Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ 10
1. Природные галактозосодержащие соединения 10
1.1 Галактоолигосахариды 10
1.2 Галактоманнаны, галактоглюкоманнаны 11
2. ос-Галактозидазы 14
2.1 Продуценты а-галактозидаз 14
2.2 Гликозил-гидролазные семьи а-галактозидаз 17
2.3 Биохимические свойства а-галактозидаз 17
2.4 Каталитические свойства а-галактозидаз 20
3. Применение а-галактозидаз 25
3.1 Кормовая промышленность 25
3.2 Пищевая промышленность 25
3.3 Целлюлозно-бумажная и текстильная промышленность 26
ГЛАВА II. ПЕКТИНЛИАЗЫ 27
1. Пектин 27
1.1 Основная цепь молекулы пектина 27
1.2 Боковые цепи молекулы пектина 29
1.3 Неуглеводные заместители в молекуле пектина 29
2. Пектин- и пектатлиазы 31
2.1 Структурная характеристика пектин- и пектатлиаз 33
2.2 Каталитические свойства пектин- и пектатлиаз 35
3. Применение пектина и пектинлиаз 37
3.1 Пищевая промышленность 37
3.2 Кормовая промышленность 39
3.3 Текстильная и целлюлозно-бумажная промышленность 39
ГЛАВА III. ФИТАЗЫ 41
1. Фитиевая кислота и её соли 41
1.1 Строение фитиевой кислоты 41
1.2 Содержание лшо-инозит фосфатов в растительном сырье 41
1.3 Физико-химические методы определения содержания фитиевой кислоты в образцах 43
2. Фитазы 44
2.1 Продуценты фитаз 44
2.2 Классификация фитаз 46
2.3 Биохимические свойства фитаз 50
2.4 Каталитические свойства фитаз 53
3. Применение фитаз^ 58
3.1 Кормовая промышленность 58
3.2 Пищевая промышленность 61
3.3 Медицина 62
ГЛАВА IV. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ PENICILLIUM CANESCENS КАК ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ 63
ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 66
ГЛАВА V. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 66
1. Использованные вещества 66
1.1 Ферментные препараты 66
1.2 Субстраты 66
1.3 Прочие реактивы 61
1.4 Хроматографические сорбенты 68
2. Методы 69
2.1. Выделение и очистка индивидуальных ферментов P.canescens 69
2.2 Определение концентрации белка 71
2.3 Определение биохимических характеристик ферментов 71
2.4 Методы определения активности ферментов 71
2.4.1 Определение активности по полисахаридным субстратам 71
2.4.2 Определение активности по и-нитрофенильным производным Сахаров 72
2.4.3 Определение пектинлиазной активности 73
2.4.4 Определение фитазной и фосфатазной активности 75
2.5 Определение температурного и рН-оптимума действия ферментов 76
2.6 Изучение термо- и рН-стабильности ферментов 77
2.7 Определение кинетических параметров действия ферментов (Кт, V , К) 77
2.8 Исчерпывающий гидролиз специфических субстратов 78
2.9 Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) продуктов
гидролиза фитата Na 78
2.10 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза ГМ и галактоолигосахаридов 79
2.11 Изучение влияния эффекторов на активность ферментов 79
2.12 Изучении влияния соков желудочно-кишечного тракта свиней на свойства фитазы 80
2.13 Прикладные испытания ферментов 80
2.13.1 Оценка способности пектинлиазы осветлять яблочный сок 80
2.13.2 Изучение способности пектинлиазы увеличивать выход сока из ягод 81
2.13.3 Конверсия вторичного продукта переработки сои а-галактозидазами 81
2.13.4 Оценка способности ферментов увеличивать питательную ценность кормов iv vitro
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 83
ГЛАВА VI. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ а-ГАЛАКТО-ЗИДАЗ А И С, ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ НА ОСНОВЕ НОВЫХ ШТАММОВ P.canescens 83
