Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 21
1.1 Проблема саморегуляции развития микробных популяций. Исторический обзор 21
1.1.1 Стимуляция роста культур продуктами собственного обмена 21
1.1.2 Самоингибирование и остановка роста 34
1.1.3 Стадии роста 41
1.1.4 Физиологические изменения в процессе роста 44
1.1.5 Морфологические изменения в процессе роста 50
1.1.6 Рост колоний на плотных питательных средах 56
1.2 Продукты метаболизма при различных условиях выращивания Escherichia coli 66
1.2.1 Аэробный рост на различных субстратах 71
1.2.2 Микроаэрофильные и анаэробные условия роста 78
1.3 Экспрессия генов при росте культур на полных и минимальных средах 88
1.3.1 Зависимость экспрессии генов от скорости роста 90
1.3.2 Независимая от скорости роста экспрессия генов 93
1.3.3 Рост культуры на ацетате 84
1.4 Физиологическая роль выделяемых продуктов обмена 101
1.4.1 Авторегуляция внеклеточного рН и его влияние на экспрессию генов 101
1.4.2 Действие ацетата и других анионов короткоцепочеч-ных жирных кислот 109
1.5 Кворум-зависимые реакции бактерий 127
1.5.1 Регуляторные функции ацилированных лактонов го-мосерина 130
1.5.2 Пептидные регуляторы грамположительных бактерий.... 136
1.5.3 Кворум-зависимые системы Vibrio harveyi и межвидова; коммуникация бактерий 139
1.5.4 Использование механизмов межклеточной коммуникации в медицинских целях 149
1.6 Метаболиты бактерий как фактор симбиоза микрофлоры и ее хозяина 1156
1.7 Метаболическая регуляция в развитии популяций высших организмов, ее экологическая и эволюционная роль 162
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 168
2.1 Культуры бактерий и условия их хранения 1168
2.2 Стандартное выращивание Escherichia coli М-17 169
2.3 Выращивание E.coli К-12, Е. coli К-165, S. marcescens и S.enteritidis 1171
2.4 Спектрофотометрический контроль роста 1171
2.5 КОЕ, размер колоний, концентрация и размер бактерий 1173
2.6 Условия голодания, выживаемость, численность и повреж-денность микроорганизмов
2.7 Параметры кривых выживаемости бактерий 1176
2.8 Биологическая активность экзометаболитов E.coli М-17 1178
2.9 Получение препаратов экзометаболитов 182
2.10 Действие экзометаболитов на рост чистых и смешанных культур 1184
2.11 Действие экзометаболитов на выживаемость в смешанных культурах 1186
2.12 Сравнение действия АРК и фруктоолигосахаридов 1187
2.13 Флуоресцентный анализ 188
2.14 Хроматографические методы Л91
2.15 Аналитические методы 195
2.16 Статистическая обработка результатов 198
Глава 3 САМОРЕГУЛЯЦИЯ РОСТА В ПЕРИОДИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ Escherichia coli
3.1 Спектрофотометрический контроль роста 199
3.2 Спектральные характеристики внеклеточной среды 211
3.3 Биологаческая активность метаболитов внеклеточной среды...216
3.4 Заключение по материалам главы 3 227
Глава 4 САМОРЕГУЛЯЦИЯ ЧИСЛЕННОСТИ В ГОЛОДАЮЩИХ КУЛЬТУРАХ 229
4.1 Выживаемость в культурах различной плотности 229
4.2 Голодание в присутствии активированного угля 233
4.3 Голодание в условиях диализа 234
4.4 Выживаемость бактерий в растворах метаболитов 235
4.5 Чувствительность к метаболитам культур низкой плотности.. .237
4.6 Динамика стимуляторов роста и УГ-факторов 239
4.6.1 Активность стимуляторов роста при голодании бактерий 239
4.6.2 Динамика УГ-факторов и стимуляторов роста при
росте и голодании бактерий 241
4.6.3 Математическая модель роста и выживаемости 245
4.7 Автолитические процессы при голодании 248
4.8 Содержание ДНК в бактериях 253
4.9 Физиологические изменения в культурах различной плотности 258
4.9.1 Выживаемость на селективных средах и светорассеивающие характеристики клеток 258
4.9.2 Взаимное влияние разделенных диализной мембраной культур 261
4.9.3 Проницаемость и мембранный потенциал клеток 262
4.9.4 Влияние на скорость гибели бактерий физических и химических факторов 266
4.10 Некоторые закономерности гибели Serratia marcescens, Е. coliKrllnE. соІіК-165 267
4.11 Заключение к главе 4 269
Глава 5 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТОВ АВТОСТИМУЛЯТОРОВ РОСТА 276
5.1 Продолжительность лаг-периода и гетерогенность популяции Е.соІіМЛІ 276
5.2 Рост на глюкозо-минеральной среде с добавлением АРК 278
5.3 Сравнение роста на богатых средах и глюкозо-минеральной среде с АРК 280
5.4 Влияние АРК на динамику роста и термоустойчивость кача-лочной культуры 283
5.5 Действие низкомолекулярных экзометаболитов E.coli М-17
на рост других бактерий 284
5.6 Низкомолекулярные экзометаболиты как фактор антагони
