Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Одной из важнейших ветеринарных проблем являются бактериальные болезни молодняка сельскохозяйственных животных с дизрейным и респираторным синдромом, на долю которых приходися 75% от всех заболеваний, вызываемых не облигатно-патогенными микроорганизмами, среди которых ведущая роль принадлежит сальмонеллам и пастереллам. Проблема сальмонеллезов и пастереллёэов актуальна также и для медицины, о чем свидетельствуют результаты исследований, проведенных в больницах различных стран мира (Carter G„ 1967; А. А, Конопаткин, 1983; 8. А, Прискока и др.. 1990; Ю.Е. Полоцкий и др., 1992; И. М. Гараев, 1996; C.Wray ei at., 2000). Экономический ущерб, наносимый животноводству сальмонеллезами и пастереллезами складывается из высокого отхода молодняка, снижения привесов и затрат на ' проведение оздоровительных и лечебных мероприятий (Р. В. Дущук. 1982; Biberstein Е. L, 1990; И. А. Бакулов и др., 1994; Ю. Г. Степаншин и-др., 1997; A.M. Рахманов, Н.А. Яременко, 2003).
Как показывает мировой опыт вакцинация во многих случаях является одним из основных средств борьбы с инфекционными болезнями животных.
В настоящее время в арсенале иммунопрофилактики находится целый ряд вакцинных препаратов, которые различаются по составу, технологии производства, по способу применения и эффективности. Большинство из них обладает несомненными достоинствами, но и не лишены недостатков.
Эффективность инактиаированных вакцин зависит от количества «'качества антигена, природы и свойств адъюванта, от технологии изготовления препзрата и способа его применения. Их используют при целом ряде инфекционных болезней.
Важным моментом в технологии изготовления инактивировзнных вакцин является инактивация микробных клеток. Для инактивации культуры микроорганизмов обычно используют формалин. Однако установлено, что формалин модифицирует аминокислоты, ускоряет плавление,белков, вызывает сшивки белковых субъединиц и в результате отого может снижать антигенную и иммуногенную активность бактериальных антигенов. В связи с этим необходим поиск новых инактивантов, которые бы специфически и н акти вирова ли нуклеиновую кислоту, не оказывал влияния на протективные антигены.
Одним из подходов к решению этого вопроса может быть использование
азиридиноа. Их инактивирующее действие обусловлено депуринизэцмей и
последующей деполимеризацией нуклеиновых кислот, микроорганизмов. Однако
данные ло инактивации бактерий азиридинами скудны, а порой riggQjpgfgyyfbi. ,
j :->*д 1*«у**ной лнггявту— *'
Большинство моно- и ассоциированных вакцин против пастереллёэа и сальмонеллеза свиней, используемых в нашей стране, выпускают в виде икактиаировэнных формалином сорбированных и эмульсионных препаратов. Основными недостатками сорбированных вакцин являются:
1} необходимость многократных инъекций препарата:
-
относительно большие дозы вакцин;
-
они аффективны для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота, но у свиней не создают напряженного продолжительного иммунитета.
Применяемые в настоящее время эмульсионные вакцины превосходят по иммукогенности сорбированные, однако основным препятствием их широкого использования являются:
1) высокая вязкость, затрудняющая введение при массовых обработках
животных;
2) высокая реактогенность, которая часто приводит к образованию в месте
введения стерильных абсцессов.
Поэтому постановка вопроса о создании новых инактивировакных эмульсионных вакцин, в частности, против сальмонеллеза и пастереллёэа свиней является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение.
1.2. Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка технологии производства высокой ммуногенных инактивированных противосапьмонеллезных и противолаетереллезных вакцин в виде моно- и ассоциированных препаратов, приготовленных по стондартной технологии с использованием д и мера этил єни ми на (Ы-(р-аминоэтил)этипенимин) (ДОИ) а качестве инактиванта микробных культур, .
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
разработать режим инактивации сальмонелл и пастерелл ДЭИ;
подобрать маслянный адъювант для изготовления вакцин, обладающий умеренной peaктогенкостью и оптимальной вязкостью;
разработать:
технологию производства и контроля инактивированной эмульсионной вакцины против сальмонеллеза свиней, технологию производства и контроля инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллёэа свиней, технологию производства и контроля ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллезо и * * сальмонеллеза свиней,
ї тест-системы на основе ИФА для выявления протвосапьмонеппезных it противопастереллезных антител.
1.3, Научная новизна работы. Новизна исследований состоит в том, что в
результате проведенных исследований:
впервые разработан метод инактивации сальмонелл и пастерелл ДЭИ; разработаны: технология производства вакцины против сальмонел леза свиней инактивированной эмульсионной, технология производства вакцины против пзстереллеэа свиней инактивированной эмульсионной, технология производства вакцины ассоциированной протиа пастереллеза и сапьмонеллеза свиней инактивированной эмульсионной; впервые разработаны и испытаны иммуноферментные тест-системы с использованием отечественных компонентов "и реактивов для выявления противосальмонеллеэкых и противопастереллезных антител в сыворотках крови свиней.
Научная новизна исследований подтверждена патентами на изобретение: №2162340 «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза свиней» 2001 г.; №2162339 «Способ изготовления эмульсионной лротивопастереллеэкой вакцины» 2001 г.; №2173560 «Способ изготовления вакцинного препарата против инфекционых болезней бактериальной этиологии животных и птиц» 2001 г.
1.4. Практическая значимость работы. Результаты экспериментальной
работы вошли а нормативные документы по изготовлению и контролю
инактивироаанных вакцин против сальмонеллеза и пастереллеза свиней, а также в
нормативные документы по изготовлению и контролю иммуноферментных тест-
систем для выявления антител к бактериям Salmonella enterica subsp. enterica и
Pasteurella muitocida в сыворотках крови свиней, утвержденных Департаментом
ветеринарии Минсельхоза РФ:
-
«Вакцина против сальмонеллеза свиней инактивированная эмульсионная» ТУ 9394-093-00495527-02;
-
«Вакцина против пастереллеза свиней инактивированная эмульсионная» ТУ 9384-094-00495527-02;
-
«Вакцина ассоциированная против пастереллеза и сальмонеллеза свиней инактивированная эмульсионная» ТУ 9384-065-00495527-01;
-
«Набор ИФА для выявления антител к бактериям Salmonella enterica subsp. enterica в сыворотках крови свиней» ТУ 9388-001-00495527-2002;
5.-* «Набор ИФА для выявления энтител к бактериям Pasteurella multocida в сыворотках крови свиней» ТУ 9388-002-00495527-2002.
Технология производства разработанных вакцин осуществлена в промышленном масштабе на базе ВНИИЗЖ. В течение с 1996 по 2002 г.г. было произведено: 7 серий вакцины против сальмонеллеза свиней инактивированной эмульсионной (всего 4 075 132 доз), 3 серии вакцины против пастереллеза свиней инактивированной эмульсионной (1 281 000 доз), 7 серий вакцины ассоциированной против пастереллеза И сальмонеллеза свиней инактивированной эмульсионной (1 368 000 доз). Эти вакцины с положительными результатами применяли в различных регионах РФ,
1.5. Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные болезни сельскохозяйственных животных» ВНИИЗЖ, Владимир, 1995; Конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура «Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных» ВНИИЗЖ, Владимир. 27-31 октября 1997; Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ. «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных» - Покров, 1998; Международной научно-производственной конференции «Экологические аспекты эпизоотологии и патологии животных», г. Воронеж, 19-21 мая 1999 г.; Конференции, посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ. «Производство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ», Вол ьги некий, 1999; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных», Минск, 2000; Международной научно-практической конференции 'Борьба с особо опасными, экзотическими и эооактропонозными болезнями животных", Покров, 15-16 августа 2000; Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию института «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 8-9 июня 2000; Научной конференции "Достижения молодых учёных - в ветеринарную практику*, Владимир, 2000 ; Конференции ВГНКИ «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. Москва, 2001; 5-го з'їзду паразитоценопогів Украіни «Пробл, зооінжен. вет, мед.», Харькив, 2001; Науково-практ.конф. «Сучасні ветла, технол. а спекти свинарства», Киев, 2002; Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», Щелково, 2002 г; на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1991-2002 гг.
1.6. Публикации, По материалам диссертации опубликовано 43 научные
работу в том числе 3 патента РФ на изобретения, утверждено в устоновленом
порядке 5 комплектов НД на разработанные вакцинные препараты и наборы для
и ммун ферментного анализа.
1.7. Основные положения, выносимые на защиту:
-
Способ инактивации сальмонелл и пастерелл ДЭИ,
-
Технология производства и контроля вакцины инактиаированной эмульсионной против сальмонеллеза свиней.
-
Технология производства и контроля вакцины ин акти виро ванной эмульсионной против пастереллеза свиней.
-
Технология производства и контроля вакцины ассоциированной инактивированной эмульсионной против пастереллеза и сальмонеллеза свиней.
-
Набор ИФА для выявления антител к бактериям Salmonella enterica subspecies enterica в сыворотках крови свиней.
-
Набор ИФА для выявления антител к бактериям Pasteurella multocida в сыворотках крови свиней.
1.8. Личный вклад соискателя.
Отработка режима инактивации сальмонелл и пастерелл, оценка антигенных и иммуногенных свойств разработанных вакцин и их производственные испытания выполнены совместно с сотрудниками лабораторий ВНИИЗЖ: лаборатории микробиологии, лаборатории молекулярной биологии и лаборатории малоизученных инфекций. Остальные исследования выполнены автором самостоятельно. '
1.9. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 320
страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы,
результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований,
выводы, практические предложения. Список литературы включает 467 источников, в
том числе 219 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 27 рисунками и
67 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов,
подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и
практическую значимость.