Содержание к диссертации
Введение
1 Аналитические исследования 11
1.1 Поколения растительного биоэтанола 11
1.2 Источники биомассы для производства биоэтанола 12
1.3 Состав целлюлозосодержащего сырья 15
1.4 Способы предварительной обработки биомассы
1.4.1 Предварительная обработка разбавленным раствором кислоты 19
1.4.2 Предварительная обработка разбавленным раствором щелочи 21
1.4.3 Предварительная обработка физическим и биологическим методами
1.5 Осахаривание целлюлозосодержащих субстратов 23
1.6 Метаболические пути превращения глюкозы в этанол 24
1.7 Факторы, влияющие на конверсию биомассы в этанол
1.7.1 Последовательность проведения стадий осахаривания и сбраживания .29
1.7.2 Влияние температуры 32
1.7.3 Влияние рН 32
1.7.4 Концентрация субстрата
1.8 Характеристика летучих примесей, сопутствующих биоэтанолу 34
1.9 Промышленный выпуск биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья
1.10 Обзор зарубежных и российских патентов по теме диссертации 37
1.11 Обоснование выбранного направления исследований 40
2 Методическая часть 43
2.1 Характеристики используемого в работе сырья 44
2.1.1 Плодовые оболочки овса 44
2.1.2 Мискантус
2.2 Описание продуцентов, используемых для получения биоэтанола 46
2.3 Методики проведения экспериментов
2.3.1 Способы получения субстратов из плодовых оболочек овса и мискантуса .47
2.3.2 Приготовление инокулята 48
2.3.3 Последовательное осахаривание и сбраживание (ПОС) з
2.3.4 Совмещенное осахаривание и сбраживание (СОС) 50
2.4 Реактивы, аналитическое оборудование и методики анализа сырья, промежуточных и готовых продуктов 51
3 Результаты исследований и их обсуждение 57
3.1 Определение химического состава плодовых оболочек овса и мискантуса...57
3.2 Обоснование выбора продуцента для синтеза биоэтанола
3.2.1 Сбраживание синтетических углеводных сред 57
3.2.2 Сбраживание осахаренного субстрата технической целлюлозы мискантуса .59
3.2.3 Изучение устойчивости штамма Saccharomyces сerevisiae Y-1693 к продуктам своего обмена 61
3.2.4 Исследование устойчивости штамма Saccharomyces сerevisiae ВКПМ Y-1693 к осахаренным субстратам
3.3 Последовательное осахаривание и сбраживание для технических целлюлоз из плодовых оболочек овса и мискантуса 64
3.4 Совмещенное осахаривание и сбраживание для технических целлюлоз из плодовых оболочек овса и мискантуса 69
3.5 Изучение процессов осахаривания и сбраживания для продуктов щелочной делигнификации плодовых оболочек овса и мискантуса
3.5.1 Описание продуктов щелочной делигнификации 71
3.5.2 Результаты осахаривания и сбраживания продуктов щелочной делигнификации 72
3.6 Исследование процессов осахаривания и сбраживания для продуктов
азотнокислой обработки плодовых оболочек овса и мискантуса 75
3.6.1 Характеристика продуктов азотнокислой обработки 75
3.6.2 Результаты осахаривания и сбраживания продуктов азотнокислой обработки
3.6.2.1 Микробиологический анализ культуры дрожжей 80
3.6.2.2 Влияние ингибитора на стадию осахаривания 81
3.7 Результаты лабораторных исследований технологии получения биоэтанола 85
3.8 Масштабирование по объему технологии получения биоэтанола
3.8.1 Разработка аппаратурно-технологической схемы получения биоэтанола...89
3.8.2 Масштабирование процесса получения биоэтанола из продукта щелочной делигнификации 93
3.8.2.1 Исследование процесса биосинтеза кормового белка на барде с целью создания безотходного производства 97
3.8.3 Масштабирование процесса получения биоэтанола из продукта азотнокислой обработки 98
3.9 Применение биоэтанола из плодовых оболочек овса в процессе каталитической конверсии в этилен 103
3.10 Технико-экономическая оценка разработанной технологии биоэтанола из плодовых оболочек овса в промышленном производстве 104
3.11 Связь работы с научными программами института 108
Выводы 109
Библиографический список 111
- Предварительная обработка разбавленным раствором кислоты
- Способы получения субстратов из плодовых оболочек овса и мискантуса
- Сбраживание синтетических углеводных сред
- Масштабирование процесса получения биоэтанола из продукта щелочной делигнификации
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Биоконверсия целлюлозосодержащего сырья химическими и/или
биотехнологическими методами в спектр конкурентоспособных продуктов и энергию становится современным и перспективным направлением промышленной биотехнологии. Востребованным направлением биотехнологической отрасли является разработка промышленной технологии получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья непищевого назначения, который может быть использован не только как компонент топлив, но и в технических целях. Таким образом, биоэтанол является многотоннажным продуктом, необходимым для развития в Российской Федерации высокотехнологичных производств и выведения предприятий на новый технологический и промышленный уровень.