стической активности бактерий 287
5.6.1 Рост смешанных культур 287
5.6.2 Выживаемость при голодании смешанных культур 291
5.7 Влияние АРК и фруктоолигосахаридов на рост и
антагонистическую активность лактобацилл 295
Глава 6 ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ АВТОРЕГУЛЯТОРОВ....301
6.1 Хроматография на TSK-геле в нейтральных условиях 301
6.2 Гидрофобные свойства автостимуляторов роста 309
6.3 Хроматография на TSK-геле при низких значениях рН 310
6.4 Хроматографическое разделение экзометаболитов в процессе выращивания культур 312
6.5 Хроматографические свойства ускоряющих габель факторов..315
6.6 Препаративное выделение стимуляторов роста 316
6.6.1 Катионообменная хроматография 318
6.6.2 Фронтальная анионообменная хроматография „321
6.6.3 Препаративная анионообменная хроматография 326
6.6.4 Препаративная ВЭЖХ 331
6.6.5 Препаративная хроматография на TSK-геле 333
Глава 7 БИОЛОГРІЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ БАКТЕРИЙ 338
7.1 Состав экзометаболитов при росте и голодании 339
7.1.1 Фракция низкомолекулярных метаболитов 339
7.1.2 Фракция высокомолекулярных соединений 346
7.2 Инициация роста композицией низкомолекулярных экзометаболитов 346
7.3 Инициация роста индивидуальными экзометаболитами 348
7.4 Влияние экзометаболитов на рост качалочной культуры 351
7.5 Динамика экзометаболитов при выращивании бактерий 359
7.5.1 Адаптивные реакции при пересеве клеток 359
7.5.2 Рост в колбах на качалке 368
7.5.3 Выращивание в ферментаторе 375
7.6 Потребление собственных экзометаболитов бактериями 386
7.6.1 Экзометаболиты как единственный источник питания.. .386
7.6.2 Динамика добавленных в среду культивирования экзометаболитов 387
7.7 Влияние экзометаболитов на антагонистическую активность бактерий при выращивании смешанных культур 390
7.8 Антагонистическая активность бактерий при голодании 396
7.8.1 Выживаемость в чистых и смешанных культурах 397
7.8.2 Влияние экзометаболитов на антагонистическую активность бактерий 399
7.9 Биологическая активность экзометаболитов в КЖ голодаю
щей культуры 405
7.9.1 Метаболиты первой группы 408
7.9.2 Метаболиты второй группы.... 410
7.9.3 Контроль концентраций ацетата и формиата при их добавлении в среду голодания бактерий 413
7.10 Рост бактерий на плотных средах 416
Глава 8 СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ БАКТЕРИЙ - АКТОФЛОР-С 437
8.1 Анализ состава и биологической активности препаратов Ак-тофлор-1 439
8.2 Состав базовый композиции синтетического препарата Ак-тофлор-С 447
8.3 Свойства базовой композиции Актофлор-С 450
8.4 Функциональная роль компонентов и коррекция состава базовой композиции Актофлор-
8.5 Биологические свойства Актофлор-С 460
8.6 Фармакологическая активность Актофлор-С 465
8.6.1 Дисбактериоз, вызванный хронической свинцовой интоксикацией 394
8.6.2 Экспериментальное язвенное поражение желудочно-кишечного тракта 395
8.6.3 Заключение о результатах изучения общетоксического и фармакологического действия препарата 468
8.7 Заключение к главе 8 469
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 473
ВЫВОДЫ 504
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 508
Благодарности 555
Приложение Акты внедрения результатов работы 556
- Проблема саморегуляции развития микробных популяций. Исторический обзор
- Культуры бактерий и условия их хранения
- Спектрофотометрический контроль роста
Введение к работе
Актуальность работы. Быстро выросший за последние годы интерес к коммуникативным связям бактерий объясняется осознанием высокой значимости этих вопросов для решения научных и практических задач в области биотехнологии, медицины, здравоохранения и сельского хозяйства. В настоящее время механизмы коммуникации преимущественно связывают с так называемым «чувством кворума» [Fuqua et al, 1994] - способностью бактерий «ощущать» плотность собственной популяции путем выделения и последующей рецепции особых низкомолекулярных соединений - автоиндукторов.
Автоиндукторами могут являться как специализированные соединения, например ацилированные лактоны гомосерина (АГЛ) или модифицированные олигопептиды (МОПы), так и не специализированные вещества. К последним относятся автоиндукторы второго типа (АИ-2), образующиеся путем спонтанного превращения обычного внутриклеточного интермедиата - 4,5-дигидрокси-2,3-пентандиона. Существуют данные, свидетельствующие о том, что в регуляции задействованы и другие неспециализированные метаболиты, например индол, и даже обычные (кодируемые) аминокислоты.