1. Создание новых конструкций на основе штаммов P.canescens 83
2. Характеристика ферментных препаратов, полученных с помощью штаммов
P.canescens, несущих гены гомологичных а-галактозидаз, пектинлиазы
и фитазы 86
ГЛАВА VII. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ сс-ГАЛАКТО-ЗИДАЗ А И С, ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ P.canescens 88
1. Выделение гомогенных ферментов 88
2. Свойства гомогенных ферментов 93
2.1 сс-Галактозидазы А и С 94
2.1.1 Субстратная специфичность и классификация 94
2.1.2 рН- и температурные оптимумы активности 98
2.1.3 Стабильность 100
2.1.4 Устойчивость к «термошоку» 102
2.1.5 Кинетические характеристики 104
2.1.6 Влияние эффекторов на активность 1 Об
2.2 Пектинлиаза А 107
2.2.1 Субстратная специфичность 107
2.2.2 рН- и температурные оптимумы активности 109
2.2.3 Стабильность НО
2.2.4 Устойчивость к «термошоку» 110
2.2.5 Кинетические характеристики 112
2.2.6 Влияние эффекторов на активность 112 2.3ФитазаА 114
2.3.1 Субстратная специфичность 114
2.3.2 рН- и температурные оптимумы активности 116
2.3.3 Стабильность 119
2.3.4 Устойчивость к «термошоку» 121
2.3.5 Кинетические характеристики 122
2.3.6 Влияние эффекторов на активность 122
ГЛАВА VIII. ПРИКЛАДНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ФЕРМЕНТОВ 129
1. Оценка эффективности применения ферментного препарата рекомбинантной
Пел А P. canescens в процессах получения соков 129
1.1 Получение сока из клюквы 129
1.2 Осветление яблочного сока 131
2. Гидролиз вторичного продукта переработки сои ферментным препаратом рекомбинантной а-Гал С P.canescens 132
3. Оценка способности ферментов P.canescens повышать питательную ценность кормов in vitro 135
ВЫВОДЫ 142
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143
ПРИЛОЖЕНИЕ
Введение к работе
Промышленная технология ферментных препаратов начала активно развиваться в последней четверти XX века. К настоящему времени ферментные препараты стали мощным средством трансформации практически любого вида биологического сырья, формирования и контроля качества продуктов [1]. Применение ферментных препаратов в сельском хозяйстве, кормовой и пищевой промышленности позволило существенно повысить усвояемость кормов, расширить сырьевую базу кормопроизводства, увеличить глубину переработки пищевого сырья, а также улучшить органолептические свойства и создать новые виды пищевых продуктов.
Использование промышленных ос-галактозидазных препаратов делает возможным более широкое использование различных соевых продуктов в качестве пищи животных и человека [2-4]. а-Галактозидазы применяются для модификации галактоманнанов с целью придания им требуемых в пищевом производстве реологических свойств, а также в процессах конверсии растительных отходов.
Добавка фитаз к кормам животных на основе семян является эффективным способом повышения доступности фосфора и, таким образом, позволяет сэкономить неорганический фосфат при составлении рационов и снизить содержание непереваренного фосфора на 30-60% [1, 5-10]. Применение промышленных фитазных препаратов улучшает костную минерализацию, усвоение белков и аминокислот в организме животных [11].
Пектинлиазные препараты незаменимы при переработке ягод, овощей и фруктов [12]. Пектинлиазы используют на разных стадиях технологических процессов изготовления пюре, соков с мякотью и осветленных соков. Широкое распространение эти ферменты получили в виноделии для стабилизации вин.
