Содержание к диссертации
Введение
1.Основная часть Обзор литературы
2.1. Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) кур
2.1.1. Распространение и ущерб, причиняемый этой болезнью
2.1.2. Характеристика рода Birnavirus семейства Birnaviridae
2.1.3.Клинические признаки и патологоанатомческие изменения
2.1.4. Патогенез болезни
2.1.5. Диагностика инфекционной бурсальной болезни Заключение по обзору литературы
2.2. Использование иммунологических реакций в диагностике инфекционных заболеваний
2.2.1. Использование полимерных микросфер в диагностике инфекционных заболеваний
3. Собственные исследования
3.1. Получение специфических компонентов для изготовления латексных диагностикумов
3.1.1. Получение очищенного антигена вируса ИББ
3.1.2. Получение отрицательной и специфической (положительной) сыворотки к вирусу ИББ
3.1.3. Выделение специфических иммуноглобулинов
3.1.4. Оценка качества ПС
3.2. Разработка латексной тест-системы для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни кур
3.2.1. Определение оптимальных концентраций и условий приготовления антительного иммуносорбента для реакции латексной агглютинации
3.2.2. Изучение диагностической ценности антительного латексного диагностикума
3.2.2.1. Изучение специфичности антительных латексных диагностикумов
3.2.2.2. Оценка чувствительности антительных латексных диагностикумов
3.2.2.3. Изучение стабильности антительных латексных диагностикумов
3.3. Разработка латексной тест-системы для выявления антигена вируса инфекционной бурсальной болезни кур
3.3.1. Отработка оптимальных концентраций и условий приготовления антигенного иммуносорбента для реакции латексной агглютинации
3.3.2. Изучение диагностической ценности антигенных латексных диагностикумов
3.3.2.1. Оценка чувствительности антигенной латексной тест-системы
3.3.2.2. Изучение специфичности антигенной латексной тест-системы
4.Заключение
4.1.Обсуждение результатов исследований
4.2. Выводы
4.3. Практические предложения
5. Список сокращений
6.Список литературы
- Характеристика рода Birnavirus семейства Birnaviridae
- Диагностика инфекционной бурсальной болезни Заключение по обзору литературы
- Разработка латексной тест-системы для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни кур
- Отработка оптимальных концентраций и условий приготовления антигенного иммуносорбента для реакции латексной агглютинации
Введение к работе
Актуальность темы. Благополучие по инфекционным болезням является одним из непременных условий успешного ведения промышленного птицеводства. Для крупных птицеводческих комплексов особую опасность представляют вирусные болезни, в том числе инфекционная бурсальная болезнь, из-за их недостаточной изученности, высокой контагиозности, большого разнообразия путей и факторов передачи инфекционного агента. Проблема вирусных болезней приобретает все возрастающую актуальность еще и по той причине, что некоторые инфекционные болезни стали протекать атипично, значительно возросла роль ассоциации различных агентов вирусной и бактериальной природы.
Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ, инфекционный бурсит, болезнь
Гамборо) – вирусная высококонтагиозная болезнь птиц, поражающая цыплят
2-15 - недельного возраста, сопровождающаяся диареей, поражением
фабрициевой сумки и в меньшей степени других лимфоидных органов. Болезнь
представляет большую опасность, обусловленную подавлением иммунитета
птиц к другим вирусным инфекциям (А.В. Борисов,1999, Калнек Б. У. , 2003;
В.А. Бакулин, 2006), вызывая задержку роста, развития молодняка и гибель
птицы. В настоящее время, несмотря на повсеместное применение средств
специфической профилактики против ИББ, наибольшее распространение
приобрела субклиническая форма болезни, которая протекает без клинических
проявлений, с продолжительным подавлением иммунитета, что создает
благоприятный фон для развития вторичных инфекций (Э.Д. Джавадов, 1988; В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, 2001; Б.Я. Бирман, 1998; В.И. Клюкина, 2002; А.С.Алиев, 2010), в этом случае болезнь протекает со сложной симптоматикой. В связи с этим основная роль в постановке правильного диагноза на ИББ принадлежит лабораторным методам.