Автоиндукторы «чувства кворума» участвуют в регуляции самых различных процессов, перечень которых постоянно расширяется. К ним относятся: биолюминесценция, споруляция, агрегация, формирование биопленок, плодовых тел и клеток-швермеров, конъюгация, синтез антибиотиков, экзоферментов, факторов вирулентности и некоторых других соединений. Синтез самих автоиндукторов зависит от плотности популяции, однако до сих пор остается дискуссионным вопрос о том, контролируется ли она собственными внутрипопуляционными механизмами или полностью определяется внешними факторами (состав среды, аэрация, температура, рН и т.д.),
то есть регулируется на более высоком уровне (микробиоценоз или искусственное поддержание параметров среды).
Согласно установленным в экологии закономерностям, полноценная система саморегуляции численности и развития популяций должна включать 4 основные регуляторные связи, обеспечивающие оптимальные для данных условий скорость размножения и продолжительность жизни (выживаемость) организмов. Это позволяет отнести к контролирующим численность и развитие популяций микроорганизмов следующие связи: 1) положительная обратная связь, обеспечивающая инициацию и последующий рост культуры; 2) отрицательная обратная связь, способствующая замедлению роста, его остановке и адаптации культуры к новым условиям еще до полного исчерпания субстрата; 3) положительная обратная связь, повышающая выживаемость бактерий при оптимальной для данных условий плотности культур; 4) отрицательная обратная связь, приводящая к снижению выживаемости, если плотность культуры по какой-то причине превысила оптимальный уровнь.
В настоящее время установленным для бактерий можно считать только наличие отрицательной обратной связи, обеспечивающей остановку роста культуры. Эксперименты с культурами высокой плотности в 70-е - 80-е годы прошлого века показали, что функции ингибиторов роста выполняют накапливающиеся в среде продукты метаболизма: кислоты (муравьиная, уксусная, молочная, пропионовая и др.), спирты (метанол, этанол, пропанол и т.д.) и некоторые другие соединения. Их действие, однако, не рассматривалось с позиций авторегуляции, расценивалось как неспецифическое и, в соответствие с этим, объяснялось закислением среды, понижением мембранного потенциала и некоторыми другими причинами.
Значительно меньше известно об автостимуляторах роста. Содержащие эти соединения фильтраты культуральных жидкостей используются на практике для ускорения роста микроорганизмов или для реактивации их покоящихся форм (Эль-Регистан, 2005), однако информация относительно
природы и биологических свойств самих автостимуляторов весьма ограничена и противоречива. По одним сведениям бактерии выделяют эти соединения преимущественно в лаг-фазе, по другим - на протяжении всего роста. Безуспешными оказались и все известные попытки идентифицировать автостимуляторы, включая и самые последние из них (Weichart & Kell, 2001). Практически неизвестными до сих пор оставались явления саморегуляции выживаемости бактерий. В последние годы эти вопросы рассматриваются в литературе с позиций программируемой клеточной гибели (апоптоза) бактериальных культур (Engelberg-Kulka & Glaser, 1999), направленной преимущественно на лизис зараженных вирусом бактерий и обеспечение за их счет питательными веществами оставшихся клеток.
Все это говорит о том, что имеющихся в настоящее время знаний недостаточно для ответа на вопрос о существовании или отсутствии у бактерий системы саморегуляции численности. С практической точки зрения значительный интерес для исследования процессов саморегуляции представляют представители нормальных симбионтов человека и пробиотиков, использующихся для коррекции микрофлоры. Это послужило одной из причин, по которым в качестве основного объекта изучения в настоящей работе был выбран штамм первого отечественного пробиотика Е. coli М-17 (препарат колибактерин). Эксперименты с другими бактериями показали, что те же методы могут быть успешно применены для изучения аналогичных процессов у других микроорганизмов, по крайней мере тех, которые обитают в сходных экологических условиях организма человека.
Решаемые в диссертации задачи находятся в тесной связи с наиболее актуальными проблемами биотехнологии (управление ростом микроорганизмов), медицины (разработка пробиотических препаратов, изучение механизмов их действия, проблемы развития инфекционных заболеваний, эпидемий и т.д.), охраны среды (очистные сооружения, очистка почв), экологии, эволюции и некоторыми другими.
Настоящая работа выполнена в рамках ряда научно-технических программ, в том числе: федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения" по государственному контракту № ГНТД/ГК-055 от 14.01.2000 г; по государственным контрактам № 43.600.14.0055 от 27.01.2003 г, № 43.600.11.10484.4 от 18.03.2004 г, программы «Интеграция». В настоящее время работы продолжаются по Государственному контракту № 40.003.06.0 от 29.12.2005 «Разработка иммунобиотиков для повышения эффективности вакцинных препаратов».
Целью работы являлось экспериментальное обоснование существования системы саморегуляции численности и развития популяций бактерий, поиск и комплексное изучение эффектов саморегуляции в популяциях и более сложных микробных сообществах, идентификация автостимуляторов роста и других материальных носителей коммуникативных связей, изучение их действия на рост, выживаемость, антагонистическую активность и другие характеристики бактерий и их популяций, практическое подтверждение возможностей использования авторегуляторов и принципов авторегуляции в биотехнологических и медицинских целях.
В ходе выполнения работы были поставлены следующие основные задачи:
Разработать адекватные поставленной цели методы контроля и изучения механизмов развития бактериальных популяций.
