Введение к работе
Актуальность работы. В современной биотехнологии проблемы получения функционально и химически чистых биологически активных веществ и анализ их биологических функций являются чрезвычайно актуальными на всех этапах разработки биопрепаратов, а отсутствие информации о физико-химических свойствах, получаемых веществ и физиолого-биохимических особенностях микроорганизмов-продуцентов являются основным из сдерживающих факторов интенсификации микробиологического синтеза, выделения и применения биологически активных веществ. Изучение физиологии и биохимии продуцентов, как природного происхождения, так и рекомбинантных штаммов, необходимо для оптимизации питательных сред, условий культивирования и целенаправленного управления микробиологическим синтезом.
Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов биологически активных веществ для медицины требует разработки высокоэффективных технологий для очистки разрабатываемых препаратов.
Цель работы. Целью настоящей работы является выявление новых штаммов-продуцентов эндрнуклеаз рестрикции, развитие и оптимизация современных методов повышения содержания целевых белков в штаммах-продуцентах биологически активных веществ, разработка комплекса приемов и методов, позволяющих получать из прокариотических клеток препараты белков как природного происхождения, так и рекомбинантных. Задачи исследования.
1 .Выявить новые штатш-продуценты эндонуклеаз рестрикции, провести работу по повышению продуктивности клеток по целевым белкам.
2.Разработать способы выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции, получить высокоочищенные препараты новых ферментов и охарактеризовать их в отношении субстратной специфичности.
3.Изучить стабильность штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и разработать способы повышения их продуктивности.
4.Разработать технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, получаемых из растворимой фракции клеток: ФНО-бета и аналога ФНО-альфа.
5.Разработать технологию выделения и очистки белка TBI (кандидата в вакцины против HIV-I) из нерастворимой фракции клеток (телец включения).
б.Исследовать свойства рекомбинантных белков. Научная новизна работы.
Выявлен двадцать один новый штамм-продуцент эндонуклеаз рестрикции, в том числе 3 - в роде Rhizobium, мало изученном в отношении систем рестрикции-модификации.
Идентифицированы последовательности узнаваній выявленных новых рестриктаз.
-Впервые обнаружены рестриктазы с сайтами узнавания TGCGCA и
AGGCCT в роде Bacillus.
Изучено влияние состава сред при культивировании штаммов B.megateri-шп361 и B.sphaericus на выход рестриктаз и подобраны среды, повьшіающиє урожай и продуктивность клеток.
Показана возможность увеличения продуктивности штамма К.рпешпо-niae378 по рестрикгазе Крп3781 методом отбора высокопродуктивных клонов.
Предложен способ повышения продуктивности штамма Ntluteus по рес-триктазе Мій I методом предварительного культивирования на среде с эндогенной ДНК в сочетании с отбором высокопродуктивных клонов.
Предложен унифицированный метод выделения и очистки рестриктаз.
Разработан новый сорбент гепарин-силохром для очистки ферментов.
Изучена стабильность рекомбинантных штаммов-продуцентов факторов некроза опухолей и разработан оригинальный способ повышения содержания целевых белков в биомассах.
Впервые разработан подход к снижению уровня берплазмидных клеток штамма-реципиента E.coli SG200-50, накапливающихся в ходе культивирования в популяции рекомбинантного штамма, несущего ген Ыа в качестве генетического маркера.
Разработана легкомасштабируемая технология получения высокоочищен-ных и высокоактивных препаратов факторов некроза опухолей из растворимой фракции клеток. Стадии очистки ФНО-бета оптимизированы и позволяют получать высокоочшценный препарат из биомасс с различным (от 0,5% до 10% и выше) содержанием целевого белка.
Впервые разработан способ получения искусственного рекомбинантного белка TBI (содержит 6 Env эпитопов и 3 Gag эпитопа HIV-1) из нерастворимой фракции клеток (телец включения).
Практическая ценность.
Результаты настоящей работы способствовали расширению ассортимента ферментов эндонуклеаз рестрикции. Выявлен 21 новый штамм-продуцент ферментов, в том числе: B.megaterium361 (ВшеЗбІ I), K.pneumoniae378 (Kpn378 I), R.leguminosarum69 (Rle69 I), B.coagulansll6 (Всоїіб I) -(A.c. 1631080, 1659480, Патенты РФ 2001952, 2054040, соответственно), разработан способ повышения продуктивности штамма-продуцента эндонуклеазы рестрикции Mlu I (А.с. 1738853), разработан способ получения эндонуклеазы рестрикции Rtr I (А.С. 1752769). Предложена унифицированная схема выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции. Предложен и апробирован сорбент для их очистки. Опытные партии ферментов передавались ряду учреждений для проведения научно-исследовательских работ.
Разработаны способы повышения продуктивности рекомбинантных штаммов по целевым белкам, в том числе разработан способ получения биомассы рекомбинантного штамма бактерий E.coli, обогащенной полипептидом со свойствами лимфотоксина человека (положительное решение от
. о выдаче патента по заявке № 97103807/13 от 12.03.97г.). - Разработаны способы получения рекомбинантных белков из растворимой фракции клеток, в годі числе - ФНО-бета (Патент РФ 2048521). Подготовлены проекты документации на производство ФНО-бета в ГНЦ ВБ «Вектор».
- Разработан способ получения белка TBI из нерастворимой фракции клеток (телец включения) - кандидата в вакцины против HIV-I.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на: V Всес. конф. "Методы получения и анализа биохим. препаратов" (Юрмала, 1987), IV Всес. конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Всес. симп. "Ферменты рестрикции-модафикации.от генов до белков" (Тракай, 1989), Межреспубл. совещ. "Нуклеазы микроорганизмов" (Рига, 1989), Междунар.конф. "Получение, исследование, применение антибиотиков и биологически активных веществ" (Москва, 1990), Всес. конф. "Ферменты-народному хозяйству" (Черновцы, 1990), Interasymp. "Metabolism and enzymology of nucleic acids..."(Czechoslovakia, Bratislava, 1990), I Bcec. конф. "Геном человека" (Переславлъ-Залесский, 1990), Всес. конф. "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990), IX конф. "Ферменты микроорганизмов (нуклеазы)" (Казань, 1991), П отраслевая конф. молод.ученых (п.Кольцово,1990), Семинар "Препаративная масштабируемая хроматографіїя биологически активных веществ" (Ленинград, 1991), I - IV Intern.conf. "AIDS, Cancer and Human retroviruses"(St.-Petergurg, 1992, 1993, 1995, 1996), VI конф. РФ "Новые направления биотехнологии" (Москва, 1994), VII Intern. Conf. "Comparative and applied virology" (Montreal, Quebec, Canada, 1994), II Intern, congress of immunoreabilitation (Antalia, Turkey, 1996), First Joint Meeting of the"ICS and ISICR" (Geneva, Switzerland,1996) и др.
Работа выполнялась в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" в соответствии с решением ряда программ: отраслевой научно-технической программой "Ферментная база", межведомственной научно-технической программой "Вакцины нового поколения" и др.
По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа, из них 9 патентов, авторских свидетельств и положит, решений. Список приводится в конце реферата.
Структура диссертации. Диссертация содержит JJ6 страниц машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Список цитируемой литературы содержит 279 источников. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 21 таблицей.