В настоящее время в РФ действует только Кировский БиоХимЗавод, на
котором используется схема кислотного гидролиза целлюлозосодержащего сырья
для получения биоэтанола. Переход от традиционного химического способа
гидролиза целлюлозосодержащего сырья к осахариванию с помощью ферментных
препаратов обусловлен преимуществами последнего: более мягкие условия
процесса и экономия энергии. Однако осахаривание ферментными препаратами
отличается высокой специфичностью процесса. Основной проблемой получения
биоэтанола в промышленном масштабе является высокая себестоимость его
производства. Несмотря на это, производство биоэтанола из целлюлозосодержащей
биомассы в странах Европейского Союза динамично растет, что происходит
благодаря экологически продуманной экономической политике на
государственном уровне. Однако в России полностью отсутствует система
"масштабирования" научных биотехнологических разработок для целей
промышленного производства и другие элементы биоэкономики, необходимые для преобразования научных знаний в коммерческие продукты. Необходимость проведения исследований в области биоконверсии сырья обусловлена стремлением сохранения собственных природных ресурсов и развитием авторских высоких технологий.
Для внедрения промышленных технологий получения биоэтанола второго поколения необходимы источники сырья, сохраняющие продовольственную безопасность страны и характеризующиеся массовостью, доступностью, ежегодной возобновляемостью и низкой себестоимостью. Привлекательными источниками сырья являются отходы сельского хозяйства (плодовые оболочки овса) и биомасса энергетических растений (мискантус), полностью отвечающие указанным требованиям. Кроме того, необходимо осуществить выбор эффективного способа предварительной химической обработки сырья, а также промышленно доступных ферментных препаратов и продуцента, устойчивого к колебаниям состава питательных сред и контаминации посторонней микрофлорой, для получения биоэтанола с высоким выходом. Несмотря на большое количество исследований за рубежом, посвященных получению биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья и его промышленный выпуск, технологические режимы его производства не раскрываются. Актуальность данных исследований обусловлена несовершенством существующих технологий и высокой себестоимостью производства биоэтанола, в связи с чем необходима разработка энергоэффективной технологии получения
биоэтанола из нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья и масштабирование процесса в производственных условиях.
Степень разработанности
В настоящее время имеется большое количество работ, посвященных предварительной химической обработке целлюлозосодержащего сырья, разработке эффективных и промышленно доступных целлюлолитических ферментных препаратов, разработке штаммов спиртовых дрожжей, таких авторов как И.M. Абрамова, С.Д. Варфоломеев, Е.Д. Гельфанд, М.В. Гернет, Е.Н. Ефременко, А.Г. Лобанок, О.И. Ломовский, Е.В. Новожилов, Л.В. Римарева, Е.М. Серба, А.П. Синицын, Ю.И. Холькин, В.И. Шарков, В.Л. Яровенко, Balat, N. Brosse, F. Hu, D.B. Jordan, A. Ragauskas, В.C. Saha и др., в которых тем не менее, отсутствует информация о разработке и масштабировании энергоэффективной технологии получения биоэтанола из нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья, направленная на снижение себестоимости конечного продукта. Сложной проблемой является разработка фундаментальных основ технологии получения биоэтанола с масштабированием биотехнологических стадий и реализацией интегрированных процессов на опытно-промышленных установках. Современные исследования направлены на разработку биотехнологических методов конверсии целлюлозосодержащей биомассы и подбор эффективных ферментных комплексов и продуцентов для получения биоэтанола. Однако в России отсутствует готовая технология получения биоэтанола из нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья.
Цель диссертационной работы – разработка технологии получения
биоэтанола из нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья и ее
масштабирование в производственные условия.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
– обоснование выбора продуцента и изучение его устойчивости к продуктам своего обмена и осахаренным субстратам;
– исследование зависимости выхода биоэтанола от вида
целлюлозосодержащего сырья и способа его предварительной химической обработки;
– изучение зависимости выхода биоэтанола от способа проведения стадий осахаривания и сбраживания;
– разработка нормативной документации и аппаратурно-технологической
схемы для получения биоэтанола и масштабирование технологии в
производственные условия из плодовых оболочек овса, обработанных в одну стадию разбавленным раствором гидроксида натрия или азотной кислоты;
– изучение возможности использования послеспиртовой барды для получения кормовых дрожжей;
– исследование возможности применения биоэтанола для получения этилена;
– проведение технико-экономической оценки разработанной технологии в промышленном производстве.