С позиций авторегуляции провести комплексное исследование роста и голодания бактерий с использованием современных микробиологических, биохимических и биофизических методов. В ходе этих исследований доказать существование обратных связей, регулирующих выживаемость бактерий, подтвердить факты кооперативного поведения бактерий в процессе выращивания культур (автостимуляция и самосинхронизация роста) и выявить новые свойства саморегулируемых систем.
Изучить механизмы взаимодействия бактерий в рамках двух альтернативных гипотез: опосредованное взаимодействие путем выделения медиаторных соединений и непосредственное взаимодействие путем прямых (физических) контактов или полей.
Изучить биологические свойства исходных и фракционированных экзометаболитов, полученных при различных способах выращивания и в процессе голодания культур различной плотности.
Выделить и идентифицировать химические медиаторы межклеточных контактов, изучить их биологические свойства и динамику в процессе роста и голодания культур, исследовать действие экзометаболитов на развитие колоний различных штаммов и видов бактерий.
Создать из идентифицированных соединений модельные композиции, изучить их биологические свойства в сравнении со свойствами отдельных метаболитов и низкомолекулярной фракции нативных растворов метаболитов. Разработать подходы для повышения биологической активности композиций.
Выяснить роль внутрипопуляционных регуляторных процессов в регуляции биологических систем более высокого уровня. С этой целью изучить влияние идентифицированных экзометаболитов и их композиций на рост, выживаемость и антагонистическую активность бактерий в смешанных культурах, их влияние на состав микробиоценоза лабораторных животных, токсическое действие на организм хозяина и течение искусственно вызванного язвенного процесса.
Методологической и теоретической основой работы являлись труды академиков С.С. Шварца, А.С. Хохлова, работы 70-80-х годов прошлого века группы авторов УНЦ АН (Р.А. Пшеничнов, С.Я. Барихин, А.Г. Тка-ченко, В.П. Коробов, О.Н. Октябрьский, Г.В. Смирнова, и др.), Н.С. Печур-кина с соавторами, Г.И. Эль-Регистан, А.Н. Козловой, А.С. Капрельянца, Г.А. Осипова, В.А. Светличного и некоторых других отечественных и зарубежных исследователей, а также работы в области микроэкологии человека
Л.Г Перетца, Н.М. Грачевой, И.Б. Куваевой, Б.А. Шендерова, В.М. Бондаренко, чл.-корр. АМН И.В. Домарадского с соавторами, академика АМН А.А. Воробьева с соавторами и ряда других исследователей. Основные положения, выносимые на защиту:
Экспериментальные данные, в совокупности являющиеся доказательством существования у Е. coli и родственных микроорганизмов (S. marcescens, S. enteritidis и др.) системы саморегуляции численности и развития популяций, включающей позитивную и негативную регуляцию ростовых процессов (инициация роста, скорость роста, торможение и остановка роста) и выживаемости.
Идентификация в качестве автостимуляторов роста Е. coli М-17 янтарной и глутаминовой кислот; инициация роста бактерий низкими концентрациями ацетата.
Использование бактериями в качестве авторегуляторов численности и развития популяций неспециализированных соединений, в том числе обычных (кодируемых) аминокислот и низших карбоновых кислот.
Синергизм и специфичность действия авторегуляторов, в силу которых автостимуляторы роста одного штамма могут ингибировать рост родственного микроорганизма, сочетание нескольких соединений проявляет большую активность, чем индивидуальные вещества, сходные эффекты на различные штаммы оказывают различные соединения или/и различные комбинации этих соединений,
Участие идентифицированных продуктов метаболизма в регуля-торных процессах более высоких уровней (смешанные культуры, микробиоценозы, взаимодействия с организмом хозяина).
Перспективность использования авторегуляторов в составе пробио-тических препаратов и продуктов функционального питания.
Научная новизна.
Сформулированы критерии, позволяющие судить о наличии или отсутствии системы авторегуляции численности и развития популяций данно-
го вида (штамма) бактерий. Показано, что система авторегуляции у E.coli М-17 полностью отвечает сформулированным критериям. Аналогичные системы выявлены для других штаммов E.coli, S. marcescens, S. enteritidis и некоторых других микроорганизмов.
Впервые доказано существование и изучены свойства негативных регуляторов выживаемости бактерий (УГ-факторов) - низкомолекулярных эк-зометаболитов, ускоряющих гибель клеток при высокой плотности их популяции.
Определены условия возникновения колебаний численности при голодании бактерий. Показано, что эти колебания происходят преимущественно в культурах переходной (сверхкритической и субкритической) плотности, являются следствием «неустойчивости» состояния популяции как динамической системы и возникают в результате попеременного действия стимуляторов роста и УГ-факторов.
Разработаны методы выделения автостимуляторов роста микроорганизмов. С использованием этих методов впервые идентифицированы автостимуляторы роста бактерий, которыми для E.coli М-17 оказались янтарная и глутаминовая кислоты.