Степень разработанности. Большинство методов, позволяющих выявить
вирус ИББ в организме птицы, обнаружить антитела к нему, основано на
реакции диффузионной преципитации, реакции нейтрализации, методе флуоресцирующих антител и иммуноферментном анализе (Л.А. Радчук, 1980; В.Н. Сюрин, 1991; Э.Д. Джавадов, 1988; А.С. Алиев, 1990). По данным литературы имеются сообщения о возрастающей роли в диагностике инфекционных болезней реакции агглютинации латекса (РАЛ), позволяющая повысить скорость в постановке диагноза. Реакция более проста в исполнении, не требует специального оборудования и высококвалифицированного персонала, экономически выгодна и тем самым наиболее приемлема в ветеринарной практике (А. Н. Бровкина, 2011). Учитывая широкое распространение в РФ инфекционной бурсальной болезни и масштабное производство биологических препаратов против нее, актуальным является разработка чувствительного и специфического экспресс-метода индикации антигена вируса в патологическом материале и выявлении специфических к вирусу ИББ антител в сыворотке крови кур.
Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка тест-
систем на основе реакции агглютинации латекса (РАЛ) для индикации антигена
вируса ИББ в патологическом материале и выявления антител к вирусу ИББ в сыворотке крови кур.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить
следующие задачи:
1. Разработать технологические схемы получения иммуноспецифических
компонентов тест-систем на основе РАЛ:
- изготовить очищенный препарат вируса ИББ, полученного из патологического
материала кур;
- изготовить очищенный и концентрированный препарат иммуноглобулинов из
сыворотки крови кур, иммунизированных вирусом ИББ;
2. Определить оптимальные концентрации компонентов и условия
приготовления латексных иммуносорбентов, сенсибилизированных антигеном
вируса ИББ и специфическими антителами.
3. Провести оценку лабораторных серий тест-систем по показателям качества
и определить возможность их применения для диагностики ИББ кур.
4. Сконструировать тест-системы (наборы) на основе РАЛ для выявления
вируса ИББ в патологическом материале и антител к вирусу в сыворотках
крови кур.
5. Разработать Методические положения по лабораторной диагностике ИББ
птиц на основе реакции агглютинации латекса и проекты нормативной
документации (Инструкцию по применению тест-систем, ТУ на тест-системы).
Научная новизна работы. Впервые в РФ для экспресс - диагностики ИББ кур разработаны тест-системы на основе реакции агглютинации латекса (РАЛ). Получены иммуноспецифические компоненты латексных тест- систем для индикации антигена вируса ИББ в патологическом материале, в процессе культивирования вируса, а также для выявления специфических к вирусу ИББ антител в сыворотках крови переболевших и/или вакцинированных кур.
Определены оптимальные концентрации компонентов и условия
приготовления латексных иммуносорбентов, сенсибилизированных антигеном вируса ИББ и специфическими антителами.
Установлена высокая специфичность и чувствительность разработанных тест-систем на основе реакции агглютинации латекса при обнаружении антигена вируса ИББ в патологическом материале и выявлении антител в сыворотке крови кур, вакцинированных против ИББ.
Проведены сравнительные исследования по индикации антигена вируса ИББ в РАЛ и РДП и выявления специфических к вирусу ИББ антител методами РАЛ, ИФА. Установлена корреляция результатов, полученных при определении уровня антител методами РАЛ и ИФА.
Показано, что метод диагностики ИББ с использованием тест-систем на основе РАЛ является простым в применении, и не требует специального оборудования, больших затрат труда и времени.
Разработана схема иммунизации кур вирусом ИББ с целью получения специфической иммунной сыворотки.
Теоретическая и практическая значимость исследований. На основании
проведенных исследований разработаны эффективный экспресс-метод
индикации антигена ИББ птиц в патологическом материале и в процессе
культивирования и выявления антител в сыворотках крови кур на основе реакции агглютинации латекса (РАЛ).
Разработаны «Методические положения по лабораторной диагностике ИББ птиц на основе реакции агглютинации латекса», рассмотрены Северо-Западным научным центром РАН, Санкт-Петербург, 2016 г. и утверждены в установленном порядке ФГБНУ ВНИВИП.
