Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Тимозины и их свойства. Тимозин бета 4 9
1.2. Структура Тр4 10
1.3. Способы получения Тр4 10
1.4. Ацилирование белков in vivo 12
1.5. Биологическая активность Тр4
1.5.1. Кардиопротекторные свойства Тр4 14
1.5.2. тр4 стимулирует ангиогенез и неоваскуляризацию ишемизированного миокарда 16
1.5.3. Роль тр4 в развитии опухолей и метастазировании 17
1.5.4. Влияние тр4 на восстановление кожных покровов и рост волос 1.6. Обзор молекулярных механизмов, регулируемых активностью Тр4 19
1.7. Стратегия контролируемого высвобояедения вещества: способ доставки Тр4 к тканям 23
1.8. Сульфоксид ТР4 (TP4SO) 25
1.9. Активные аминокислотные фрагменты в составе молекулы Тр4 26
1.10. Применение Тр4 в клинике 29
2. Собственные исследования 30
2.1. Материалы и методы исследований 30
2.1.1. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения
рекомбинантного Тр4 человека до пилотного производства 30
2.1.1.1. Материалы 30
2.1.1.2. Приготовление буферных растворов 31
2.1.1.3. Выращивание инокулята штамма ER2566/ pERTEVrsTB4 для засева ферментёра 31
2.1.1.4. Культивирование штамма-продуцента ER2566/pERTEVrsTB4 в ферментёре 32
2.1.1.5. Разрушение биомассы 32
2.1.1.6. Подбор условий осаждения балластных белков из осветлённого клеточного лизата 33
2.1.1.7. Масштабирование процесса температурной обработки клеточного лизата 33
2.1.1.8. Хроматографическая очистка гибридного белка 33
2.1.1.9. Подготовка телец включения TEV-протеиназы
2.1.1.10. Поиск оптимального соотношения фермент/субстрат протеолитического расщепления гибридного белка 34
2.1.1.11. Масштабирование реакции протеолитического расщепления гибридного белка 34
2.1.1.12. Хроматографическое разделение дезацетилтимозина бета 4 и остаточного белка 34
2.1.1.13. Определение условий ингибирования реакции ацетилирования дезацетилтимозина бета 4 .35
2.1.1.14. Масштабирование реакции ацетилирования дезацетилтимозина бета 4 и очистка продуктов реакции на ОФ ВЭЖХ 35
2.1.1.15. Аналитические методы контроля 35
2.1.2. Разработка способов получения аналогов Тр4 в виде конъюгатов, устойчивых к
деградации в токе крови 36
2.1.2.1. Материалы 36
2.1.2.2. Подбор условий проведения реакции ацилирования дезацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты 36
2.1.2.3. Масштабирование реакции ацилирования деацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты 36
2.1.2.4. Очистка моногексаноилтимозина бета 4 37
2.1.2.5. Подбор условий проведения реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4 37
2.1.2.6. Масштабирование реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4 37 2.1.2.7. Очистка моносиалированного тр4 37
2.1.2.8. Подбор условий проведения реакции ПЭГилирования дезацетилтимозина бета 4 38
2.1.2.9. Масштабирование реакции ПЭГилирования дезацетилтимозина бета 4 2.1.2.10. Очистка моноПЭГилированного тр4 38
2.1.2.11. Определение структуры модифицированного тр4 38
2.1.2.12. Тестирование стабильности аналогов тр4 и химически синтезированного тр4 с использованием сыворотки крови 39
2.1.2.13. Аналитические методы контроля 39
2.1.3. Разработка интеин-опосредованного метода получения рекомбинантного Тр4 из
ацетилированного гибридного белка in vivo 40
2.1.3.1. Материалы 40
2.1.3.2. Приготовление питательных сред 41
2.1.3.3. Приготовление буферных растворов 41
2.1.3.4. Синтез олигонуклеотидов для клонирования 41
2.1.3.5. Создание рекомбинантной плазмиды pERb4-Gyr 42
2.1.3.6. Создание рекомбинантной плазмиды pERb4Gyr-RBS 43
2.1.3.7. Создание рекомбинантных плазмид pERb4GyrA-AcAla и pERb4GyrA-AcSer 43
2.1.3.8. Подбор условий ацетилирования in vivo 44