Получены новые данные относительно биологической активности ацетата: впервые показано, что ацетат является не только ингибитором, но и стимулятором роста бактерий и может выполнять функции плотностно-зависимого регулятора развития их популяций. Предложено новое объяснение, согласно которому выделение ацетата и других метаболитов обусловлено их регуляторными функциями на популяционном уровне, а не наличием «дефектов» в организации внутриклеточного метаболизма.
Показано что идентифицированные автостимуляторы, а также ряд других аналогичных соединений (аминокислот, продуктов брожения и т. д.), могут осуществлять коммуникативные функции на межвидовом уровне, например стимулировать рост собственного штамма и подавлять
развитие других штаммов, и наоборот, регулируя таким образом соотношение видов в смешанных культурах и микробиоценозах.
Созданы не имеющие аналогов искусственные (модельные) композиции метаболитов бактерий, не отличающиеся по биологическим свойствам от нативных растворов метаболитов или значительно превосходящие их по способности стимулировать рост бактерий. Впервые выдвинуто положение о возможности использовать эти композиции для нормализации состава и повышения физиологической активности собственной микрофлоры хозяина. В опытах на лабораторных животных показана эффективность подобной композиции (Актофлор-С) при коррекции дисбиотического состояния и в лечении язвенного процесса.
Полученные данные являются основой для формирования нового направления, посвященного выявлению и изучению регуляторных функций «неспециализированных» метаболитов.
Результаты работы защищены Авторским свидетельством №1638156 (1990) и Патентами России №2090612 (1997), №2180576 (2002) и №2233875 (2004), получено решение на выдачу патента по заявке №2005108334.
Практическая и теоретическая значимость.
Результаты работы нашли практическое применение при выращивании пропионовокислых и молочнокислых бактерий на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов. Разработанные в. диссертации методы позволили повысить стабильность и стандартность выпускаемых бактериальных препаратов и одновременно сократить на 15-20% время культивирования, количество потребляемой чистой воды и жидких отходов.
Разработаны подходы для создания лечебно-профилактических препаратов на основе низкомолекулярных метаболитов микроорганизмов (Ак-тофлор). Показана возможность конструирования их синтетических аналогов (Актофлор-С) с более высокой биологической активностью и улучшен-
ными физико-химическими характеристиками. Препараты Актофлор и Ак-тофлор-С прошли соответствующий цикл испытания на отсутствие общей, хронической и специфической токсичности в институте токсикологии МЗ РФ. Исследования в СПб МАЛО показали, что Актофлор в составе биологически активной добавки Неовитал-пребиотик оказывает положительное влияние на состав кишечной микрофлоры и самочувствие больных. В экспериментах на животных показана эффективность применения Актофлор-С при дисбактериозах и язвенных поражениях. Оба препарата используются в качестве биологически активной добавки (ХБО при РАН «Фирма Вита»). Отмечается положительное влияние Актофлор на микрофлору кожи, структуру и прочность волос. На основании успешного применения Актофлор для восстановления кишечной микрофлоры у больных хроническими хла-мидиозами (ВМедА им. СМ. Кирова) сделан вывод о целесообразности его использования самостоятельно или в сочетании с бактериальными препаратами. В последнем случае эффективность действия тех и других препаратов увеличивалась. Полученные результаты изложены в монографии коллектива авторов ВМедА «Хламидийные инфекции» (СПб, 2003).
Опубликованные в открытой печати данные использовались при создании аналогичного Актофлору препарата «Микростим» («Пермское НПО «Биомед»), определении методических подходов для оценки его бактерио-тропного действия и при создании концепции перспективного применения метаболитных комплексов в технологии пробиотических препаратов.
Разработанные в диссертации методические подходы применяются для изучения пролиферативной активности эукариотических клеток при разработке и тестировании активности антиопухолевых препаратов (лим-фолитин) [Тяготин и др., 1996, 1998]. Материалы работы используются в научно-исследовательской практике, учебных процессах, в лекционных курсах, пособиях для врачей, статьях, монографиях, дипломных работах, диссертациях, в глобальной сети Интернет и могут являться теоретической основой для формирования новых направлений исследований, в том числе:
поиск систем саморегуляции, аналогичных изученным, у других микроорганизмов и на других уровнях организации (развитие тканей, органов, популяций растений и животных);
выяснение молекулярных механизмов действия неспециализированных регуляторов: аминокислот, карбоновых кислот, спиртов и некоторых других продуктов с использованием современных методов ге-номики и протеомики;
разработка нового поколения пробиотиков, обладающих повышенным терапевтическим действием за счет введения в их состав регу-ляторных факторов, и совершенствование системы отбора новых штаммов пробиотиков;
совершенствование биотехнологических процессов путем использования базисных закономерностей саморегуляции развития популяций.
Итоги работы позволяют поставить вопрос о расширении понятия «авторегулятор» и включить в круг регуляторных соединений ряд неспе-циализированньгх в этом отношении метаболитов. Это создает теоретические предпосылки для реконструкции эволюции регуляторных систем, начиная от регуляторных функций элементарных метаболитов (СО2, N0, НСООН, СНзСООН, аминокислот и других простейших органических веществ) и кончая сложными соединениями пептидной, белковой или иной природы.
