Содержание к диссертации
Введение
1 Аналитические исследования 12
1.1 Характеристика бактериальной целлюлозы 12
1.2 Продуценты бактериальной целлюлозы 14
1.3 Механизм биосинтеза бактериальной целлюлозы 15
1.4 Состав питательных сред 18
1.4.1 Синтетические среды 18
1.4.2 Питательные среды из отходов пищевых производств 22
1.4.3 Альтернативные питательные среды из целлюлозосодержащего сырья 25
1.4.4 Пути трансформации целлюлозосодержащего сырья в раствор сахаров 29
1.5 Влияние условий культивирования на биосинтез бактериальной целлюлозы 32
1.5.1 Концентрация источника углерода в питательной среде 32
1.5.2 Аэродинамические условия 33
1.5.3 Температура 35
1.5.4 Уровень активной кислотности 35
1.6 Применение бактериальной целлюлозы 37
1.6.1 Фармацевтическое и медицинское применение 37
1.6.2 Применение в целлюлозно-бумажной промышленности 40
1.6.3 Применение в химической промышленности 41
1.7 Обзор российских патентов по теме диссертации 42
1.8 Обоснование выбранного направления исследований 45
2 Методическая часть 48
2.1 Объекты исследования 49
2.1.1 Плодовые оболочки овса 49
2.1.2 Симбиотическая культура Мedusomyces gisevii Sa-12 49
2.2. Методики проведения экспериментов 49
2.2.1 Способ получения субстратов из плодовых оболочек овса 49
2.2.2 Получение ферментативного гидролизата 51
2.2.3 Приготовление инокулята 52
2.2.4 Получение бактериальной целлюлозы 52
2.2.5 Отмывка гель-пленок бактериальной целлюлозы 52
2.2.6 Высушивание бактериальной целлюлозы 52
2.2.7 Расчет выхода бактериальной целлюлозы 53
2.3 Реактивы, аналитическое оборудование и методики анализа 53
3 Результаты исследований и их обсуждение 60
3.1 Исследование влияния условий культивирования Мedusomyces gisevii Sa-12 на биосинтез бактериальной целлюлозы 60
3.1.1 Изучение влияния pH на биосинтез бактериальной целлюлозы 60
3.1.2 Исследование влияния начальной концентрации редуцирующих веществ на биосинтез бактериальной целлюлозы 62
3.1.3 Изучение влияния температуры на биосинтез бактериальной целлюлозы 66
3.1.4 Исследование влияния концентрации этанола на биосинтез бактериальной целлюлозы 69
3.1.5 Изучение влияния концентрации дрожжевого экстракта на биосинтез бактериальной целлюлозы 70
3.1.6 Исследование влияния экстрактивных веществ черного чая на биосинтез бактериальной целлюлозы 72
3.1.7 Изучение влияния соотношения объмов культуральной среды и воздуха на биосинтез бактериальной целлюлозы 74
3.1.8 Оптимальные условия биосинтеза бактериальной целлюлозы продуцентом Medusomyces gisevii Sa-12 75
3.2 Биосинтез бактериальной целлюлозы в реакторе объемом 16 литров 77
3.3 Исследование физико-химических и фундаментальных свойств
БЦ, синтезированной на синтетической питательной среде 78
3.3.1 Исследование физико-химических свойств бактериальной целлюлозы, синтезированной на синтетической питательной среде 78
3.3.2 Исследование влияние температуры на степень полимеризации и структуру бактериальной целлюлозы 83
3.3.3 Исследование способности бактериальной целлюлозы к ферментативному гидролизу 85
3.3.4 Исследование способности бактериальной целлюлозы к химической трансформации 87
3.4 Изучение биосинтеза бактериальной целлюлозы на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса 89
3.4.1 Определение химического состава субстратов 89
3.4.2 Определение состава ферментативных гидролизатов 91
3.4.3 Исследование процесса биосинтеза бактериальной целлюлозы на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса 92
3.4.4 Исследование физико-химических свойств образцов бактериальной целлюлозы, полученных на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса 100
3.4.5 Разработка технологии получения бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса 107
3.5 Применение бактериальной целлюлозы в ветеринарии и гуманной медицине 108
3.5.1 Изучение гемостатической активности бактериальной целлюлозы 108