2.1.3.9. Оптимизация условий культивирования штамма-продуцента Е. coli C3030/pERb4GyrA-AcSer 2.1.3.10. Аффинная хроматография гибридного белка 45
2.1.3.11. ОФВЭЖХ 45
2.1.3.12. Аналитические методы контроля 45
2.1.3.13. Метод отбора клонов 46
2.1.3.14. Методы трансформации 46
2.1.4. Эффективность рекомбинантного Тр4 в спонтанной мышиной модели хронического
дерматита 47
2.1.4.1. Материалы 47
2.1.4.2. Определение эффективности рекомбинантного тр4 в спонтанной мышиной модели хронического дерматита 47
2.2. Результаты и обсуждение 48
2.2.1. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения
рекомбинантного Тр4 человека до пилотного производства 48
2.2.1.1. Масштабирование стадии культивирования штамма-продуцента и стадии разрушения клеточной биомассы 49
2.2.1.2. Осаждение балластных белков из осветлённого клеточного лизата 49
2.2.1.3. Оптимизация и масштабирование стадии анионообменной хроматографии гибридного белка.50
2.2.1.4. Оптимизация и масштабирование стадии протеолитического расщепления гибридного белка.51
2.2.1.5. Оптимизация и масштабирование стадии очистки дезацетилтимозина бета 4 52
2.2.1.6. Оптимизация и масштабирование стадии ацетилирования дезацетилтимозина бета 4 54
2.2.2. Разработка способов получения аналогов Тр4 в виде конъюгатов, устойчивых к деградации в токе крови 57
2.2.2.1. Ацилирование дезацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты 58
2.2.2.2. Сиалирование дезацетилтимозина бета 4 60
2.2.2.3. ПЭГилирование дезацетилтимозина бета 4 62
2.2.2.4. Определение структуры полученных аналогов ТР4 65
2.2.2.5. Определение стабильности полученных аналогов тр4 68
2.2.3. Разработка интеин-опосредованного метода для производства рекомбинантного Тр4
из ацетилированного гибирдного белка in vivo 69
2.2.3.1. Создание рекомбинантных плазмид pERb4GyrA-AcSer и pER - Tb4GyrA - AcAla 69
2.2.3.2. Проверка экспрессии генов штаммов-продуцентов и расщепления гибридного белка 70
2.2.3.3. Подбор условий ацетилирования in vivo 72
2.2.3.4. Протеолитический анализ последовательности тр4 76
2.2.4. Эффективность рекомбинантного Тр4 в спонтанной мышиной модели хронического дерматита 78
2.2.4.1. Влияние монотерапии препарата тр4 на проявление признаков дерматита 78
2.2.4.2. Отдаленные эффекты препарата тр4 на фоне дополнительной противомикробной и противогрибковой терапии 79
3. Выводы 81
4. Список литературы
- Биологическая активность Тр4
- Поиск оптимального соотношения фермент/субстрат протеолитического расщепления гибридного белка
- Масштабирование реакции ацилирования деацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты
- Разработка способов получения аналогов Тр4 в виде конъюгатов, устойчивых к деградации в токе крови
Биологическая активность Тр4
Терапевтические эффекты Тр4 во многом зависят от способов доставки Тр4 и применения его во время острой или хронической фаз после повреждения. В исследовательской работе Вао и коллег. [107] было проведено сравнение эффектов краткосрочного применения Тр4 (в течение первых 3 дней после повреждения) с эффектами длительного применения (в течение первых 3 дней после повреждения и далее каждый третий день до конца исследования). При краткосрочном применении наблюдали только тенденцию к улучшению, тогда как длительное применение приводило к значительному уменьшению размера зоны инфаркта и улучшению гемодинамической активности. Авторы отмечают, что, как в случае краткосрочного, так и длительного применения Тр4, монотерапия этим пептидом не оказывала ярко выраженной индукции неоваскуляризации в периинфарктной зоне, что, вероятно связано с недостаточной терапевтической дозой пептида для клинически значимых улучшений сердечной деятельности [107].