Практическое использования результатов работы подтверждено соответствующими публикациями и Актами о внедрении. Препарат Актофлор отмечен дипломом первой степени и медалью Недели высоких технологий в Санкт-Петербурге (12-15 июня 2001 г), за его разработку автор диссертации награжден медалью лауреата Всероссийского выставочного центра (постановление от 30.12.93г № 55-Н).
Проблема саморегуляции развития микробных популяций. Исторический обзор
Проблемы саморегуляции развития микробных популяций, коммуникации микроорганизмов и регуляторных функций бактериальных экзомета-болитов возникли более 100 лет назад при изучении роста простых периодических культур, хотя в то время они не могли быть сформулированы в рамках современных концепций. Наблюдения за динамикой численности микроорганизмов показали, что после засева в свежую питательную среду клетки начинают делиться не сразу, а по истечении некоторого промежутка времени. На первом этапе роста частота деления клеток увеличивалась, достигала своего максимального значения, а затем вновь уменьшалась. Эти закономерности позволили разделить весь процесс роста на ряд последовательных стадий: лаг-фаза, стадия логарифмического роста и стадия замедления роста [Muller, 1895; Winslow & Walker, 1939].
Продолжительность лаг-периода зависела от многих факторов, в том числе и от размера внесенного инокулята. Чем больше вносилось клеток в свежую питательную среду, тем короче был лаг-период. При засеве слишком малого количества клеток рост мог и вовсе отсутствовать. Обсуждая эту проблему в работе «Мемуар о спиртовом брожении», Луи Пастер писал, что дрожжи, будучи разведены в чистой или сахарной воде, отдают ей часть своих жидких или растворимых элементов. В отфильтрованной жидкости обнаруживаются белковые и минеральные вещества, наличие которых приводит к развитию и размножению дрожжей. Дрожжи сами содержат, по крайней мере частично, эти азотистые и минеральные легко растворимые вещества. Таким образом, как только их прибавляют к сахарной воде, они имеют все, что им необходимо для жизни (цит. по [Пастер, I960]).
Начало систематического изучения этих веществ обычно связывают с работой студента 3 курса Лувенского университета (Бельгия) Е. Вильдье (Wildiers), выполненной в лаборатории биологической химии под руководством профессора М. Иде (М.Ые). Работа была представлена на конкурсе студенческих работ, удостоена премии и по этой причине вышла в печати только под одной фамилией Вильдье [Wildiers, 1901].
Сам Вильдье, получив в университете медицинское образование, научной работой больше не занимался и вскоре (1906) погиб при ликвидации эпидемии скарлатины. Как и Пастер, Иде и Вильдье обнаружили, что рост и брожение дрожжевой культуры на синтетической минеральной среде отсутствовали если в качестве посевной вносилось очень мало клеток. Брожение и размножение наблюдались, когда в культуру дополнительно вносился экстракт из дрожжей или количество клеток было сравнительно велико.
Вещество, или вещества, необходимые для роста или брожения помимо основных источников азота и углерода, были названы «биос». В работе Вильдье отмечалось, что это название является условным и должно быть заменено на химическое после установления состава «биос». Сходные наблюдения принадлежали российскому ученому Я.Никитинскому, который, как и Пастер, показал (1904), что в процессе роста дрожжей и плесневых грибов в среду выделяются вещества, способные активировать размножение разнообразных микроорганизмов [Мейсель, 1950].
Объяснения, выдвинутые Иде и Вильдье, без точного доказательства реальности существования вещества «биос» не удовлетворили многих крупных ученых того времени, таких как Коссович, Виндиш, Дельбрюк, Прингсгейм, Линднер и некоторы других [Одинцова, 1959]. Так, например, Дельбрюк полагал, что роль добавленного органического вещества сводится к связыванию ингибирующих рост тяжелых металлов, Линдлер указывал на возможное «вредное» действие кислорода, Прингсгейм объяснял наблюдаемые явления тем, что отмирающие дрожжевые клетки могут выделять вещества, повышающие выживаемость других клеток [Мейсель, 1950].
В защиту представлений о «биосе» выступили Иде (Ide, 1907, 1921, 1931), его ученик Аман (Amand, 1902, 1904) и Р.Девло (R.Devloo, 1906). Систематическое изучение «биоса» было предпринято Миллером (L. Miller) и Кеглем (Kogl). В работах этих авторов было показано, что различные фракции «биоса», адсорбируемые теми или иными адсорбентами и растворимые в различных растворителях, обладают, хотя и сильно различающейся, но все же выраженной способностью стимулировать рост выбранных в качестве индикаторных культур дрожжей. Работы школы Миллера привели к важному выводу о комплексном строении «биоса». В 1928 г Исткот (East-cott) определила, что активной частью одной из фракций («биос I») является давно известное вещество мезоинозит (гексаоксициклогексан). В 1936 г Кегль совместно с Теннисом вьщелил наиболее активный компонент биоса («биос II») и назвал его биотином. Это название было выбрано Кеглем в созвучие с названием «биос». В это же время Миллер показал, что некоторые аминокислоты, входящие в состав биос-комплекса, обладают определенной активностью, а Вильяме и Рорман (Williams & Rohrman, 1936) представили доказательства высокой активности для дрожжей Р-аланина.