ТУ «Тест-система для индикации антигена вируса инфекционной бурсальной болезни кур в реакции агглютинации латекса (РАЛ)» - проект
ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-системы для индикации антигена вируса инфекционной бурсальной болезни кур в реакции агглютинации латекса (РАЛ);
ТУ «Тест-система для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни кур в реакции агглютинации латекса (РАЛ)» - проект
ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-системы для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни кур в реакции агглютинации латекса (РАЛ).
Документы рекомендованы к применению для ветврачей - вирусологов региональных, областных, зональных, и специализированных лабораторий, и научно-исследовательских учреждений ветеринарного и биологического профиля.
Методология и методы исследования. Методология работы включала
анализ научной литературы, поисковые исследования, основанные на
стандартных процедурах с использованием различных материалов и
естественно-восприимчивых животных. В работе использовали
вирусологические, биохимические, физико-химические, серологические и статистические методы исследований.
Положения, выносимые на защиту:
1. Технологические схемы получения иммуноспецифических компонентов
тест- систем на основе РАЛ:
- очищенного препарата вируса ИББ из патологического материала кур;
- очищенного и концентрированного препарата иммуноглобулинов из
сывороток крови кур, иммунизированных вирусом ИББ.
2. Оптимальные концентрации компонентов и условия приготовления
латексных иммуносорбентов, сенсибилизированных антигеном вируса ИББ и
специфическими антителами.
3.Оценка показателей качества новых тест-систем и возможности их
применения для диагностики ИББ кур.
4. Конструирование тест-систем (наборов) на основе реакции агглютинации латекса, Методические положения по лабораторной диагностике ИББ кур, проекты нормативной документации.
Степень достоверности и апробация результатов.
Научные положения, выводы и практические рекомендации,
сформулированные в диссертационной работе научно-обоснованы, достоверны и вытекают из результатов собственных исследований. Исследования проведены на большом фактическом материале с использованием современных методов исследований.
Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на
заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета
ФГБНУ ВНИВИП (2013-2016гг.); Всероссийской научно-практической
конференции «Современные подходы к решению актуальных ветеринарно-
санитарных и зоотехнических проблем в птицеводстве», 18 октября 2013 г.,
Санкт-Петербург - Ломоносов; Международной научно-практической
конференции «Ветеринарная наука в промышленном птицеводстве, посвящ. 50-летию ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии» (г. Санкт-Петербург, 30-31 октября 2014); Международной конференции «Актуальные проблемы развития ветеринарной науки, посвящ. 85-летию Самарской НИВС», (г. Самара, 16-17 октября 2014 г.).
Публикации. Основные положения диссертационной работы
опубликованы 5 в научных работах, в том числе 2 статьи в изданиях по
перечню журналов, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для
публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Результаты научных исследований соответствуют пунктам 1, 2 и 11 паспорта специальности 03.01.06. и пунктам 5, 9 и 14 паспорта специальности 06.02.02
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 119
страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение;
обзор литературы; собственных исследований, включающих материалы и
методы, результаты исследований; заключение, выводы; практические
предложения; список литературы, список сокращений и приложение.
Диссертация иллюстрирована 13 таблицами, 8 рисунками. Список
литературы включает 228 источников, из которых 132 зарубежных.
Личный вклад автора. Диссертационная работа (экспериментальные исследования, анализ и обобщение) выполнена автором самостоятельно. В ходе выполнения работы практическую и консультативную помощь оказывали директор ВНИВИП Джавадов Э. Д., зам. директора по научной работе ВНИВИП, научный руководитель Дмитриева М. Е., ведущий научный сотрудник ФГБНУ ВНИИТИБП, научный руководитель Скотникова Т. А., а также сотрудники отдела вирусологии и ОБП ФГБНУ ВНИВИП и отдела обеспечения качества лекарственных средств для ветеринарии ФГБНУ ВНИИТИБП, за что автор выражает им искреннюю благодарность.