Методы, основанные на генной терапии, могут обеспечить более эффективное и длительное высвобождение Тр4 пептида in vivo. Например, длительная гиперактивация Тр4 посредством PiggyBac транспозонной системы с последующей технологией разрушения микропузырьков ультразвуком (UTMD), значительно увеличивает концентрацию высвобождаемого Тр4, что запускает пролиферацию резидентных взрослых EPDCs в сердце крысы с дифференцировкой в кардиоваскулярные клеточные линии и поддержанием местного ангиогенеза и артериогенеза [108]. Еще один подход, направленный на пролонгирование гиперэкспрессии Тр4 in vivo основан на использовании рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов (rAAVs). Было показано, что на фоне гиперэкспрессии Тр4 с помощью rAAVs уменьшается воспаление и риск острого отторжения трансплантата при кардиотрансплантации [109].
Благодаря использованию инструментария тканевой инженерии, такого как композитные гидрогели, были найдены более эффективные методы для контролируемой, надёжной и продолжительной доставки Тр4. Был опробован коллаген-хитозановый гидрогель для инкапсулирования Тр4 таким образом, чтобы обеспечить контролируемое высвобождение вещества, вызывая при этом локальный и пролонгированный эффект [110-112]. Эффективность высвобождения Тр4 из такой системы была выше, по сравнению с применением препарата в растворимой форме. При таком способе доставки вещества наблюдали улучшение эпикардиального роста эксплантов in vitro и значительное усиление ангиогенеза [110,113]. Аналогичная коллаген-хитозановая губчатая матрица с Тр4 также была протестирована на крысах с стрептозоцин-индуцированным диабетом. На задних конечностях крыс с признаками ишемии эта система контролируемого высвобождения Тр4 из матрицы работала пролонгированно ( 12 дней) и значительно улучшила реэпителизацию раны, кожную регенерацию и локальную васкуляризацию
Известно о применении инъекционного биоактивного гидрогеля in vivo с высвобождением как Тр4, так и васкулярных клеток, еще более эффективных для усиления регенерации миокарда с сохранением его сократительной активности, уменьшения размера инфаркта и увеличение плотности сети сосудов [114]. Для обеспечения большей надёжности и длительности высвобождения Тр4 совместно с мезенхимальными стволовыми клетками (MSCs) инкапсулировали в желативновые микросферы, в результате чего в присутствии Тр4 дифференцировка трансплантированных MSCs и их приживаемость были значительно усилены [115].
Недавно Тр4-обогащенные гидрогели были использованы в качестве субстратов для выращивания сосудистых имплантов для сердечной ткани in vitro. На Тр4-индуцированнную капиллярную структуру импланта были добавлены неонатальные кардиомиоциты. Было продемонстрировало, что кардиомиоциты, выращенные на такой капиллярной структуре, имели более качественную структурную организацию с более низкой пороговой величиной возбуждения, чем образцы, полученные в контрольных условиях [116]. Также недавно была разработана биосовместимая и биоразлагаемая нановолоконная матрица, покрытая Тр4. Добавление к такой наноматрице Тр4 позволило получить кардиомиоциты для трансплантата с более выраженной функциональной активностью [117].
Важным представляется время апликации Тр4. Несмотря на то, что в мышиных моделях применение пептида после повреждения, способствует активации клеток-пердшественников EPDCs, увеличению плотности сети коронарных сосудов, однако оно не влияет на дифференцировку EPDCs в кардиомиоциты [64,118]. Таким образом, применение Тр4 до повреждения увеличивает эффективность плюрипотентной индукции функционально активных EPDCs.
