Введение к работе
. Актуальность проблемы. Культура in vitro клеток, тканей и органов растений представляет собой один из развивающихся разделов биотехнологии, который обладает большим потенциалом для улучшения важных сельскохозяйственных, лекарственных и декоративных культур. В современной биотехнологии интенсивно развиваются такие области, как микроразмножение, мутагенез, получение гаплоидов, получение вторичных продуктов метаболизма растений, изменение генотипа растений методами генной инженерии. Большой интерес представляет регенерация растений, позволяющая получить полноценный организм из единичных измененных или неизмененных клеток.
Микроразмножение растений в настоящее время рассматривается как целостное достаточно хорошо разработанное коммерческое направление современной биотехнологии. В качестве важных источников усовершенствования растений рассматриваются также мутагенез и сомаклональная вариабельность, часто возникающая при культивировании растительных тканей in vitro. Явление сомаклональной изменчивости, как известно, при микроразмножении растений in vitro может оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на генотип. Поэтому представляет интерес сравнительное изучение разных способов микроразмножения растений в плане возможности возникновения сомаклональных вариаций. Особенно актуальна эта проблема для вегетативно размножаемых растений, так как любое приобретенное в культуре изменение может сохраняться при клонировании. Важной задачей при изучении сомаклональной изменчивости также является выбор адекватного метода для своевременной и быстрой идентификации возникающих вариаций.
Стахис Зибольда (Stachys sieboldii Miq.), или овощной стахис, представляет в этом плане интересный объект исследования, так как обладает целым рядом ценных пищевых и лекарственных свойств. Основной проблемой, с которой сталкиваются селекционеры при выращивании стахиса в России, является невозможность получения всхожих семян, вследствие чего его размножают только вегетативным путем с помощью клубней. Это сопровождается накоплением в посадочном материале фитопатогенов, что приводит к снижению его качества. С другой стороны, невозможность проведения скрещиваний затрудняет проведение программ по селекции новых сортов стахиса.
В связи с изложенным представлялось интересным использовать для улучшения данной культуры методы биотехнологии, которые позволяют решить многие из свойственных вегетативно
размножаемым растениям проблем: они дают возможность оздоравливать посадочный материал, получать клеточные варианты и растения, обладающие новыми свойствами, проводить селекцию in vitro высокопродуктивных форм, сохранять и размножать уникальные генотипы, а также получать стандартную биомассу в виде клеточных культур или растений, которая может служить сырьем для фармацевтической и пищевой промышленности.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка и сравнительное изучение разных методов микроклонального размножения овощного стахиса (Stachys sieboldii Miq.) и влияния условий культивирования на качество получаемых растений. Кроме того, изучали возможность получения новых вариантов с помощью химического мутагенеза in vitro. В связи с изложенным были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить эффективность разных способов размножения стахиса in vitro.
2.Получить серию растений-регенерантов овощного стахиса из узловых сегментов стебля и столонов путем адвентивного побегообразования на средах с низким и высоким содержанием цитокининов и после цикла последовательных регенераций;
З.Изучить возможность индукции каллуса и адвентивного побегообразования из каллуса S.sieboldii у эксплантатов различного происхождения;
4.Разработать условия мутагенеза S.sieboldii in vitro, получить серию мутагенизированных растений-регенерантов;
5.0пределить наличие (или отсутствие) изменений у полученных растений по морфологическим и биохимическим признакам, а также на молекулярном уровне с помощью RAPD метода.
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное изучение влияния разных условий микроразмножения и компонентов питательной среды на качество получаемых растений-регенерантов стахиса Зибольда. Установлена целесообразность применения белковых .маркеров для выявления сомаклональных изменений у регенерантов стахиса. Впервые показана возможность применения RAPD метода для анализа полиморфизма ДНК у регенерантов стахиса. Выявлены различия на уровне нуклеотидных последовательностей как между самими растениями-регенерантами, так и между регенерантами и контрольными растениями. Установлено, что размножение растений при низких концентрациях цитокининов обеспечивает получение мономорфного по всем показателям потомства. Была показана зависимость количества изменений от использованных концентраций
цитокининов. Так, увеличение концентрации цитокинина от I - 2 до 10 мг/л вызывало возникновение меньшего числа изменений в пероксидазных и RAPD спектрах, чем повышение его содержания с 10 до 20 мг/л или многоступенчатая регенерация: в последних случаях изменения наблюдались у всех исследованных регенерантов и они были сравнимы с изменениями у регенерантов, полученных после мутагенеза. Разработана принципиально новая методика индукции микроклубней у черенков стахиса in vitro.
Практическая значимость. Разработана лабораторная методика микроразмножения овощного стахиса с помощью микроклубней, индуцированных in vitro у черенков асептических растений в течение всего года. Это позволяет преодолеть явление сезонности размножения, свойственное размножению стахиса методом микрочеренкования, и избежать периода адаптации к внешней среде. Впервые были оптимизированы методики выделения ДНК и проведения RAPD анализа для S sieboldii. Путем изоферментного и RAPD анализа установлено появление вариаций среди растений-регенерантов, полученных на средах с повышенным содержанием цитокиинов и при увеличении циклов регенерации, что полезно учитывать в работах по клеточной инженерии растений при выборе метода размножения..
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и трех глав экспериментальной части, включающих главу материалов и методов исследования, две главы собственных исследований, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц и 28 рисунков. Список использованной литературы включает 177 источников.