионов можно эффективно испрльзовать высококачественных самок как доноров эмбрионов.
Важным фактором, сдерживающим широкое применение этого мето- . да в практике разведения сельскохозяйственных животных, является низкий выход эмбрионов от коровы-донора (3-4 эмбриона на одно извлечение) и высокая их стоимость вследствие дороговизны гормональных препаратов для стимуляции полиовуляции и необходимости передержки коров-доноров.
Устранение этого сдерживающего фактора ученью видят в разработке метода созревания и оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота вне организма С разработкой этого метода яичники, полученные с мясокомбината от телок и высокопродуктивных коров, выбракованных по причинам, не связанным с нарушением воспроизводительной функции, могли бы быть подходящим и дешевьм источником ооцитов. Последние можно доводить до зрелости, оплодотворять и культивировать ии витро до достижения ими такой стадии развития.
на которой возможна их пересадка.
Достижения последних лет в получении потомства крупного рогатого скота из яйцеклеток, созревших в культуре (Brackett et al., 1982, Эрнст Л. К. и др., 1983, Hanada et al. , 1986), явились подтверждением,возможности создания таких условий, которые способны обеспечить полноценное созревание по крайней мере части яйцеклеток, помещенных в культуру.
Однако эффективность получения оплодотворенных ин витро эмбрионов на стадии, пригодной для трансплантации, ещг неудовлетворительная. В большинстве лабораторий мира получение морул и блас-тоцист из оплодотворенных ин витро яйцеклеток составляет не более 20-25Z. Отсюда вытекает необходимость дальнейших исследований по совершенствованию метода оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота ин витро, включая использование новых культуральных сред и добавок к ним, культивирование на монослое с соматическими клетками, подбор спермы быков и другие.
Большим преимуществом технологии трансплантации эмбрионов является то, что полученные после трансплантации телята скорее приспосабливаются к условиям существования, что очень важно для развития скотоводства в раэвиваюшихоя странах, где необходим ценный генетический материал.
Колумбия по сравнению с другими тропическими странами имеет то преимущество, что обладает различными местными породами крупного рогатого скота, распространенными по всей территории. Эти породы хотя и представляют собой больщую ценность для будудего развития скотоводства, быстро исчезают на национального облика. Это частично обменяется недостатком внаний об их истинной генетической ценности и об их возможном вкладе в развитие скотоводства страны. Таким образом, техника получения ооцитов из яич-
- з -ников коров, условия их созревания, оплодотворения и культивирования эмбрионов могут оказаться очень полезными для моей страны и внести определенный вклад в решение задач, которые в настоящее время стоят перед специалистами в этой области.
Цель и задачи исследований. Целью работы явилось совершенствование метода культивирования оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота для их последующей трансплантации.
В процессе работы предстояло решить следующие конкретные задачи:
-
Усовершенствовать метод культивирования ранних эмбрионов коров, полученных из яйцеклеток, созревших и оплодотворенных вне организма, при совместном культивировании с монослоем эпителия яйцевода и гранулезных клеток.
-
Сравнительное изучение влияния культуральных сред и других материалов, применяемых при культивировании яйцеклеток, на га . созревание, оплодотворение и развитие ин витро.
-
Изучение индивидуальных различий между коровами-донорами и между быками-производителями по качеству гамет.
-
Получение телят после пересадки эмбрионов, полученных из созревших и оплодотворенных ин витро ооцитов.
Научная новизна работы. Продемонстрирована возможность преодоления митотического блока развития оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота на 8-16-клеточной стадии и получения высокой эффективности достижения ими стадии морулы и бластоцисты путем использования ыонослоя эпителиальных клеток яйцевода и гранулезных клеток.
Впервые показана одинаковая эффективность созревания, оплодотворения и развития ранних эмбрионов крупного рогатого скота в культуральных средах, пластиковых чашках и минеральном масле оте-
чественного и импортного производства.
. Получены новые научные факты, свидетельствующие о том, что для объективной оценки оплодотворяющей способности быка с исполь-вованием метода оплодотворения ин витро необходимо учитывать три критерия: процент дробления яйцеклеток к числу осемененных ооци-тов, скорость развития оплодотворенных ин витро яйцеклеток через двое суток после осеменения и процент эмбрионов, достигших стадии морулы и бластоцисты. Впервые выявлена вависимость скорости развития оплодотворенных ин витро эмбрионов через 44-46 часов после осеменения и дальнейшим развитием их до стадии морулы и бластоциста
Практическая значимость работы. Усовершенствование методики культивирования оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота с применением монослоя эпителиальных клеток яйцевода обеспечило получение 47.7Х морул и бластоцист к числу дробящихся яйцеклеток, что делает ее экономически целесообразной для использования в практике трансплантации змбрионов. В результате выявленной зависимости скорости развития оплодотворенных ин витро эмбрионов с процентом достижения ими стадии морулы и бластоцисты предложен метод селекции дробящихся яйцеклеток через двое суток после осеменения, позволяющий получать высокий процент (59,2 -64,ЗХ) эмбрионов, пригодных для пересадки. Предложен новый быстрый метод определения оплдотворяющей способности спермы быков путем оплодотворения ин витро с использованием не одного, как это было известно, а трех критериев оценки. Получение полноценных змбрионов методом оплодотворения ив витро подтверждено продолжением их развития после пересадки реципиентам и рождением жизнеспособного потомства.
Апробация работа Результаты, представленные в работе, были
- 5 -доложены на Всесоюзной конференции молодых ученых в г.Полтаве, 1991 г.; в Научно-производственном биотехнологическом центре по животноводству, 1992 г.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, выводов, обсуждения и практических предложений. Цифровой материал представлен в 15 таблицах, иллюстрирован ХЧ фотографиями. Список литературы включает 124 источник отечественных и зарубежных авторов.