В аминокислотной последовательности Тр4 в 6 положении находится аминокислотный остаток метионина, который может быть окислен в организме до сульфоксида, в результате чего образуется молекула TP4SO, обладающая иными свойствами по сравнению с нативной молекулой Тр4. В статье Yarmola и др. [119] указано, что вследствии окисления метионина происходит разрушение N-концевой спирали Тр4, что снижает аффинность к актину в 20 раз. Также наличие в молекуле Тр4 сульфоксида способствует более выраженному ингибированию миграции нейтрофилов, в сравнении с нативной молекулой [120]. В то же время TP4SO способствет усилению стимуляции миграции миоцитов и их предшественников в скелетных мышцах [121], а также миграции эндотелиальных клеток, полученных из пупочной вены человека [120]. Определенное соотношение TP4SO и Тр4 определяют внутриклеточно и в разных биологических жидкостях организма, в том числе в смыве бронхоальвеолярной жидкости. Считается, что изменение такого соотношения может служить в качестве биомаркера окислительного стресса лёгкого, например, при курении [122-124]. Следует отметить, что TP4SO обладает свойством ингибировать активность некоторых ферментов в легочной ткани и способствовать восстановлению ее структуры [125, 57]. Таким образом, TP4-SO обладает регенерирующими свойствами и может рассматриваться в качестве маркера хронического воспаления.
Поиск оптимального соотношения фермент/субстрат протеолитического расщепления гибридного белка
Полисиаловая кислота (ПСК) неиммуногенна и биодеградируема, кроме того, уменьшает иммуногенность самого модифицируемого белка. Модифицированные полисиаловой кислотой молекулы белка не подвержены фагоцитозу, а время их циркуляции в крови значительно увеличивается [166, 167]. В качестве сиалирующего агента использовали бутиральдегидное производное полисиаловой кислоты (14 кДа). Реакция сиалирования протекает в две стадии: результатом первой является образование нестабильной кратной связи -CH=N- (основания Шиффа), котороя на второй стадии при восстановлении цианборгидридом натрия переходит в прочную связь -CH2-NH- [168].
Оптимальные условия для указанной реакции определяли экспериментально: путем изменения соотношения ПСЬСбелок от 1:1 до 10:1, а также рН (3-6) и содержания ацетонитрила (0-45%) при времени инкубирования реакционной смеси 3 ч (Рис. 25). Результаты эксперимента, выполненного совсместно с Есиповым Р.С, представлены в [164].
Было обнаружено, что изменение рН раствора в диапазоне от 4,5 до 6,0 практически не влияло на выход сиалированного Тр4, а при рН ниже 4,0 происходило разрушение полисиаловой кислоты. Поэтому все последующие эксперименты проводились с фиксированным значением рН выше 4,0. В результате исследований были подобраны такие условия реакции, при которых достигался 58%-ный выход моноконъюгата: 30% ацетонитрила, отношение ПСЬСбелок =5:1, рН 4,5-6,0. Увеличение концентрации ацетонитрила выше 30% не приводило к значимому увеличению выхода моносиалированного тимозина бета 4. x " ш
Затем была проведена наработка полупрепаративного количества сиалированного Т34 и очистка полученного аналога с помощью полупрепаративной ОФ ВЭЖХ (Рис. 27, А). При этом среди продуктов сиалирования Т34 было обнаружено несколько фракций модифицированного пептида с различной молекулярной массой (Рис 27, В). Связано это было с неоднородностью самого исходного реагента, в котором присутствовали ее бутиральдегидные производные ПСК с молекулярной массой от 10 до 18 кДа, что и приводило к образованию продуктов сиалирования дезацетилтимозина бета 4 с разной молекулярной массой. Фракции с 3 по 7, представляющие собой сиалированный Т34 с молекулярной массой от 18 до 13 к Да, объединяли и лиофилизовали. Полученный лиофилизат использовали для биологических исследований.