Научная новизна: научно обоснована и разработана технология получения биоэтанола, включающая предварительную обработку сырья разбавленным раствором гидроксида натрия или азотной кислоты, совмещенные стадии осахаривания и сбраживания, выделение биоэтанола и его очистку с целью
дальнейшего применения для получения этилена, а также биосинтез кормовых дрожжей на послеспиртовой барде.
Показана целесообразность использования нетрадиционного
целлюлозосодержащего сырья на примере плодовых оболочек овса и мискантуса для получения биоэтанола. Выявлено преимущество использования плодовых оболочек овса.
Установлено преимущество совмещения технологических стадий
осахаривания и сбраживания независимо от вида сырья и способа его предварительной химической обработки.
Разработана эффективная технология получения биоэтанола с высоким выходом из плодовых оболочек овса, обработанных в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты.
В условиях опытно-промышленного производства успешно масштабирована технология получения биоэтанола на примере плодовых оболочек овса, обработанных в одну стадию разбавленным раствором гидроксида натрия или азотной кислоты. Показано, что выход биоэтанола из плодовых оболочек овса составил 16,8-17,9 дал/т.
Показано, что послеспиртовая барда, полученная после сбраживания продукта щелочной делигнификации плодовых оболочек овса, является доброкачественной для синтеза кормового белка с помощью Pichia stipitis ВКПМ Y-3263: эффективность конверсии РВ составляет 90,6 %, эффективность конверсии пентоз – 47,8 %, общая численность дрожжей – 350 млн КОЕ/мл.
Подтверждена возможность применения биоэтанола из плодовых оболочек овса в процессе каталитической конверсии в этилен и проведена оценка выхода этилена на 1 т плодовых оболочек овса.
Научная новизна технических решений подтверждена двумя патентами РФ № 2581799 и № 2593724.
Практическая значимость работы. Разработана и апробирована
технология получения биоэтанола из различных целлюлозосодержащих субстратов плодовых оболочек овса и мискантуса, заключающаяся в комбинировании предварительной химической обработки сырья и биотехнологических подходах на стадиях осахаривания и сбраживания.
По результатам исследований разработана нормативная документация, утвержденная директором ИПХЭТ СО РАН.
Разработанная технология получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья успешно масштабирована и внедрена в условиях опытно-промышленного производства ИПХЭТ СО РАН, что подтверждено актами внедрения.
Высокое качество биоэтанола, а именно: отсутствие метанола в нем – установлено двумя независимыми аналитическими лабораториями: Аналитическим испытательным центром АО «ФНПЦ «Алтай» и Институтом катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, что подтверждено актами испытаний.
Возможность применения биоэтанола из плодовых оболочек овса в процессе каталитической конверсии в этилен подтверждена актами применения и внедрения, утвержденными директором ИК им. Г.К. Борескова СО РАН.
Степень достоверности результатов работы обеспечена применением современных химических, физико-химических и микробиологических методов исследования, выполненных на оборудовании с высоким классом точности и воспроизводимостью результатов. Экспериментальные данные, выводы и
рекомендации основаны на общепринятых теоретических закономерностях, не противоречат и согласуются с известными концепциями, апробированы и подтверждены в промышленных условиях.
Основные положения, выносимые на защиту:
– зависимость выхода биоэтанола от вида сырья и способа его предварительной химической обработки;
– зависимость выхода биоэтанола от способа проведения стадий осахаривания и сбраживания;
– технология получения биоэтанола высокого качества из плодовых оболочек овса и мискантуса;
– результаты масштабирования по объему технологии получения биоэтанола в условиях опытно-промышленного производства;
– технико-экономическая оценка разработанной технологии в
промышленном производстве.
Апробация работы. Основные положения и научные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на всероссийских и международных конференциях: «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (г. Бийск, 2013-2015 гг.), «Биотехнологии в химико-лесном комплексе» (г. Архангельск, 2014 г.), «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул,
-
г., 2017 г.), «Химия и химическая технология в XXI веке» (г. Томск, 2015 г.), «Пищевые инновации и биотехнологии» (г. Кемерово , 2015 г.), Альтернативные источники сырья и топлива (г. Минск, 2015 г.), «Теория, практика и перспективы применения биологически активных соединений в сельском хозяйстве» (г. Сыктывкар, 2015 г.), «Биотехнология и общество в XXI веке» (г. Барнаул, 2015 г.), «Химия и технология растительных веществ» (г. Москва, 2015 г.), «Перспективы развития химических и биологических технологий в XXI веке» (г. Саранск,
-
г.), «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (г. Омск, 2016 г.), «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (г. Уфа, 2016 г.), «Chemical Reactors» (London, United Kingdom, 2016 г.).
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 30 научных работах, в том числе 19 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 5 статей в изданиях, входящих в базу данных Scopus и 4 статьи в изданиях, входящих в базу данных Web of Science, получено 2 патента РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Результаты научных исследований соответствуют пп. 2, 3, 4 и п. 7 паспорта специальности 03.01.06 –Биотехнология (в том числе бионанотехнологии).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка обозначений и сокращений, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и содержит 24 таблицы, 17 рисунков, 203 библиографические ссылки и 12 приложений.