Тремя годами ранее Вильяме с сотрудниками открыли фактор, активирующий размножение дрожжей, названный пантотеновой кислотой. Позднее в состав биос-комплекса были включены витамин Вб, параамино-бензойная и фолиевая кислоты. В очень малых количествах для развития дрожжей оказались необходимыми некоторые аминокислоты, получившие по этой причине название «микроаминокислот» (лейцин, метионин, треонин, цистеин). Существенную роль играли глутаминовая кислота и аспара-гин [Мейсель, 1950].
Культуры бактерий и условия их хранения
В работе использовались следующие штаммы микроорганизмов:
Escherichia coli М-17 (производственный, ГИСК им. Тарасевича);
Kcoli BL 21 (ВНИИ генетики);
E.coli К-12 (ЛИЯФ им. Б.П. Константинова);
E.coli К-165 (производный от E.coli К-12 термочувствительный штамм, дефектный по гену гроН (о ), ЛИЯФ им. Б.П.Константинова);
E.coli 075 №5557 Н1у+ (cnfl+; irp2+; fimA-) (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи);
Serratia marcescens В-Ю-М-1 (Вышневолоцкий завод ферментных препаратов);
Salmonella enteritidis var. Isatchenko (Гос.НИИ ОЧБ);
Lactobacillus acidophilus Д 75 (Гос.НИИ ОЧБ; ВНИИ СХМ, РАСХН);
Lactobacillus acidophilus Д 76 (Гос.НИИ ОЧБ; ВНИИ СХМ, РАСХН);
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus АТСС 21815
Bifidobacterium adolescentis MC-42 (Гос.НИИ ОЧБ).
Музейные культуры хранили в сублимированном виде в стеклянных ампулах при +4С. Активацию культур проводили на среде МРС (лактоба-циллы), на кукурузно-лактозной среде с добавлением 0,15% агара {В. adolescentis), на аминопептиде (С-Пб завод мед. препаратов), разбавленном (1:3) дистиллированной водой, или среде LB (все остальные).
Содержимое ампулы растворяли в 2 мл дистиллированной воды, ре-гидратировали 30 минут при 25С и переносили 0,1 мл суспензии в 10 мл соответствующей среды. Культивирование проводили в течение 18 часов при 37С в статических условиях. Культуры первого пассажа использовали для выращивания инокулята или рассевались в чашки Петри (или в пробирки со скошенным агаром) для последующего использования.
2.2 Стандартное выращивание Escherichia coli М-17
Стандартное выращивание Е. coli М-17 использовали при изучении роста (глава 3) и последующего голодания бактерий (глава 4), а также в целях получения препаратов экзометаболитов (главы 5-7). Культуру выращивали 3-мя основными способами: в колбах на качалке, барботажным и в ферментаторах АКЛ-10 (Россия) и Microferm (New Brunswick, США) с рабочим объемом колб 7 и 12 литров соответственно. Для выращивания использовали глюкозо-минеральные среды М-17 (состав среды М-17 в г/л: Na2HPO4-l,0; КН2РО4-1,0; цитрат аммония-4,5; NaCl-5,0; Na2C03-l,5; MgSO4x7H2O-2,0, никотиновая кислота-0,005, рН 7,2) или М-9 (г/л: NH4CI-I; KH2POr3; Na2HP04-6; MgSO4x7H2O-0,13; CaClr-0,1; никотиновая кислота-0,005; рН=7,2). Исходная концентрация глюкозы обычно составляла 3-4 г/л.
Подготовка инокулята выполнялась по следующей схеме: исходную культуру выращивали на плотной питательной среде (МПА) в течение 20 часов при 37С, смывали минеральной (без глюкозы) средой М-17 или М-9, промывали в ней, осаждали центрифугированием, вновь суспендировали в ростовой среде до конечной концентрации, соответствовавшей 0,2-0,4 единицам оптической плотности (D46o), добавляли глюкозу, разливали по колбам (0,75 л со 150 мл среды) и выращивали на качалке со скоростью перемешивания 150-170 об/мин при 37С до стационарной фазы роста (конечная плотность культуры 6-8 D460). Полученную культуру использовали непосредственно в экспериментах или в качестве посевного материала.
Выращивание на качалке проводили в тех же условиях, что и выращивание посевного материала. В ряде экспериментов использовали отмытый посевной материал. Для его приготовления клетки инокулята осаждали центрифугированием, суспендировали в эквивалентном или 3-5-кратном объеме свежей среды М-17 или М-9 без глюкозы, вновь осаждали и ресуспендировали. Полученную суспензию использовали в качестве инокулята.
Барботажное культивирование осуществляли в специально оборудованной 10-литровой бутыли, содержащей 6 литров среды, по заранее отработанной схеме. Схема культивирования включала увеличение принудительной подачи воздуха от 0,6 до 6 литров/мин, периодическую подпитку (2, 3, 4 и 5-ый час культивирования), поддерживающую концентрацию глюкозы около 0,3 г/л, и периодическую коррекцию рН (подтитровка NH4OH), проводившуюся ежечасно, начиная с 3-х часов роста. Исходная концентрация клеток (КОЕ) составляла около ІхІО9 кл/мл (0,8-1,2 D46o). Конечная оптическая плотность - 15-25 D46o(8-12xl09 кл/мл).