Важным свойством модифицированных полиэтиленгликолем молекул белков является их высокая гидрофильность. Высокое содержание атомов кислорода позволяет молекуле ПЭГ образовывать водородные связи с молекулами воды, что влечет за собой формирование "водного облака" вокруг модифицированной молекулы "ПЭГ - белок", за счет чего значительно увеличивается ее гидродинамический радиус [170-172], что повышает её растворимость и биодоступность, а также защищает молекулу от других белков (нейтрализующие антитела, комплемент) и от активного фаго- и эндоцитоза [173]. На сегодняшний день фармацевтический рынок представлен широким спектром ПЭГилирующих агентов. В нашем эксперименте мы использовали пропиональдегидное производное ПЭГ второго поколения с молекулярной массой 10 кДа (NOF Corporation, США). Реакция ПЭГилирования по механизму аналогична реакции сиалирования: она идет с образованием основания Шиффа и последующим восстановлением его цианборгидридом натрия. Как и в случае сиалирования, использовали ацетонитрил в качестве органического растворителя. Однако первые эксперименты показали, что использование ацетонитрила приводило к значительному увеличению доли ди- и триПЭГилированных продуктов в реакционной смеси, поэтому в дальнейших опытах от использования ацетонитрила мы отказались. В качестве переменных параметров использовали рН среды и мольное соотношение ПЭГ:белок от 1:1 до 5:1 с шагом 0,5 (Рис. 28). Все эксперименты проводили при постоянной температуре 25С в течение 24 ч. Результаты эксперимента, выполненного совсместно с Есиповым Р.С, представлены в [164].
Зависимость содержания моноПЭГилированного Т34 в реакционной смеси от соотношения ПЭГ:белок при 25С при различных значениях рН: 1 - рН 4; 2 - рН 5; 3 - рН В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что при значении рН 4,0 и мольном соотношении ПЭГ:белок= 4:1 выход реакции ПЭГилирования достигал 63% от теоретически возможного.
Параллельно с определением оптимального мольного соотношения и рН среды исследовали кинетику реакции ПЭГилирования (Рис. 29). Проведенные исследования показали, что при значении рН 4,0, соотношении ПЭГ:белок = 4:1 и 18 ч инкубирования достигается максимальный выход ПЭГилированного Т34, равный 68%. Уменьшение выхода целевого продукта в процессе реакции связано с образованием побочных продуктов, а именно ди - и триПЭГилированного Т34. Так же как и в случае предыдущих аналогов Т34 моноПЭГилированный Т34 был наработан в полупрепаративных количествах для биологических исслеований. На рисунке 30, А изображен профиль полупрепаративной хроматографической очистки моноПЭГилированного Т34. Чистоту полученного конъюгата подтверждали методом электрофоретического анализа (Рис. 30, В).
Масштабирование реакции ацилирования деацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты
Химический способ модификации N-концевого серина Тр4 ангидридом уксусной кислоты не является единственным способом селективного ацетилирования пептида. Альтернативным подходом является ферментативный метод ацетилирования, в котором роль ацетилирующих ферментов играют ферменты из класса N-ацетилтрансфераз [37], использующие в качестве субстрата кофермент - ацетилкоэнзим А [178, 179]. Ввиду высокой стоимости кофермента промышленное получение Тр4 ферментативным ацетилированием in vitro является нерентабельным. Наиболее перспективным с точки зрения производства представляется ацетилирование пептида in vivo, при котором мог бы использоваться ацетилкоэнзим А самой клетки.
В работе, для того чтобы создать экспрессионную систему, обеспечивающую одновременный синтез Тр4 и N-ацетилтрансферазы, мы клонировали гены соответствующих полипептидов в полицистронную конструкцию под контролем сильного Т7 промотора. За основу был взят вектор pTWINl (NEB, Англия), содержащий последовательности интеинов DnaB и GyrA, а также хитин-связывающих доменов. Амплифицированную последовательность Тр4 клонировали по сайтам рестрикции Ndel и Sapl, при этом из плазмиды удалялась последовательность, кодирующая интеин Ssp DnaB. Полученная при этом плазмида pER - Tb4GyrA кодировала гибридный белок Tb4GyrA, способный к автокаталитическому расщеплению в присутствии тиольных реагентов [ 180]. Далее в данный вектор по сайтам рестрикции Pstl и ВатШ клонировали олигонуклеотидный дуплекс, содержащий измененную, по сравнению, с классической последовательность Шайна-Дальгарно (AGGAGAATAACTAG). Такая замена двух оснований AT на ТА в стандартной последовательности Шайна-Дальгарно (AGGAGAAATACTAG) необходима для ослабления связывания РНК с рибосомой на стадии инициации трансляции и, в конечном итоге, для ослабления экспрессии второго гена в полицистроной конструкции [181, 182]. Указанная последовательность содержала сайты рестрикции Ncol и Xhol, которые были использованы для клонирования генов сериновой или аланиновой ацетилтрансфераз (Рис. 34). TB4 GyrA СВР pERB4GyrA-AcAI
Схематическое изображение экспрессионных векторов, последовательности ДНК Тр4, интеина GyrA и аланиновой и ацетилтрансфераз. ТВ4—последовательность Тр4, GyrA—последовательность интеина, CBD—последовательность хитин-связывающего домена, RBS 1—классическая последовательность Шайна-Дальгарно (сайт связывания с рибосомой), RBS 2— модифицированная последовательность Шайна-Дальгарно (сайт связывания с рибосомой), AcSer—последовательность сериновой N-ацетилтрансферазы, AcAla— последовательность аланиновой N-ацетилтрансферазы.
Сконструированные рекомбинантные плазмиды pERb4GyrA-AcAla и pERb4GyrA-AcSer были использованы для трансформации экспрессионных штаммов Е. coli ER2566 и Е. coli СЗОЗО. Были созданы 4 штамма - продуцента на основе штамма Е. coli ER2566 и штамма Е. coli СЗОЗО (таблица 6).
Для проверки экспрессии генов штаммы-продуценты культивировали при 37С в колбах с питательной средой, индуцировали при достижении оптической плотности СЮбоо равной 1 и инкубировали 4 часа при 37С. Содержание белка в биомассе анализировали методом электрофореза в денатурирующих условиях (Рис. 35). kDa м 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12
Электрофоретический анализ клеточного лизата, осадка после центрифугирования клеточного лизата и осветлённого клеточного лизата штаммов-продуцентов Е. coli ER2566/pERb4GyrA-AcSer, Е. coli ER2566/pERb4GyrA-AcAla, Е. coli C3030/pERb4GyrA-AcSer и Е. coli C3030/pERb4GyrA-AcAla (см. материалы и методы). М—Маркёр молекулярных масс; 1,4,7,10— клеточный лизат штаммов-продуцентов Е. coli ER2566/pERb4GyrA-AcSer, Е. coli ER2566/pERb4GyrA-AcAla, Е. coli C3030/pERb4GyrA-AcSer, Е. coli C3030/pERb4GyrA-AcAla, соответственно; 2,5,8,11— осадок после центрифугирования клеточного лизата штаммов-продуцентов Е. coli ER2566/pERb4GyrA-AcSer, Е. coli ER2566/pERb4GyrA-AcAla, Е. coli СЗОЗО/pERb4GyrA-AcSer, E. coli C3030/pERb4GyrA-AcAla, соответственно; 3,6,9,12— осветлённый клеточный лизат штаммов-продуцентов Е. coli ER2566/pERb4GyrA-AcSer, Е. coli ER2566/pERb4GyrA-AcAla, Е. coli C3030/pERb4GyrA-AcSer, E. coli C3030/pERb4GyrA-AcAla, соответственно.
Электрофоретический анализ показал, что при индукции во всех штаммах-продуцентах образовывался гибридный белок Tb4GyrA в растворимой форме и параллельно с гибридным белком синтезировалась сериновая или аланиновая ацетилтрансферазы. Спонтанное расщепление гибридного белка in vivo отсутствовало. Во всех четырёх штаммах-продуцентах количество гибридного белка было практически одинаково и составило около 23%, количество ацетилтрансферазы составило 8% от общего количества белка клетки.
Проверку расщепления гибридного белка осуществляли на хитиновом сорбенте в стандартных условиях, указанных производителем плазмиды (NEB, England). За контрольные были приняты точки 4 и 8 часов после внесения тиольного реагента (Рис. 36). Рис. 36. Электрофоретический анализ кинетики расщепления гибридного белка при 25С (см. материалы и методы). Штамм-продуцент - Е. coli C3030/pERb4GyrA-AcSer. М -маркёр молекулярных масс белков, 1 - осветлённый клеточный лизат, 2 - проба с хитинового сорбента через 4 часа после уравновешивания колонны Буфером Q, 3 - проба с хитинового сорбента через 8 часов от начала расщепления после элюции Буфером N.
Расщепление происходило количественно и только в присутствии тиольного реагента. Уже через 4 часа после внесения тиольного реагента около 60% гибридного белка расщепилось, а через 8 часов - расщепился практически весь гибридный белок.
Так как реакция расщепления гибридного белка проходила стандартно, в соответствии с протоколом описанным производителем плазмиды (NEB, England), ключевой стадией стало ацетилирование целевого пептида in vivo.
Из полученных четырёх штаммов-продуцентов решено было выбрать один, в котором наиболее эффективно происходило ацетелирование целевого пептида, с этой целью был проведён ряд исследований. Все четыре штамма-продуцента инкубировали при трёх переменных параметрах: время после индукции, питательная среда и температура инкубирования. Биомассу, полученную в результате инкубирования штамма-продуцента, обработали по описанной в экспериментальной части методике; гибридный белок, выделенный из биомассы, расщепляли на хитиновом сорбенте. Элюат с хитинового сорбента после расщепления гибридного белка анализировали с помощью аналитической ОФ ВЭЖХ и методом масс-спектрометрии (Рис. 37, 38).
Разработка способов получения аналогов Тр4 в виде конъюгатов, устойчивых к деградации в токе крови
Главным преимуществом ацетилирования пептида in vivo с помощью специфической ацетилтрансферазы по сравнению с химическим ацетилированием стал не только высокий выход Тр4, равный 93%, но и отсутствие каких-либо побочных продуктов реакции [183] результаты получены совместно с Есиповым Р.С, Степаненко В.Н., Мирошниковым А.И.]. На основании полученных результатов получен патент совместно с Есиповым Р.С, Степаненко В.Н., Мирошниковым А.И. [184].
В качестве доказательства корректного ацетилирования Тр4 провели протеолитическое расщепление пептида Asp-N протеиназой из Pseudomonas fragi [175]. Полученную реакционную смесь анализировали с помощью ВЭЖХ, хроматографический профиль представлен на рисунке 44.
В результате протеолиза должно было получиться 4 пептидных фрагмента, однако известно, что Asp-N протеиназа обладает ещё и Glu-N активностью, это объясняет наличие 9 пиков [175]. Полученные пики были охарактеризованы методом времяпролётной масс-спектрометрии, результаты анализа представлены в Таблице 8, также в таблице приведена однобуквенная аминокислотная последовательность Тр4.
Анализ результатов, представленных в таблице 8, показал, что ацетилированию in vivo подвергся только N - концевой тетрапептид. Поскольку этот тетрапептид помимо аминогруппы N-концевого остатка серина содержит в положении 3 остаток лизина (Lys 3), необходимо было доказать, что не происходит присоединения ацетильной группы к боковой группе этого остатка. Для этого использовали ангиотензин конвертирующий фермент, способный гидролизовать данный тетрапептид [177]. Результаты масс-спектрометрического анализа продуктов реакции гидролиза представлены на рисунке 45. +ESI Scan (1.408-1.553 min, 10 Scans) Frag=175.0V 03 08 15 tripsinolys Tb4..
В результате хромато-масс-спектрометрического анализа продуктов реакции гидролиза тетрапептида были обнаружены 2 фрагмента, соответствующие по массам дипептидам Ac-SerAsp и LysPro. N-концевой дипептид (SerAsp) содержит единственную свободную аминогруппу, по которой могло произойти ацетилирование - альфа амиогруппу N-концевого серина. Таким образом, результаты анализа первичной структуры пептида подтвердили, что в полученном Тр4 ацетилирование произошло через альфа аминогруппу N-концевого серина Тр4.
Исследовали эффективность действия Тр4, полученного в лаборатории биотехнологии ИБХ РАН, в мышиной модели хронического дерматита совместно с Моисеевой Е.В., Бейраховой К.А., Семушиной С.Г., Ароновым Д.А. и Есиповым Р.С. [185]. Опыты проводили на девственных молодых и старых мышиных самках. Оценку эффективности заживления ран после применения Тр4 оценивали по уменьшению площади изъязвления.