Предварительная обработка разбавленным раствором кислоты
Целлюлозосодержащую биомассу в зависимости от длины волокон можно разделить на длинноволокнистое сырье, которое используется для изготовления природных текстильных волокон и коротковолокнистое сырье, пригодное в производстве бумажных изделий. Хлопок и лен являются основными источниками длинноволокнистого сырья, основными источниками коротковолокнистого сырья являются древесина и альтернативные ей сельскохозяйственные отходы [11]. Существует несколько основных видов целлюлозосодержащей биомассы: отходы сельского хозяйства (солома и шелуха злаковых культур, жом и жмых), энергетические культуры (многолетние травы, например мискантус, сорго, просо) и лесные материалы (отходы лесозаготовок). Каждый вид целлюлозосодержащего сырья имеет свои преимущества в производстве биоэтанола [12-14]. Отходы сельского хозяйства являются непродовольственным, быстровозобновляемым видом сырья, не требующим дополнительных земель для выращивания и воспроизводимым в глобальных масштабах. Использование данного вида сырья позволит свести к минимуму зависимость от лесной древесной биомассы и снизить вырубку лесов [14]. Потенциальный выход биоэтанола из сельскохозяйственных отходов составляет 20,5-25,0 дал/т биомассы [15]. Энергетические культуры характеризуются высоким выходом биомассы и высоким содержанием целлюлозы в ней. Они отличаются быстрой воспроизводимостью в короткий период времени и не требуют для выращивания использования воды, удобрений и возделываемых земель. Этот вид биомассы может составить 50-70 % от общего количества исходного сырья для биоэтанола второго поколения. Потенциальный выход биоэтанола из энергетических культур составляет 16,0-26,0 дал/т сырья [16]. Преимущество использования отходов лесозаготовок заключается в более низком содержании золы в биомассе по сравнению с растительным сырьем, а высокая плотность биомассы предполагает более экономичную транспортировку. Потенциальный выход биоэтанола из отходов лесозаготовок составляет 22,0-27,5 дал/т биомассы [17-18]. В России среди отходов сельского хозяйства основное внимание может быть уделено плодовым оболочкам овса (шелуха или лузга овса), которые являются «концентрированным» видом сырья и на зерноперерабатывающих предприятиях накапливаются в промышленных масштабах. Это морфологически однородный вид сырья, природой «откалиброванный» по размеру и толщине, не требующий измельчения при переработке, что дополнительно повышает его технологичность. По данным Росстата валовый сбор овса в России с 2009-2015 гг. составляет в среднем 4674,57 тыс. т, что соответствует 1308,9 тыс. т плодовых оболочек овса, кроме того данный вид сырья распространен в глобальном масштабе. В Алтайском крае по данным Алтайкрайстата, ежегодно накапливается до 0,31 млн. т плодовых оболочек овса. Массовая доля целлюлозы в них составляет 35-45 %, что позволяет рассматривать плодовые оболочки овса именно как источник целлюлозы. Высокое содержание гемицеллюлоз (32-35 %) давало основание рассматривать плодовые оболочки овса как гемицеллюлозное сырье и источник получения фурфурола и ксилита [19].
Плодовые оболочки овса являются побочным продуктом размола зерна, основные функции которых – сохранять чистоту зерна и защищать от механического разрушения и от болезнетворных микроорганизмов. Этот отход сельского хозяйства не находит своего применения и подвергается утилизации посредством сжигания, что приводит к образованию нагара, и выводит из строя печи. Это объясняется особенностями химического состава данного вида сырья – плодовые оболочки овса обладают высокой зольностью (от 4,5 до 5,5 %). Учитывая их доступность и низкую себестоимость, этот отход может найти применение в получении полезных продуктов. Известно о применении плодовых оболочек овса в качестве сырья для совместного сжигания с углем в кочегарном котле [20], для получения пищевых волокон [21]; в качестве сорбента ионов тяжелых металлов [22], для получения биоволокон [23], в качества сырья для получения биоэтанола [24].
Среди энергетических культур основное внимание может быть отведено культуре из семейства злаковых – мискантусу китайскому, или веернику (Miscanthus sinensis Andersson). В Институте цитологии и генетики СО РАН в 2006 г. выведена авторская форма мискантуса – сорт Сорановский, она рассматривается как альтернативное древесине легковозобновляемое сырье для производства биоэтанола. Мискантус представляет собой высокое корневищное растение, обладает высокой урожайностью, засухоустойчивостью и морозостойкостью, поэтому рассматривается как перспективный сырьевой источник целлюлозы. Урожайность сухой биомассы мискантуса в среднем составляет от 12 до 44 т/га [25-26]. Предложенная технология выращивания новой формы мискантуса в условиях Западной Сибири обеспечивает урожай сухой биомассы на уровне 10–15 т/га/год, что соответствует 4–6 т/га чистой целлюлозы [27]. В настоящее время хорошо разработаны общие принципы выращивания мискантуса в условиях Европы и США. Размножение мискантуса проводят корневищами, которые образуются в течение вегетации, а весной дают новые побеги. Таким образом происходит медленная колонизация пространства с образованием сильно разросшихся кочек. Весной проводят рассадку отдельными короткими корневищами, размещая их рядами. Наибольшая продуктивность посадок достигается спустя 3-4 года, после чего ежегодный урожай мискантуса сохраняется в течение 15 20 лет [27]. В настоящее время известны исследования по получению нанокристаллической целлюлозы из мискантуса [28], метана [29], сообщается об использовании золы мискантуса в качестве удобрений для сельскохозяйственных и лесных угодий [30].
Способы получения субстратов из плодовых оболочек овса и мискантуса
В настоящее время имеется большое количество работ, посвященных предварительной химической обработке целлюлозосодержащего сырья, разработке эффективных и промышленно доступных целлюлолитических ферментных препаратов, разработке штаммов спиртовых дрожжей, таких авторов как И.M. Абрамова, С.Д. Варфоломеев, Е.Д. Гельфанд, М.В. Гернет, Е.Н. Ефременко, А.Г. Лобанок, О.И. Ломовский, Е.В. Новожилов, Л.В. Римарева, Е.М. Серба, А.П. Синицын, Ю.И. Холькин, В.И. Шарков, В.Л. Яровенко, Balat, N. Brosse, F. Hu, D.B. Jordan, A. Ragauskas, В.C. Saha и др., в которых тем не менее, отсутствует информация о разработке и масштабировании энергоэффективной технологии получения биоэтанола из нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья, направленная на снижение себестоимости конечного продукта. Сложной проблемой является разработка фундаментальных основ технологии получения биоэтанола с масштабированием биотехнологических стадий и реализацией интегрированных процессов на опытно-промышленных установках. Современные исследования направлены на разработку биотехнологических методов конверсии целлюлозосодержащей биомассы и подбор эффективных ферментных комплексов и продуцентов для получения биоэтанола. Однако в России отсутствует готовая технология получения биоэтанола из нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья.
В связи с несовершенством существующих технологий и высокой себестоимостью производства биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья возникает необходимость разработки высокотехнологичного и энергоэффективного способа получения биоэтанола из недревесного растительного сырья. Особенности морфологии и химического состава плодовых оболочек овса, их широкая распространенность в разных странах, доступность и ежегодная возобновляемость, а также нулевая себестоимость позволяют рассматривать этот вид сырья в качестве перспективного для получения биоэтанола. Мискантус – это техническая культура, под его плантации не требуется отводить плодородные земли, что является преимуществом использования биомассы мискантуса для получения биоэтанола. Таким образом, целлюлозосодержащее сырье является самым перспективным и распространенным в мировом масштабе видом биомассы, которая может быть использована для производства биоэтанола без использования дополнительных пахотных земель и, не конкурируя с пищевым сектором экономики [32, 44].
Ключевыми факторами, определяющими, эффективность индустриализации производства биоэтанола являются химический состав целлюлозосодержащего сырья и способ его предварительной обработки. Использование разбавленных растворов азотной кислоты и гидроксида натрия для предварительной химической обработки сырья является экологически безопасным способом и исключает образование серо- и хлорсодержащих соединений. Известно [134], что разбавленные растворы азотной кислоты при температуре кипения раствора характеризуются хорошей реакционной способностью в отношении недревесного целлюлозосодержащего сырья: помимо разрыва химических связей между целлюлозой, гемицеллюлозами и лигнином происходит гидролиз гемицеллюлоз с образованием растворимых ксилозы и ее предшественников, окислительное нитрование лигнина с образованием его производных, которые легко удаляются при следующей обработке окисленного нитрованного лигнина разбавленным раствором щелочи. Возможность применения азотной кислоты для предварительной обработки целлюлозосодержащего сырья с целью получения биоэтанола не является очевидной, поскольку продукты окислительного нитрования лигнина могут выступить в роли ингибиторов на стадии ферментативного гидролиза (на комплекс целлюлолитичеких ферментов) или на стадии спиртового брожения (на энзимный комплекс дрожжей, ингибируя биокатализ по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса или последующего декарбоксилирования пирувата с образованием ацетальдегида и восстановления ацетальдегида в этанол). Отработанные растворы азотной кислоты возможно нейтрализовать аммиаком с получением комбинированных лигногуминовых удобрений.
Для реализации в производственных условиях стадии осахаривания необходимо использовать эффективные и промышленно доступные целлюлолитические ферментные препараты. В качестве продуцента биоэтанола необходимо применять доступный и неприхотливый штамм дрожжжей, устойчивый к продуктам своего обмена и гидролизным средам. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae демонстрируют высокую эффективность превращения сахара в биоэтанол и устойчивость к высокой концентрации этанола в среде [135]. Кроме того, в процессе роста на осахаренной среде сахаромицеты способны образовывать осадок, который в случае необходимой остановки технологического процесса можно легко осаждать [136]. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae признаны безопасными, так как являются непатогенными. Штаммы микроорганизмов, полученные с помощью генной инженерии подвержены спонтанным мутациям, которые приводят к снижению биосинтетической Jordan, A. Ragauskas, В.C. Saha и др., в которых тем не менее, отсутствует информация о разработке и масштабировании энергоэффективной технологии получения биоэтанола из нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья, направленная на снижение себестоимости конечного продукта. Сложной проблемой является разработка фундаментальных основ технологии получения биоэтанола с масштабированием биотехнологических стадий и реализацией интегрированных процессов на опытно-промышленных установках. Современные исследования направлены на разработку биотехнологических методов конверсии целлюлозосодержащей способности для получения биоэтанола. Таким образом, в производственных условиях целесообразно использовать штаммы, устойчивые к колебаниям состава питательных сред, контаминации посторонней микрофлорой и сохраняющие биосинтетическую активность в течение длительного культивирования.
Совмещение технологических стадий осахаривания и сбраживания в процессе получения биоэтанола имеет существенное значение для повышения выхода биэтанола, сокращения продолжительности процесса, снижения себестоимости продукции, упрощения и совершенствования технологии в целом [137].
Анализ имеющихся технических решений (п. 1.10) показал, что при наличии совокупных признаков, разрабатываемая технология обладает рядом существенных отличий, соответствует критерию «новизна» и имеет высокий технический уровень. Таким образом, разработка и масштабирование технологии получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья непищевого назначения являются актуальными.
Сбраживание синтетических углеводных сред
Двухстадийная обработка плодовых оболочек овса азотнокислым способом приводит к следующим изменениям по сравнению с нативным сырьем (таблицы 3.1 и 3.6): увеличению массовой доли целлюлозы от (44,9±0,2) % до (94,2±0,3) %, снижению массовой доли пентозанов с (30,8±0,2) % до (3,2±0,1) %, а также уменьшению массовой доли негидролизуемых компонентов (кислотонерастворимого лигнина от (17,9±0,1) % до (1,8±0,05) %, золы с (4,8±0,1) % до (1,4±0,05) %. Комбинированный способ также приводит к увеличению гидролизуемых компонентов (массовые доли целлюлозы (88,4±0,3) %, пентозанов – (11,0±0,1) %) и снижению негидролизуемых веществ (массовая доля кислотонерасвторимого лигнина (0,4±0,05) %, золы – (0,2±0,05) %). При обработке мискантуса в две стадии получены аналогичные результаты: сумма гидролизуемых компонентов при азотнокислом способе составила (94,3±0,3) %, при комбинированном способе – (95,1±0,3) %. Больший выход субстратов из единицы сырья, на стадии химической предварительной обработки достигнут для мискантуса, однако сумма гидролизуемых компонентов больше для субстратов из ПОО.
На стадии осахаривания наибольшая концентрация РВ достигнута для субстратов, полученных обработкой плодовых оболочек овса: для ТЦ ПОО (КС) концентрация составила (50,0±0,2) г/л (выход РВ от массы субстрата – (75,0±0,3) %), для ТЦ ПОО (АС) – (41,6±0,2) г/л (выход РВ от массы субстрата – (62,5±0,3) %). При осахаривании ТЦ мискантуса выход снижается: для комбинированного способа концентрация РВ равна (36,3±0,2) г/л (выход РВ от массы субстрата – (54,5±0,3) %), для азотнокислого способа (41,6±0,2) г/л (выход РВ от массы субстрата – (62,5±0,3) %).
Показано (таблица 3.7), что по выходу биоэтанола из 1 т сырья полученные субстраты можно расположить в ряд: ТЦ плодовых оболочек овса (КС) ТЦ мискантуса (КС) ТЦ плодовых оболочек овса (АС) ТЦ мискантуса (АС). Установлено, что максимальный выход биоэтанола не зависимо от вида сырья достигнут при сбраживании осахаренных субстратов, полученных комбинированным способом: выход биоэтанола для ТЦ плодовых оболочек овса – (18,6±0,1) дал/т, для ТЦ мискантуса – (14,3±0,1) дал/т. Это связано с более высоким выходом субстратов на стадии химической предварительной обработки по сравнению с азотнокислым способом, а также с высоким содержанием легкогидролизуемых гемицеллюлоз, присутствующих в большем количестве в технических целлюлозах (КС), за счет которых на стадии осахаривания обеспечивается высокая концентрация РВ.
Выявлено, что для ТЦ плодовых оболочек овса крепость опытных бражек для двух способов получения субстратов совпадает и составляет (2,4±0,05) об. %, что превышает крепость бражек для ТЦ мискантуса: (1,4±0,05) об. % для АС и (1,8±0,05) об. % для КС. Показатель ТЦ ПОО (АС) ТЦ М (АС) ТЦ ПОО (КС) ТЦ М (КС) Выход на стадии предварительной химической обработки, % 22,0±0,1 24,6±0,1 32,6±0,2 34,3±0,2 Концентрация РВ, г/л 41,6±0,2 25,4±0,1 50,0±0,2 36,3±0,2 Выход РВ, % от массы субстрата 62,5±0,3 38,2±0,1 75,0±0,3 54,5±0,3 Крепость бражки, об. % 2,4±0,05 1,4±0,05 2,4±0,05 1,8±0,05 Остаточная концентрация РВ, г/л 3,2±0,05 2,4±0,05 6,1±0,1 5,2±0,1 Выход биоэтанола %, от концентрации РВ 88,9±0,3 85,4±0,3 74,1±0,3 76,6±0,3 Выход биоэтанола, % от массы субстрата 55,8±0,3 32,5±0,2 55,8±0,3 41,8±0,2 Выход биоэтанола из 1 т сырья, дал 12,2±0,1 7,9±0,1 18,6±0,1 14,3±0,1 В гидролизной промышленности при сбраживании химических гидролизатов древесины крепости бражек составляют 1,0-1,5 об. % [160]. Более низкий выход биоэтанола при сбраживании осахаренных субстратов из мискантуса по сравнению с плодовыми оболочками овса, возможно, связан с содержанием в нем компонентов, частично ингибирующих активность зимазного комплекса дрожжей.
При микробиологическом анализе в процессе сбраживания в поле зрения были видны клетки дрожжей овальной формы и среднего размера. При сбраживании осахаренных субстратов ТЦ плодовых оболочек овса и мискантуса не зависимо от способа получения субстратов доли почкующихся клеток (от (12,9±0,1) % до (18,3±0,1) %) и доли мертвых клеток (от (1±0,05) % до (3±0,05) %) соответствовали нормам, принятым в спиртовой промышленности при использовании пищевого сырья (для зрелых производственных дрожжей доля почкующихся клеток должна составлять 10-15 %, доля мертвых клеток не более 3-4 % [161]). Общее количество клеток в процессе сбраживания снижалось не значительно: для ТЦ плодовых оболочек овса от (156,0±0,4) до (131,4±0,4) млн КОЕ/мл (для АС) и от (148,5±0,4) до (134,8±0,4) млн КОЕ/мл (для КС); для ТЦ мискантуса от (171,2±0,4) до (166,7±0,4) млн КОЕ/мл (для АС) и от (135,5±0,4) до (131,6±0,4) млн КОЕ/мл (для КС), что отвечает нормам (количество дрожжевых клеток должно быть не менее 80-100 млн. КОЕ/мл [161]). Доля упитанных клеток для двух видов сырья варьирует в диапазоне 45-60 %, что несколько ниже норм, принятым в спиртовой промышленности (не менее 70 %). По результатам микробиологического анализа морфофизиологического состояния клеток дрожжей в процессе сбраживания можно сделать вывод, что осахаренные субстраты ТЦ из плодовых оболочек овса и мискантуса являются доброкачественными средами для микробиологического синтеза биоэтанола и не подавляют биологическую активность дрожжей. Согласно [120] о качестве брожения правильнее судить по количеству несброженных редуцирующих веществ. Для ТЦ, полученных комбинированным способом, остаточная концентрация редуцирующих веществ в бражках выше, чем для ТЦ, полученных азотнокислым способом: (6,1±0,1) г/л против (3,2±0,05) г/л для плодовых оболочек овса и (5,2±0,05) г/л против (2,4±0,05) г/л для мискантуса. Это связано с химическим составом субстратов, а именно большей массовой долей пентозанов, при осахаривании которых образуются пентозы, не сбраживаемые сахаромицетами. Однако выход биоэтанола от массы субстрата для ТЦ (КС) больше, чем для ТЦ (АС).
Анализ опытных образцов биоэтанола методом ГЖХ выполнен согласно пункту 2.4, результаты представлены в таблице 3.8 (хроматограмма образца биоэтанола из ТЦ ПОО (КС) представлена на рисунке 3.3). Сравним содержание примесей в опытных образцах с нормативами на этиловый спирт-сырец из пищевого сырья и спирт этиловый технический (пункт 2.4, таблица 2.2).