Ферментная промышленность выпускает большой ассортимент препаратов микробного происхождения. Значительную часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят с помощью культивирования микроскопических грибов. При этом все более значимое место занимают препараты на основе грибов рода Penicillium. Рост интереса к этим продуцентам как к промышленно значимым объектам вызван тем, что Penicillium sp. продуцируют внеклеточные ферменты широкого спектра действия, в том числе ксиланазы, целлюлазы, пектиназы, амилазы, фитазы, протеазы и др. Известны механизмы, с помощью которых можно добиться высокого уровня белковой секреции этими штаммами. Следует отметить безопасность их использования в пищевой и кормовой промышленности и в фармакологии.
В нашей лаборатории на протяжении ряда лет изучаются состав и свойства внеклеточного ферментного комплекса мицелиалыюго грибного штамма РепісіШит canescens. Среди секретируемых им ферментов нами были обнаружены, в том числе, две а-галактозидазы различной специфичности, пектинлиаза и фитаза, однако уровень секреции этих ферментов оказался низким. Для получения препаратов с высокими содержанием перечисленных выше ферментов, пригодных для промышленного применения, совместными усилиями с нашими коллегами из Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН и из ФГУП ГНИЙ генетики и селекции промышленных микроорганизмов были созданы рекомбинантные штаммы P.canescens с повышенной продукцией собственных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы. Новые штаммы P.canescens содержали мультикопированные гены гомологичных ферментов под контролем сильных промоторов.
Целью данной работы явилось изучение биохимических, физико-химических характеристик и каталитических свойств рекомбинаптных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы, полученных на основе новых штаммов P.canescens, а также оценка эффективности их действия на природные объекты, содержащие галактоолигосахариды, галактоманнаны, пектины и фитаты.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- провести скрининг новых трапсформаптов P.canescens и выбрать среди них
оптимальные для получения промышленных ферментных препаратов с высокими
активностями а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы;
- разработать (оптимизировать) схему выделения в гомогенном виде
рекомбинаптных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы из ферментных комплексов,
секретируемых новыми штаммами P.canescens;
- исследовать свойства выделенных ферментов;
разработать лабораторные методики оценки эффективности применения а-галактозидаз, пектинлиаз и фитаз в различных процессах переработки и модификации растительного сырья;
с помощью разработанных методик оценить эффективность применения а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы P.canescens (а также их смесей и препаратов на их основе) для нужд кормовой и пищевой промышленности, используя в качестве эталонов для сравнения коммерчески доступные промышленные а-галактозидазные, пектинлиазные и фитазные препараты.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Природные галактозосодержащие соединения
В молекулах олигосахаридов галактоза присоединена к невосстанавливающим концам молекул: мелибиоза (GIc(al,6)-Gal), раффиноза (Fru(ccl,2)-Glc(cd,6)-Gal), стахиоза (Fru(ocl,2)-Glc(al,6)-Gal(al,6)-Gal) [4, 15]. Самым распространенным галактозосодержащим олигосахаридом растений является раффиноза (см. рис. 2а, [4]). Многие растения содержат также более сложные олигосахариды, например стахиозу и вербаскозу. Последние имеют сходное строение (см. рис. 26).
Раффиноза, стахиоза и вербаскоза являются основными олигосахаридами сои [16]. Необработанные соевые бобы содержат 0.38 и 3.34% сухого веса раффинозы и стахиозы, соответственно [3]. Сухое соевое молоко содержит 10.25, 1.33 и 8.47% по массе сахарозы, раффинозы и стахиозы, соответственно [17].
1.2 Галактоманнаиы, галактоглюкомаинаны
Галактоглюкоманнан/(9-ацетилгалактоглюкоманнан - преобладающий (до 25% сухого веса) компонент гемицеллюлоз мягких (хвойных) пород деревьев, см. табл. 1. Основная цепь галактоглюкоманнана сформирована Р-1,4-связанными остатками D-маннопиранозы и D-глюкопиранозы, а боковые цепи - сс-1,6-присоединенными остатками )-галактозы. Кроме того, в среднем каждое четвёртое звено основной цепи (D-глюкопираноза) ацетилировано по С-2 или С-3 атомам. Выделяют два типа галактоглюкоманнанов: с высоким и низким содержанием галактозы. В первом, составляющем 5-10%) сухой массы хвойной древесины, соотношение «галактоза : глюкоза : манноза» можно представить как 1:1:3; во втором, составляющем 10-15%» от сухой массы хвойной древесины, - как 0.1:1:4 [ 18-20].
Галактомаїшан («ГМ») имеет сходную, но более простую структуру [18, 20, 21]. ГМ представляют собой гетерополисахариды, построенные из остатков D-галактозы и D-маннозы. Основная цепь ГМ состоит из р-1,4-связанных остатков -маннозы, а боковые ветви - из единичных звеньев D-галактозы, присоединённых ос-1,6-связями (см. рис. 3). Главная цепь макромолекул ГМ построена, как правило, из маннозных остатков двух типов: С-4-замещённых и С-4,6-дизамещённых. ГМ в изобилии присутствуют в эндосперме и зрелых семенах растений [21-23]. Например, они обнаружены в семенах растений из 11 семейств: Annonaceae, Compositae, Convolvulaceae, Ebenaceae, Fabaceae, Lagoniaceae, Malvaceae, Palmae, Solanaceae, Tiliceae, Umbelliferae и, возможно, Cuscutaceae. Особое положение занимают ГМ семейства бобовых {Fabaceae), поскольку на их долю приходится более 90% общего числа исследованных ГМ (см. табл. 2) [24]. В семенах растений ГМ выполняют энергетическую (при прорастании), водоудерживающую (при набухании семян) и защитную функции. Энергетическая функция является основной, поэтому ГМ относятся к группе запасных полисахаридов [24]. Важнейшей характеристикой ГМ, определяющей их физико-химические свойства (плотность, растворимость, вязкость растворов и др.), является соотношение числа маннозных и галактозиых остатков («М:Г») в полимерной молекуле [21, 24]. Этот параметр сильно варьирует в зависимости от источника галактоманнана. Так, у ГМ бобовых соотношение «М:Г» варьируется от 1:1 до 5.7:1 (т.е. максимальное содержание галактозы - 50%, а минимальное - 15%), а ГМ некоторых пальм описываются соотношением «М:Г» 50(или 90):1 (их иногда относят к маннанам).
Отсутствие прочной связи с другими полимерами клетки позволяет извлекать ГМ водной экстракцией. Измельчённые тем или иным способом семена бобовых экстрагируют холодной или горячей водой, после чего полисахариды осаждают этиловым спиртом [24]. В настоящее время в промышленном масштабе производятся три ГМ: из эндосперма семян бобового растения, повсеместно выращиваемого в Индии и Пакистане, - Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub. (гуар) - получают гуаран (guar gum); из плодов Ceratonia siliqua (кароб, рожковое дерево) - карубин (locust bean gum), а из плодов Caesalpinia spinosa L. (дерево тара) получают - в меньших объёмах - тарагалактоманнан (tara gum) [24-26]. Карубин является нейтральным, не образующим гелей полисахаридом с соотношением «М:Г» 3.5-3.8:1 [27, 28]. Степень полимеризации («СП») молекул гуарана больше, чем СП тарагалактоманнана, и оба они превышают по СП молекулы карубина [29].
Пектин
Основная цепь молекулы пектина состоит из остатков a-1,4-D-галактуроновой кислоты (гомогалактуронан или «гладкая» область) со вставками ос-1,2-связанных остатков Z-рамнопиранозы (рамногалактуронан или «разветвленная» область, см. рис. 5). В растворе эта цепь имеет вид спирали, на один виток которой приходится три молекулы галактуроновой кислоты. Неравномерное включение в цепь остатков рамнозы придаёт полимерной молекуле зигзагообразный характер [86]. Соотношение структурных элементов пектина варьирует в широких пределах и зависит от растительного источника. Например, доля гомогалактуронана в коммерческом пектине более - 65%, а в пектине из сои близка к нулю (табл. 5) [10, 87].
Гомогалактуронан, состоящий из а-1,4-связанных остатков галактуроновой кислоты, был выделен из различных растений, например, из яблок, цитрусовых, соцвета и семян подсолнечника, риса, первичной клеточной стенки платана. Гомогалактуронан имеет СП от 25 до 100 [10, 88]. Характерной особенностью гомогалактуронана является этерификация метанолом по С-6 галактуроновой кислоты. В позиции С-3 галактуроновой кислоты может присоединяться р-ксилозидный остаток
Обнаружено присутствие
- такую структуру часто называют ксилогалактуронаном [89]. Его содержание высоко, например, в соевом пектине.
Рамногалактуронан I состоит из чередующихся а-1,2-связанных остатков L-рамнозы и ос-1,4-связанных остатков /)-галактуроновой кислоты. В зависимости от источника полисахарида к 20-80% рамнозильных остатков в положении С-4 присоединяются боковые ветви длинной от 1 остатка галактозы до 50 и более остатков арабинозы (сахарная свекла), галактозы (лен, чеснок, лук) или их обеих (соя, картофель) [10]. Особенностью этого полисахарида является высокое содержание ацетильных групп, связанных с остатками галактуроновой кислоты в положениях С-2 и/или С-3. Рамногалактуронан I был выделен также из риса, моркови, киви, томатов [87, 90].
Рамногалактуронан II встречается в пектине клеточных стенок растений редко. В его структуре было обнаружено до 30 различных Сахаров, в том числе и редких (например, апиоза). В отличие от рамногалактуронана I, имеющего исключительно 1,2-связи, в рамногалактуронане II остатки рамнозы присоединены 1,2-, 1,3-, 1,4-связями. Пектин, содержащий рамногалактуронан II, был выделен из томатов, яблок, капусты, картофеля [87]. Интересно отметить, что до сих пор не было найдено ни одного фермента, способного разрушать рамногалактуронан И.
Боковые цепи пектина преимущественно представлены остатками D-галактозы, L-арабинозы и D-ксилозы. Более редко встречаются остатки D-глюкозы, )-маннозы, L-фукозы и D-глюкуроновой кислоты [91].
Преобладающие сахара боковых цепей пектина (D-галактоза и jL-арабиноза) образуют достаточно продолжительные последовательности (галактан, арабинан и арабиногалактан двух типов), которые связаны с основной цепью через положения С-4 и/или С-3 Z-рамнозы или - реже - через С-2 и/или С-3 галактуроновых остатков. Доля замещенных остатков галактуроновой кислоты в пектине семян рапса составляет 75%, картофеля и лука - 32%, а в пектине листьев табака вообще не обнаружено замещения галактуроновой кислоты. Соотношение замещенных и незамещенных остатков рамнозы также варьирует в зависимости от природного источника: в пектине клеточных стенок платана 50% остатков рамнозы замещены боковыми цепями, яблок -почти 100%, листьев табака - 30-50%, моркови - 10-50%, капусты - 20-40%, винограда - 30%, свеклы - 60%, томатов - 20-40% [87,92].
Фитиевая кислота и её соли
Название «пектин» происходит от греческого слова «pektos», что означает «желированный», «застывший». Благодаря прекрасным желирующим свойствам пектин широко применяется при производстве пищевых продуктов - кондитерских изделий, фруктовых желе, джемов, а также для стабилизации молочных продуктов в кислых условиях [86, 111]. Пектин - вместе с другими некрахмалистыми полисахаридами (такими как ГМ, см. Главу 1) - образует группу пищевых волокон, способных снижать уровень холестерина в крови, нормализовать деятельность желудочно-кишечного тракта, а также связывать и выводить из человеческого организма токсичные элементы и радионуклиды. Это делает пектин и пектинсодержащие продукты ценной добавкой при производстве пищевых продуктов лечебно-профилактического назначения [86]. Наиболее современным и экологически чистым является биотехнологический способ получения пектина из пектинсодержащих отходов сокового и сахарного производств, основанный на действии ферментов микробного происхождения. Ферментативный гидролиз имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционным кислотным гидролизом, главное из которых - увеличение выхода пектина при сохранении его студнеобразных свойств [112,113].