Выращивание в ферментаторе проводили при автоматическом поддержании рН в пределах 7,2-7,4 (подтитровка 25% раствором NH4OH), концентрации глюкозы и насыщения среды кислородом на уровне 40-60% от максимального (увеличение расхода воздуха от 2 до 20 л/мин и оборотов мешалки от 100 до 1000 мин"1) при 37С. Как и при барботажном способе, исходная концентрация клеток (КОЕ) составляла около 1 109 кл/мл. Выращивание продолжалось 6-8 часов и завершалось на стационарной фазе роста после исчерпания расчетного количества питательной добавки. В зависимости от ее количества конечная оптическая плотность культуры составляла 25-50 D46o что соответствовало концентрации бактерий от 15 до 40 млрд. кл/мл.
Спектрофотометрический контроль роста
Периодизация роста культур явилась по существу первым шагом на пути изучения межклеточных взаимодействий у бактерий (см. раздел 1.1.З.). Для контроля роста первоначально использовались высевы на плотные питательные среды, микроскопический подсчет клеток и определение их размеров.
С 30-х годов прошлого столетия в исследовательскую практику вошли оптические методы, позволявшие судить о концентрации клеток по мутности или оптической плотности суспензии. Соотнесение данных измерений с определенной независимым способом концентрацией клеток (например, путем их микроскопического подсчета) позволяло делать заключение об их среднем объеме. Авторы первых публикаций ограничивались интуитивным пониманием того, что при одинаковой концентрации клеток оптическая плотность будет выше у суспензии более крупных бактерии. Исследования последующих лет показали, что этот показатель (D) линейно зависит от концентрации клеток (N) и приблизительно пропорционален их среднему объему (V) в степени 4/3 [Koch, 1961,1968,1986;Герхардтидр., 1983]:
D=kxNxV4/3, где к - коэффициент пропорциональности.
Используя это соотношение, можно подсчитать изменение объема клеток в экспериментах Херши и Вильсона (см. раздел 1.1.5.). В первом случае отношение мутности суспензии (показание нефелометра) к концентрации микроорганизмов за 3 часа роста от момента засева возрастало в 6-8 раз, что можно записать следующим образом: D3/D0 = (V3/V0) =8. Извлекая корень степени 4/3 из 8, находим, что объем клеток увеличился в 4,76 раза. Во втором случае, на более поздней стадии роста (с 4 до 26 часов), наблюдалось 5-кратное увеличение прозрачности культуры. Аналогичный расчет показывает, что объем клеток при этом уменьшился приблизительно в 3,3 раза. Следует, однако, отметить, что эти оценки носят приблизительный характер, поскольку справедливы только когда сравниваемые бактерии имеют одинаковую форму, показатель преломления, не содержат светорассеиваю-щих включений и т.д.
В связи с нелинейной зависимостью светорассеивающих свойств от объема клеток, возникает важный и интересный вопрос: что произойдет с оптической плотностью культуры, если все клетки одновременно (синхронно) разделятся? Количество клеток в процессе синхронного деления удваивается, а их объем уменьшается приблизительно в 2 раза. По этой причине конечная (после синхронного деления) оптическая плотность культуры (DK) должна быть равна удвоенной начальной плотности (2DH), умноженной на возведенное в степень 4/3 частное от деления конечного объема клетки на ее начальный объем (VJVn= 1/2):
В процессе синхронного деления, таким образом, оптическая плотность суспензии должна уменьшаться приблизительно на 20%. В наших экспериментах было показано, что это теоретическое заключение хорошо согласуется с экспериментальными результатами. Так, например, реальным понижением оптической плотности сопровождался процесс самосинхронизации культуры перед наступлением стационарной фазы, изученный в работе Калтера и Эванса [Culter & Evans, 1966]. В других случаях оптическая плотность изменяется значительно меньше, поскольку деление всех бактерий осуществлялось не единовременно и сопровождалось непрекращающимся ростом их объема. На фоне интенсивных ростовых процессов вместо падения D обычно наблюдается лишь уменьшение абсолютной или удельной скорости ее прироста (цо):
Величина ц0 имеет смысл «кажущейся» удельной скорости, совпадающей с «истинной» удельной скоростью только при условии полной сбалансированности роста, то есть при неизменности средних морфологических показателей бактерий (объем, форма, показатель преломления и т.д.).
Нередко, однако, понижение D, сопровождающее синхронное деление, ошибочно принимают за начало автолиза культуры. Чтобы различить эти два процесса, оптическая плотность в наших работах измерялась не на одной, а на двух и более длинах волн, то есть регистрировался так называемый спектр мутности [Петухов, 1965; Кленин и др., 1977]. Ключевым моментом при обработке спектров мутности является вычисление волнового экспонента (п) - показателя степени в соотношении Ангстрема: