Введение к работе
1. 1.1. Актуальность темы
Среди болезней, продолжающих наносить значительный ущерб
ивотноводству, а также представляющих угрозу жизни и здоровью
гловеку, важное место принадлежит зооантропонозным инфекциям
, прежде всего,' сибирской язве. Снижение числа неблагополучных
унктов - результат усиления общих противоэпизоотических меро-
риятий, проводимых' в очагах инфекции, и, главным образом, раз-
аботки и внедрения в практику более эффективных вакцин, а еже-
эдная регистрация спорадических случаев обусловлена биологиче-
кими особенностями возбудителя (самостоятельный паразитиче-
кий вид сохранивший свойства сапрофитов), что придает сибир
кой язве характер почвенно-очаговой инфекции, носящей стацио-
арный характер, которая раз возникнув в какой-либо местности
кореняется, сохраняя ..на многие десятилетия угрозу повторных
спышек. ; ,>
Для России указанная болезнь также остается чрезвычайно шасной и требует постоянного внимания, так как несмотря на зна-ійт'ельньїе успехи в деле предупреждения и искоренения сибирской звы в России, в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической и эпидемической ситуации, что связано с 'сложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения
1«
кивотноводства, особенно при круглогодовом отгонно-пастбищном
ІІ -
«держании животных (Н.Г. Ипатенко, 1998; И.А. Ургуев, 1999; И.А
Увеличение в отдельных пунктах числа животных, заболевши и павших от сибирской язвы, обусловлено запоздалой постановко диагноза и не своевременным проведением профилактических м( роприятий, что является результатом роста числа мелких ферм увеличения поголовья в личных подворьях, где животных иногда н вакцинируют против сибирской язвы.
В настоящее время для выявления и идентификации возбуді^ теля сибирской язвы широко используют серологические, биохимк ческие, микробиологические методы, определение чувствительнс сти к различным антибиотикам и бактериофагам, а также постаної ку биопробы на лабораторных животных. Продолжительный комплексный характер исследований при идентификации предш значен для исключения диагностических ошибок, которые могу иметь место из-за таксономической схожести представителей рс да Bacillus.
Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность чувствительность применяемых в настоящее время методов застаЕ ляет исследователей обратить особое внимание на разработку и вш дрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных специфичных методов диагностики возбудителя сибирской язвь основанных на анализе генома и антигенных детерминант, позве ляющих надежно выявлять возбудитель в объектах ветеринарноп надзора.
Эффективные диагностические препараты при сибирской язв могут быть созданы и на основе разработки серологических мето дов с использованием препаратов очищенного протективного анги
єна или его иммуногенных доменов, а применение генетического іаркирования детерминант сибиреязвенного токсина живых бакте-іиальньїх вакцин позволит, в перспективе, разработать лаборатор-іьіе тесты, позволяющие дифференцировать вакцинные штаммы от іирулентньїх и авирулентных изолятов Вас. anthracis, а также дру-их непатогенных бацилл.
Таким образом, указанные обстоятельства свидетельствуют о [еобходимости изучения структурно-функциональной организации енома и разработки чувствительных и специфичных тест-систем іа основе методов клеточной биотехнологий и генной инженерии [ля выявления возбудителя сибирской язвы, позволяющих диффе-іенцировать его от других непатогенных представителей рода ба-іилл, особенно при изучении атипичных и смешанных культур, вы-іеленньїх из проб почвы.
1.2. Цель и задачи исследования
Основной целью данной работы являлась разработка тест-истем для идентификации возбудителя сибирской язвы и определе-іие их значимости при проведении комплексных диагностических ісследований на сибирскую язву.
Для достижения указанной цели необходимо было решить сле-[ующие задачи:
- выбрать праймеры для избирательной амплификации различных участков генома и оптимизировать условия постановки ПЦР для об-«ружения фрагментов генома возбудителя сибирской язвы;
отработать условия получения концентрированных, очищеннь антигенов возбудителя сибирской язвы и оптимизировать услові постановки латекс-агглютинации для обнаружения специфическі антигенов и антител при сибирской язве;
изучить морфологические, культуральные и патогенные свойс ва культур микроорганизмов, выделенных из патматериала и прс почв скотомогильников в Бурятии и оценить пригодность ПЦР ДО идентификации возбудителя сибирской язвы.
1.3. Научная новизна работы
Разработана чувствительная и специфичная тест-система на оі нове ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нукле< тидным последовательностям плазмид, определяющих вирулентнь свойства и определены оптимальные условия ее проведения при вь явлении ДНК возбудителя сибирской язвы.
Изучен в сравнительном аспекте полипептидный состав ра> творимых антигенов вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и В. cereu Установлено, что полипептидный состав антигенов, выделенных і вегетативных клеток, спор и культуральной жидкости различакш между собой в зависимости от состава питательной среды и времен культивирования.
При изучении культурально-морфологических свойств и И( следований с помощью ПЦР 12 культур бацилл, выделенных из прс почв скотомогильника в местности Иркана Северобайкальского pai она Республики Бурятия, установлена изменчивость вирулентны свойств у выделенных сибиреязвенных штаммов.
1.4. Практическая значимость работы
Разработана тест-система на основе ПЦР для обнаружения фрагментов ДНК генов протективного антигена и капсульного оперона, рйгодная для идентификации возбудителя сибирской язвы и диффе-енциации вирулентных капсулообразующих штаммов от бескап-ульных вакцинных штаммов. Разработанная тест-система может ытй использована в качестве сигнального метода при исследовании типичных несмешанных культур микроорганизмов, выделяемых из роб патологического материала, почвы, воды при подозрении на ібирскую язву.
Отработана реакция латекс-агглютинации для выявления анти-:л к Bac.anthracis, пригодная для серологических исследований ри определении эффективности вакцинации животных.
На основании проведенных исследований разработаны Методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибиркой язвы полимеразной цепной реакцией" рассмотренные на засе-ании ученого совета института (протокол №.10 от 13.10.2000 г.) и гвержденные директором ВНИИВВиМ.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту:
- результаты исследований по разработке тест-системы на ос-ове полимеразной цепной реакции, позволяющие идентифициро-iTb!Bac."anthracis в пробах патматериала, почв и дифференцировать "о от других непатогенных представителей рода бацилл;
результаты исследований по очистке растворимых антигеної вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и использованию их в разра ботке тест-системы на основе латекс-агглютинации, позволяющее выявлять специфические антитела против сибирской язвы в сыю-ротках вакцинированных и переболевших животных;
изучение морфологических, культуральных и патогенны свойств бацилл, выделенных из патматериала и проб почв скотоме гильника в Бурятии и оценка пригодности ПЦР для идентификаци возбудителя сибирской язвы.
1.6. Апробация и публикация результатов
Материалы исследований доложены и обсуждены на: научно-практической конференции, посвященной 30-летию Прикаспийско го ЗНИВИ "Современное состояние и перспективы интеграции ве теринарной науки и практики в условиях реформирования прикас пийского региона", г. Махачкала, 1997 г.; международной научно практической конференции, посвященной 40-летию ВННИИВи\ "Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и эк зотическими болезнями животных", г. Покров 1998 г.; Всероссий ской научно-практической конференции, посвященной 30-летии ВНИТИБП "Научные основы производства ветеринарных биологи ческих препаратов", г. Щелково, 2000 г.; Международной конфе ренции посвященной 75-летию со дня рождения И.А. Бакулова, г Покров, 2000 г.
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных рабог.
1.7. Структура и объем диссертации