Пектиназные препараты начали использоваться в промышленности еще в 1930-х годах при производстве вин и соков. Однако, только с 1960-х годов, когда стала ясна химическая природа растительной ткани, ферментные препараты стали применяться более эффективно [104]. По оценочным данным, в 1995 году ферментных препаратов было продано на 1 миллиард долларов, из которых 75 миллионов долларов было потрачено на пектиназы. [102]. Среди коммерческих пектолитических ферментов наиболее распространены препараты, полученные на основе промышленного культивирования грибных штаммов A.niger, A.awamori, A.oculeatus [104].
Осветление фруктовых соков. Пектин- и пектатлиазы, применяются для осветления соков и при отжиме фруктовой мякоти [10, 101, 103, 114, 115]. Неосветлённые соки содержат частицы, образованные положительно заряженными белками, снаружи окружёнными отрицательно заряженными молекулами пектина. Такие одинаково заряженные частицы отталкиваются. При действии пектин- и пектатлиаз часть пектина гидролизуется, и положительно заряженные белки оказываются на поверхности частиц. Частицы начинают слипаться и оседают, что приводит к осветлению соков.
Снижение вязкости фруктовых соков и получение соков с высоким выходом. Единственные ферменты пектиназного комплекса, способные расщеплять а-1,4-гликозидные связи высоко этерифицированных пектинов без предварительного действия других ферментов, - это пектинлиазы. Они используются для снижения вязкости осветлённых соков и при этом не разрушают летучие эфирные компоненты, придающие аромат различным фруктам [103, 116]. Для получения соков с очень высоким выходом используют смеси пектин- и пектатлиаз с целлюлазами (например, эндоглюканазами, эндоксилоглюканазами, целлобиогидролазами и целлобиазами). Сок из мякоти яблок, винограда и груш может быть легко получен прессованием, тогда как при растирании/измельчении ягод и бананов получается очень вязкий сок, который как бы прилипает к частицам мякоти, делая механическое отделение сока невозможным. Для получения соков из фруктов с высоким содержанием мякоти (манго, маракуйя, гуава, бананы) с минимальными потерями питательных веществ применяют ферментативную обработку смесями пектин- и пектатлиаз с целлюлазами. В результате происходит полное разрушение клеточной стенки и гель-образующих полисахаридов, что приводит не только к увеличению выхода сока, но и улучшает его окраску [10, 104, 117].
Улучшение цветовых и ароматических характеристик вина. Процесс ферментативной деградации межклеточных веществ, в результате которого происходит размягчение ткани и распад её на отдельные клетки, принято называть мацерацией [118]. Полученные при мацерации сырья пюреобразные нектары обладают кремообразной консистенцией, ярче окрашены и более питательны чем нектары, полученные термомеханической обработкой. Мацерация способствует экстракции ароматических веществ, которые в большом количестве присутствуют в кожице ягод [119]. Так, обработка винограда пектолитическими препаратами «Zipomex РХ1» (Perdomini SPA), «Rapidase CX» (Gist Brocades/DSM), «Pectinase WL Extraction» (Wormer Oenologie), «Rapidase Ex. Colour» (Gist Brocades/DSM) значительно улучшает цветовую характеристику вина и делает более стабильным при длительном хранении [1, 10, 104, 119, 120]; а использование промышленного пектолитического ферментного препарата «Ultrazym» при мацерации винограда в процессе получения портвейна позволяет увеличить выход сока на 6%, повысить интенсивность окраски на 40%, а так же увеличить скорость фильтрации [121].