Характеристика рода Birnavirus семейства Birnaviridae
Вирус инфекционного бурсита является представителем семейства Birnaviridae [106, 116, 170]. В этом семействе вирусы имеют геном, состоящий из двух сегментов спиральной РНК, отсюда и их название бирнавирусы [161, 170, 210]. Вирус покрыт белковой оболочкой. Вирион безоболочечный, имеет икосаэдральную симметрию, диаметром от 55 до 65 нм [132, 176]. Капсид обладает неправильной симметрией с коэффициентом триангуляции Т-13 и прямосторонностью [183]. В структуре вируса выявлено 5 белков, которые были названы VP1, VP2, VP3, VP4, VP5 [101, 116, 117, 176, 216]. В структуре вириона выявлены белки VP1, VP2b (происходящий из VP2), VP2a, предшественник протеина VP2 и VP3 [56]. Протеин VP2 ответственен за типоспецифичность, а VP3- за группо- специфичность.
Установлено 2 серотипа вируса ИББ. Вирусы 1 серотипа являются антигенно-гетерогенными (АГ). Вирус 1-го серотипа вызывает болезнь только у цыплят и насчитывает 6 подтипов. Вирус 2-го серотипа, выделенный от индеек, патогенен для различных видов домашних птиц [18]. Но дальнейшие исследования показали, что вирусы серотипа 2 могут быть выделены от кур [137], а антитела на серотип 2 часто встречаются как у кур, так и у индеек [138, 198] .
Вирус 1-го серотипа содержит белки VP1, VP2, VP3, VP4, а также VPx, являющийся предшественником VP2. У вируса 2-го серотипа обнаружены белки, соответствующие VP1, VP2, VP3 и VP4. Между вирусами двух серотипов существует небольшое родство. Так, например, АГ-родство двух серотипов вируса ИББ (Си-1 от цыплят и 23/82 от индюшат) не превышало 10 30%, поэтому перекрестный иммунитет минимальный [139]. Becht H. [102] сравнивал изоляты серотипов 1 и 2, и отметил схожесть результатов для изолятов одного серотипа. При этом оказалось невозможным различить штаммы вирусов серотипа 1 по разнице в структурных белках [218]. Серотипы различаются с помощью перекрестной реакции нейтрализации вируса с гомологичными сыворотками к серотипам. Иммунизация серотипом 2 не защищает от серотипа 1. Белки VP2 и VP3 являются основными белками вируса инфекционного бурсита птиц, которые составляют 51% и 40% из всего количества вирусных белков соответственно [116]. В то же время белки VP1 (3%) и VP4 (6%) являются второстепенными белками. Белок VP1 является полимеразной вирусной РНК, а VP4-вирусной протеазой [135, 174, 209]. Наличие белков, связанных с геномом, показывает, что вирус воспроизводит свою нуклеиновую кислоту по механизму замещения цепи РНК. РНК полимеразная активность может быть продемонстрирована без предварительной обработки вируса. Это показывает, что транскрипция и репликация происходят после проникновения в клетку без “раздевания” вируса [209]. Небольшой сегмент генома вируса болезни Гамборо (В) кодирует белок VP1, а большой сегмент (А)- оставшиеся вирусные белки [99, 135, 168]. На белке VP2 был обнаружен конформационный прерывистый нейтрализующий эпитоп, а на белке VP3-конформационный непрерывный эпитоп. Антитела на эти эпитопы осуществляют пассивную защиту птиц [100].
Серотип 1 представлен двумя вариантами –VA и IM. У цыплят, зараженных изолятом IM, некроз тканей фабрициевой сумки сопровождается воспалительной реакцией, а у птиц, зараженных вариантом VA, воспалительная реакция менее выражена. Кроме этого, изолят IM вызывает более сильные изменения в тимусе по сравнению с изолятом VA. Эти два варианта патогенны и не нейтрализуются полностью АТ против вируса серотипа 1 [203]. У переболевших ИББ цыплят продуцируются сывороточные вируснейтрализующие и преципитирующие антитела. Вирус не агглютинирует эритроциты кур, крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, крыс, морских свинок, лошадей, кроликов, человека [18, 84].
Диагностика инфекционной бурсальной болезни Заключение по обзору литературы
Поскольку диффузия реагентов из лунок в гель происходит радиально, это позволяет анализировать сразу несколько образцов иммунореагентов. Разместив вокруг лунки с антисывороткой несколько лунок с растворами разных антигенов, или наоборот, заполняют периферические лунки антисывороткой, а центральную – искомым антигеном. Или в центральную лунку вносят известный АГ, а в периферические – исследуемую сыворотку в разных разведениях. Метод двойной иммунодиффузии применяют преимущественно для качественного анализа, для определения природы АГ и АТ, но можно использовать и для полуколичественного определения АГ и АТ путем их титрования.
В диагностике инфекционной бурсальной болезни РДП используют для выявления вирусного антигена и для серологической диагностики болезни [9, 124, 178, 219, 226, 227].РДП высокоэффективна при ретроспективной диагностике для обнаружения антител к вирусу ИББ в сыворотках крови переболевших и вакцинированных птиц [9]. Чаще всего исследуют в РДП сыворотки крови от суточных цыплят или от птиц старше 3-х месяцев [8, 9, 44, 45, 55].
Для идентификации вируса ИББ в РДП требуются довольно высокие концентрации вирусного антигена. Известно, что высокоактивный антиген для РДП получают из гомогената фабрициевых сумок больных цыплят [8, 9]. Авторы показали, что преципитирующая активность антигена зависит от формы и тяжести течения болезни. Антиген максимально накапливается при остром течении болезни, при этом активность антигена у птиц с ярко выраженными клиническими признаками составляет 1:16-1:32.
Преципитирующие антитела к вирусу ИББ выявляются на 6-28 день после заражения или вакцинации цыплят и сохраняются в сыворотке крови от 42 до 338 дней [6, 9]. Отрицательный результат в РДП не говорит об отсутствии в сыворотке антител к вирусу ИББ, так как вируснейтрализующие антитела обнаруживаются через 3 недели и сохраняются значительно дольше [187, 221]. Следует отметить, что, несмотря на положительные стороны, РДП имеет недостатки: низкая чувствительность метода, короткий период выявления преципитирующих антител в сыворотке крови после заражения.
Реакция нейтрализации вирусов. Реакцию нейтрализации (РН) используют при вирусных болезнях как для определения специфических антител в сыворотке крови больной или переболевшей, вакцинированной птицы, так и для идентификации вирусов, выделенных из патологического материала. Принцип РН заключается в том, что специфические антитела способны ингибировать инфекционную активность вируса при смешивании вируссодержащего материала и специфической иммунной сыворотки [73]. Эффект нейтрализации вируса специфическими антителами определяют, вводя смесь в чувствительную биологическую систему, после выдерживания ее в течение определенного времени. Постановку РН осуществляют в двух модификациях: 1) с постоянной дозой вируса и разными разведениями специфической сыворотки; 2) с постоянным разведением специфической сыворотки и разными разведениями вируса.
О результатах РН судят по гибели чувствительных животных (эмбрионов) зараженных смесью вируссодержащего материала и сыворотки, или по клинической картине болезни. В культуре клеток определяют цитопатогенное действие (ЦПД), бляшкообразование. В случае выделения вируса у больного проводят его идентификацию [80]. Реакция нейтрализации является наиболее надежным методом при идентификации возбудителя ИББ и обнаружении специфических вируснейтрализующих антител [74, 115, 133, 165], чем РДП.
Вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови больных цыплят обнаруживаются, начиная с 13-го дня после заражения. В период с 13-21 день уровень антител наиболее высокий. Также, уровень антител зависит от возраста птицы, используемой для заражения. Так, у 4-недельных цыплят уровень антител выше (ИН 3,5 log), чем у 3-недельных (1,5-2 log). Способность вырабатывать антитела после введения вируса, у старших цыплят выражена сильнее, чем у молодых [194]. Антитела сохраняются в течении 3 месяцев. Вируснейтрализующие антитела обнаруживали через 3дня в титре 1:8 у цыплят, зараженных вирусом Cu-IM. Титр достигал максимального значения (1:8000) через 7 дней. По данным Алиева А.С. [6] антитела с титром в РН 6 log2 и ниже в РДП не выявляются, однако все сыворотки с титром в РН 11 log2 положительно реагируют в РДП. Автор утверждает, что такая чувствительность не требуется для проведения диагностических исследований, она необходима при оценке качества вакцин или при серотипировании вируса ИББ. РН также эффективна при оценке иммуногенной активности вакцинных препаратов, так как наличие высокого уровня нейтрализующих антител строго коррелирует со степенью защиты цыплят от заражения вирулентным штаммом [6].
Реакции с участием меченых антигенов или антител. В настоящее время широкое применение получили серологические реакции, в которых участвуют меченые антигены или антитела. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы. По своей чувствительности они превосходят все описанные выше серологические реакции. Иммунные комплексы выявляют по метке иммунореагента (АТ или АГ). В качестве метки используют: 1. Флюорохромы, способные флюоресцировать в ультрафиолетовых лучах (реакции иммунофлюоресценции - РИФ). 2. Ферменты при взаимодействии с субстратом обусловливают его распад, который можно выявить по изменению цвета или с помощью специальных приборов (реакции иммуноферментного анализа – ИФА). 3. Радиоактивные метки (реакции радиоиммунного анализа – РИА). 4. Ферритин – белок, содержащий до 28% Fe, хорошо видимый при электронной микроскопии (реакции иммунноэлектронной микроскопии – РИЭМ или ИЭМ). Требования, предъявляемые к меткам: 1) не должны менять специфичность иммунореагента; 2) не должны снижать аффинитет и авидность АТ; 3) при присоединении не должны терять своей активности; 4) должны легко выявляться; 5) должны быть нейтральными для окружающих людей и среды [77].
Разработка латексной тест-системы для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни кур
В результате исследований установлено, что очистка ВСМ с использованием МПС с диаметром пор 1200 , 0,01 М ФБР, рН 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 0,8 см3, приводила к оптимальному разделению вирусного и примесного белка. – с чем сравнивали, чтобы делать такой вывод?
Что подразумевается под утверждением «приводила к оптимальному разделению вирусного и примесного белка»?
По внешнему виду очищенный антиген вируса ИББ представлял собой светло-коричневую прозрачную жидкость, без хлопьев и осадка. Степень очистки вируса оценивали по белку. Очистка вируса составила 98,7%. Содержание белка в исследуемых пробах колебалось от 80 до 100 мкг в 1,0 см3. Таким образом, в результате проведенных исследований получен антиген вируса ИББ с высокой степенью очистки, который использовали для сенсибилизации ПМ и получения специфической гипериммунной сыворотки.
Отрицательную (нормальную) и специфическую (положительную) гипериммунную сыворотку крови кур к вирусу получали на выращенных в изолированных боксах клинически здоровых цыплятах 20-суточного возраста, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней.
Схема иммунизации кур была основана на введении нарастающих доз очищенного вируса. Установлено, что оптимальной для получения иммунной сыворотки с высокой активностью и специфичностью явилось схема, включающая трехкратное введение птице очищенного вируса ИББ: - двукратное подкожное введение антигена в объеме 0,5 см с интервалом в 7 суток; - третья внутрибрюшинная инокуляция через 7 суток в объеме 1,0 см. Через 14 суток после последней инокуляции антигена цыплят тотально обескровливали. Активность полученной гипериммунной сыворотки определяли в РДП в агаровом геле, используя в качестве антигена очищенный вирус ИББ. Установлено, что максимальная активность (титр) преципитирующих антител иммунных сывороток против вируса ИББ, была равна 1:512. Специфичность полученных иммунных сывороток определяли в РДП в агаровом геле, используя в качестве антигенов бурсальный антиген вируса ИББ штамм?; ЭЭЖ, содержащую вирус ньюкаслской болезни (НБ) штамм? с инфекционным титром 9,0 ЭИД50; образцы нормальной ЭЭЖ. Отрицательная сыворотка крови цыплят не содержала антител к возбудителям вирусных болезней, в том числе и к возбудителю ИББ.
Таким образом, была получена отрицательная сыворотка крови цыплят и положительная высокоактивная специфическая сыворотка крови к вирусу ИББ, необходимая для выделения суммарных иммуноглобулинов.
В связи с тем, что чувствительность и специфичность твердофазных методов исследования зависят от чистоты сенситина, для приготовления антительных иммуносорбентов используют гаммаглобулины, выделенные из иммунных сывороток. При использовании глобулиновых фракций достигается высокая концентрация активных белков в единице объема полимерных микросфер (ПМ), что ведет к повышению чувствительности диагностических тест-систем, а удаление альбумина и микроглобулинов способствует повышению специфичности [88]. Схема получения иммуноглобулинов представлена на рисунке ….. Иммунная сыворотка против вируса ИББ с титром в РДП 1:512 Удаление риванола из раствора иммуноглобулинов активированным углем (АУ) Удаление АУ из раствора иммуноглобулинов фильтрованием на воронке Бюхнера 3-х кратное осаждение иммуноглобулинов из фильтрата 30% -м раствором сульфата
Фракцию иммуноглобулинов (Ig) из иммунной сыворотки крови выделяли сульфатно-риваноловым методом. На первой стадии удаляли альбумин. К 0,3% водному раствору риванола при постоянном перемешивании со скоростью 4 капли в минуту добавляли сыворотку без консерванта с рН 7,1. Перемешивание продолжали в течение часа после добавления всей сыворотки. Смесь оставляли при температуре 40С на 15 часов, при этом выпадал плотный осадок альбумина. Надосадочную жидкость отсасывали сифоном. Риванол из раствора удаляли порошком активированного угля (АУ) марки «Merck Medicine». АУ добавляли при постоянном перемешивании до тех пор, пока пена не становилась бесцветной (0,5% АУ на весь объем смеси). Через 30 мин АУ отделяли на воронке Бюхнера через двойной фильтр из хроматографической бумаги. Замеряли объем смеси и устанавливали рН 7,1 добавлением 1М NaOH. На второй стадии проводили осаждение глобулинов при 45% насыщении 30% раствором сульфата аммония, который добавляли по каплям при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Раствор оставляли стоять до полного формирования осадка при температуре 40С в течение 10-15 часов. Осадок отделяли центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в ФСБ (рН 7,3-7,5), доводя общий объем до первоначального. Этот процесс повторяли 2-3 раза с целью очистки иммуноглобулинов от примесей. Далее проводили диализ против дистиллированной воды (рН воды ….. ) в течение 10-12 часов [93]. Полученные таким образом иммуноглобулины использовали для получения диагностической тест-системы на основе РАЛ для выявления антигена ИББ.
Отработка оптимальных концентраций и условий приготовления антигенного иммуносорбента для реакции латексной агглютинации
При создании тест-систем методом физической адсорбции биолигандов на поверхности полимерных микросфер (ПМ) до сих пор остается важным изучение влияния различных факторов (ионной силы, температуры, рН) на процесс физической адсорбции биолигандов на поверхности полимерных микросфер различной природы, которые определяют основные свойства диагностических тест-систем [81]. При разработке диагностических тест-систем на другие типы заболеваний [14, 39, 217], было показано, что недостатком этих диагностикумов было то, что белок, физически сорбированный поверхностью частиц, десорбировался в водную фазу при небольшом изменении условий (рН и ионной силы среды, температуры), что снижало чувствительность тестов и приводило к неспецифическим реакциям в процессе постановки РАЛ. Свободиыми от указанных недостатков оказались латексные тест-системы с использованием полимерных частиц, содержащие функциональные группы на поверхности, с которыми биолиганды были связаны ковалентно. Поэтому для получения антительного латексного диагностикума нами были взяты окрашенные полистирольные ПС с диаметром ПМ 1,0 мкм, содержащие на своей поверхности функциональные аминогруппы и проведено изучение влияния физико-химических факторов на чувствительность и специфичность РАЛ. Влияние физико-химических факторов на чувствительность и специфичность РАЛ контролировали по активности гипериммунной сыворотки к вирусу ИББ.
Наибольшую чувствительность РАЛ 1:2048 удалось получить при величинах адсорбции антигена на поверхности полистирольных микросфер при концентрации 10 мкг/см в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (рН 7,2-7,4). В этом случае, по-видимому, молекулы антигена имеют небольшой отрицательный заряд, который достаточен для стабилизации частиц и не препятствует проведению реакции РАЛ [35].
При подборе условий иммобилизации вируса ИББ на латексных частицах были использованы различные температурные режимы инкубации. Установлено, что оптимальной для сорбции антигена вируса ИББ на ПМ была комнатная температура (+20-25С) или температура термостата (+37С). Латексные диагностикумы на основе антигена вируса ИББ обладали 100% специфичностью, поскольку сенсибилизированные полимерные микросферы не взаимодействовали с антителами к гетерологичным возбудителям и глобулинами нормальной сыворотки кур.
Оценку чувствительности и специфичности разработанной латексной тест-системы проводили путем сравнительного анализа результатов тестирования сывороток в РАЛ и ИФА. Установлено, что латексный диагностикум на основе антигена вируса ИББ оказался специфичным и чувствительным, позволяя обнаруживать антитела в специфических сыворотках в титрах 1:400-1:3200. При этом прослеживается коррелирующая зависимость между уровнем антител, выявляемых в РАЛ и ИФА. Чувствительность РАЛ уступает иммуноферментной тест-системе не более чем в 10 раз. Результаты исследований проб сыворотки крови цыплят, иммунизированных живой вакциной против ИББ, доставленных из п/ф «Ударник» показали , что РАЛ была положительна в 93,5 %, а ИФА в 100 % случаев [35]. Следует отметить, что РАЛ по чувствительности уступает ИФА, но, учитывая, что эта реакции более проста в исполнении, не требует специального оборудования и высококвалифицированного персонала, она экономически выгодна и тем самым приемлема в ветеринарной практике.
Результаты исследований по стабильности показали, что латексные диагностикумы, приготовленные на основе очищенного антигена вируса ИББ, обладали достаточно высокой стабильностью при условии хранения их в защищенном от света месте при температуре 2-8С в течение 6 месяцев с добавлением азида натрия до конечной концентрации 0,05 % в качестве консерванта [35].
Синтетическими носителями антител против вируса ИББ могут быть ПМ, содержащие на своей поверхности карбоксильные функциональные группы, активированные с помощью водорастворимого карбодиимида (ВРК) [14, 21, 22].
При иммобилизации на латексных ПМ иммуноглобулиновой фракции сыворотки крови кур оптимальную дозу препарата подбирали путем использования разных его концентраций от 0,3 мг до 2,0 мг/см 0,5%-ной суспензии латекса, активированной карбодиимидом. Активность полученных диагностикумов изучали в РАЛ на стекле с очищенным антигеном ИББ птиц в разведении 1:10. Результаты исследований показали, что оптимальная концентрация Ig составила 0,5-0,6 мг/см 2%-ной суспензии латекса. Диагностикумы, полученные при иммобилизации более низких концентраций препарата 0,4-0,35 мг не обладали чувствительностью в РАЛ, а увеличение концентрации Ig на поверхности микросфер приводило к агломерации латексных частиц на стадии инкубирования [36].
Для установления пороговой чувствительности разработанной латексной тест-системы проводили сравнительные исследования по выявлению антигена вируса ИББ в экстраэбриональной жидкости (ЭЭЖ) СПФ куриных эмбрионов РАЛ и методом титрации. Десятикратные разведения ЭЭЖ, инфицированной вирусом ИББ, начинали с разведения 10-1 до 10-8. Результаты исследований показали, что диагностикум на основе ПС с карбоксильными группами выявлял антиген вируса ИББ в течение 2-4 минут при постановке РАЛ на стекле и при постановке РАЛ в планшете для иммунологических реакций в разведении 10-5. [36].
Специфичность диагностической тест-системы была подтверждена отсутствием реакции с антигенотрицательной ЭЭЖ и с гетерологичным антигеном вируса ньюкаслской болезни [36]. Лабораторные испытания стабильности антигенных латексных диагностикумов показали, что они сохраняли чувствительность и специфичность в течение 6 месяцев при условии хранения их в защищенном от света месте при температуре 2-8С с добавлением азида натрия до конечной концентрации 0,05 % в качестве консерванта [36].