Масштабирование процесса получения биоэтанола из продукта щелочной делигнификации
Полученный в 2015 г. в условиях опытно-промышленного производства образец биоэтанола из ПЩД плодовых оболочек овса объемом 2 л, крепостью (57-61±0,3) об. % был передан в Институт катализа им. Г.К. Борескова (г. Новосибирск) для исследования возможности его применения в процессах каталитической дегидратации в этилен. Работа выполнена в соответствии с соглашением о сотрудничестве между ИПХЭТ СО РАН и ИК СО РАН. Ранее сотрудниками группы комплексных технологических проектов был изучен процесс дегидратации на модельных образцах биоэтанола [2]. Переданный образец биоэтанола был подвергнут ректификации и очистке. Состав полученных образцов биоэтанола-ректификата был определен методом газовой хроматографии на приборе Хромос ГХ-1000. Результаты испытаний свойств образца биоэтанола-ректификата приведены в приложении 9. Установлено, что в опытном образце помимо этанола содержатся альдегиды, эфиры и сивушные масла. Полученные данные полностью согласуются с результатами, предоставленными Аналитическим испытательным центром АО «ФНПЦ «Алтай» согласно акту испытаний (приложение 10). Таким образом, двумя независимыми лабораториями подтверждено следующее: во всех экспериментальных образцах спиртосодержащих жидкостей массовая доля этанола составляет (57,0-92,0±0,2) об. %, массовая доля метанола не более 0,02 об. %.
Далее проводилось получение этилена из биоэтанола. Акт применения экспериментальных образцов биоэтанола-ректификата приведен в приложении 11. На основании выполненных исследований установлено, что экспериментальный образец биоэтанола-сырца из продукта щелочной делигнификации ПОО может быть использован для получения этилена после обязательных стадий очистки и ректификации.
В 2016 г. аналогично были проведены исследования возможности применения биоэтанола, полученного из продукта азотнокислой обработки ПОО в процессах каталитической дегидратации в этилен. После очистки экспериментальный образец биоэтанола из ПАО ПОО объемом 1 л, крепостью (92,0±0,3) об. % был предоставлен в ИК СО РАН. На основании проведенных исследований сотрудниками ИК СО РАН внедрена технология получения этилена дегидратацией биоэтанола в лабораторном проточном реакторе, получен акт внедрения (приложение 12). Согласно полученным в ИК СО РАН результатам, прогнозируемый выход этилена в условиях производства составит 56-83 кг на 1 т плодовых оболочек овса[191].
Технико-экономическая оценка разработанной технологии биоэтанола из плодовых оболочек овса в промышленном производстве совмещенное осахаривание и сбраживание, которое приводит к экономии капиталлозатрат По сравнению с известными способами получения биоэтанола, преимущество разработанной технологии заключается в том, что источником сырья являются плодовые оболочки овса – отход сельскохозяйственного производства, себестоимость которого равна нулю; химическая предварительная обработка сырья проводится в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты; для осахаривания используются промышленно доступные ферментные препараты, для сбраживания – негенномодифицированный штамм дрожжей Saccharomyces сerevisiae ВКПМ Y-1693, при этом проводится, так как сокращается продолжительность технологических стадий [198].
Согласно дорожной карте РФ «Развитие биотехнологий и генной инженерии» от 18 июля 2013 г. № 1247-р проведение перепрофилирования простаивающих государственных предприятий по производству этилового спирта в предприятия по производству биоэтанола для биотоплива входит в список мер по развитию биоэнергетики.
В данной работе приводится проектная производственная калькуляция себестоимости биоэтанола для ЗАО «Бийский спиртзавод». Завод оборудован в соответствии с действующими строительными нормами и правилами площади производственных помещений. На территории предприятия расположены: склады; основное производственное здание, в котором располагаются основные производственные цеха, цех розлива, цех ректификации; углекислотная, механический цех, здания заводоуправления; мастерские; скважины водозабора; котельная. Все здания связаны между собой асфальтными дорожками. Большая часть территории также заасфальтирована. Ширина проезжей части 10 м. На территории завода имеется очистное сооружение, сборники для водоотведения. Территория предприятия ограждена забором и имеет двое выездных ворот. Расположение технологических цехов обеспечивает поточность технологического процесса. Имеются пути для подъезда авто- и железнодорожного транспорта. Завод вырабатывал этанол из зернового сырья, в настоящее время не функционирует. Технико-экономическая оценка разработанной технологии биоэтанола из плодовых оболочек овса произведена на основании результатов, полученных на опытно-промышленном производстве ИПХЭТ СО РАН: выход биоэтанола из плодовых оболочек овса, предварительно обработанных в одну стадию раствором азотной кислоты, составил – 17,9±0,1 дал/т. Технико-экономическая оценка получения биоэтанола из продукта щелочной делигнификации (одностадийная обработка разбавленным раствором гидроксида натрия) опубликована в работе [199].