После однократного применения препарата Тр4 (на день 7) наблюдалось уменьшение степени изъязвления на 56% (р=0.047; Рис. 46, а) и площади пораженного участка спины на 35% (р=0.049; Рис. 46, б) относительно соответствующих показателей в контрольной группе. После двукратного применения площадь пораженного участка спины уменьшилась на 41% (день 9, р=0.047; Рис. 46, б). Обе возрастные подгруппы реагировали на обработку Тр4 сходным образом. Однако после трехкратного применения препарата относительно молодые самки демонстрировали более выраженную реакцию, вплоть до явной тенденции к ухудшению по степени изъязвления кожи (увеличение степени изъязвления на 77% относительно контроля, день 9, р=0.16). Такой краткосрочный эффект можно объяснить обострением хронического воспалительного процесса вследствие применения Тр4 и/или отрицательным влиянием третьего применения препарата. Во время проведения монотерапии препаратом масса мышей колебалась незначительно
Относительное изменение степени изъязвления (а) и площади пораженного участка (б) кожи спины самок мышей CBRB. 1-опытная подгруппа (возраст 29 недель), 2-молодая подгруппа (возраст 15 недель), 3 - старая подгруппа (возраст 55 недель). р 0.05, р 0.01, р 0.001 относительно соответствующего контроля (Оі Кі)/КН00%.
После последнего применения препарата Тр4 всех мышей подвергли стандартной противогрибковой и противомикробной обработке и вели наблюдение в течение двух месяцев. Мыши, изначально пролеченные Тр4, при отсутствии достоверных отличий по весу, демонстрировали улучшение в целом по пролеченной группе: уменьшение степени изъязвления на 55% и 51% (дни 22 и 67, р=0,09 и р=0,002, соответственно, Рис. 46 А), уменьшение площади пораженного участка спины на 28% (день 67, р=0,0008, Рис. 46 Б). При этом, улучшение в целом по группе объяснялось более выраженным ответом у молодых самок: уменьшение степени изъязвления на 83% и 100% (дни 22 и 67, р=0,013 и р=0,0001, соответственно (Рис. 46 А) и площади пораженного участка спины на 66% (день 67, р=0,00005, Рис. 46 Б).
Сравнение изучаемых показателей на день 67 по сравнению с днем 0 (Табл. 9) по возрастным подгруппам в опытной и контрольной группах показало, что, несмотря на проведение стандартной дополнительной терапии, состояние контрольных мышей, как и ожидалось, достоверно ухудшилось: как у более молодых самок, так и в целом по группе достоверно увеличились степень изъязвления (р=0,0001 и р=0,0000, соответственно) и площадь пораженного участка кожи спины (р=0,0014 и р=0,0049, соответственно). Тогда как состояние мышей, изначально пролеченных Тр4, в целом по группе было стабильным. Исключительно важно, что у всех мышей в подгруппе более молодых самок (возраст на конец наблюдения 25,5±0,3 недели) не наблюдалось изъязвления кожи и отсутствовало увеличение площади поражения кожи спины за счет алопеции. В то время, как старые самки опытной группы (возраст на конец наблюдения 65,2+1,1 недель) демонстрировали усиление симптоматики дерматита, но в значительно меньшей степени, чем контрольные самки того же возраста (Табл. 9 и Рис. 46).
Долгосрочный противовоспалительный эффект препарата Тр4 на фоне дополнительной противомикробной и противогрибковой терапии можно объяснить: (1) системным иммуномодулирующим действием препарата в результате абсорбции через повреждённые участки кожи и/или слизистые пищеварительного тракта, и/или (2) способностью Тр4 восстанавливать повреждённые волосяные фолликулы за счёт инициации активности стволовых клеток фолликулов.
Таким образом, местная обработка кожи спины мышей рекомбинантным Тр4 не только способствовала достоверному ослаблению симптомов хронического дерматита в обеих возрастных подгруппах, но и дала, на фоне дополнительной противомикробной и противогрибковой терапии, долгосрочный (в течение двух месяцев) терапевтический эффект в оригинальной спонтанной мышиной модели дерматита человека, особенно у самок мышей более молодого возраста.