3.5.2 Исследование возможности применения бактериальной целлюлозы в абдоминальной хирургии 110
3.6 Экономическое обоснование проведения опытно-конструкторских 111
3.7 Связь работы с научными программами института 114
Список обозначений и сокращений 115
4 Заключение 116
4.1 Выводы 116
4.2 Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы 118
4.3 Практические предложения 118
5 Библиографический список 120
6 Приложения 146
6.1 Методика 146
6.2 Методика 147
6.3 Методика 148
6.4 Методика 149
6.5 Технологическая пропись 150
6.6 Акт испытания 151
6.7 Акт испытания 152
6.8 Акт внедрения 153
6.9 Патент на изобретение 154
6.10 Патент на изобретение 156
- Синтетические среды
- Исследование влияния начальной концентрации редуцирующих веществ на биосинтез бактериальной целлюлозы
- Исследование процесса биосинтеза бактериальной целлюлозы на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса
- Исследование физико-химических свойств образцов бактериальной целлюлозы, полученных на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Направление исследований получения, свойств и применения бактериальной целлюлозы развивается в мировой науке с 1954 г. Бактериальная целлюлоза является востребованным материалом в различных отраслях промышленности, таких как пищевая, биотехнологическая, химическая, целлюлозно-бумажная, электронная, а также в ветеринарии и гуманной медицине.
Биосинтез бактериальной целлюлозы – сложный и дорогостоящий процесс. Это связано с ограниченным выходом бактериальной целлюлозы и использованием дорогостоящих питательных сред из пищевого сырья, которые увеличивают стоимость конечного продукта.
В Российской Федерации нет действующего производства бактериальной целлюлозы, поэтому разработка технологии ее биосинтеза является актуальной. Замена пищевого сырья на непищевое, массовое, возобновляемое в промышленных масштабах сырьё, позволит значительно снизить себестоимость бактериальной целлюлозы. В мировой науке предложены различные варианты решения данной проблемы. Новым направлением в данной области является получение питательных сред из недревесного возобновляемого целлюлозосодержащего сырья. Однако исследования носят поисковый характер, нет готовых методов и технологий по биосинтезу бактериальной целлюлозы, направленных на снижение себестоимости конечного продукта за счет удешевления питательной среды.
Для Российской Федерации перспективным источником недревесного возобновляемого целлюлозосодержащего сырья являются плодовые оболочки овса. Для создания технологии нужно проводить исследования процесса биосинтеза бактериальной целлюлозы на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса. Уникальность данных исследований обусловлена не только использованием сырья, экономически выгодного именно для России, но и направленностью на разработку технологии получения бактериальной целлюлозы, которая в будущем может быть масштабирована и внедрена в производство.
Степень разработанности темы. Опубликованные литературные данные подтверждают целесообразность исследований биосинтеза, свойств и применения бактериальной целлюлозы. В этой области успешно работают в России и за рубежом Громовых Т.И., Ревин В.В., Ткаченко А.А., Хрипунов А.К., Son H.J., Cavka A., Guo X., Yang X.X. и другие исследователи (1954-2017). В мировой практике такого рода исследования носят поисковый характер, нет готовых методов и технологий по превращению растительного сырья в бактериальную целлюлозу, необходимо проведение исследований по разработке технологии ее получения для создания высокотехнологичного крупномасштабного производства. Общие подходы к биотехнологическим производствам в России разрабатывались такими учёными, как
Варламов В.П., Варфаломеев С.Д., Гернет М.В., Градова Н.Б., Егоров Н.С., Еремец В.И., Красноштанова А.А., Нетрусов А.И., Панфилов В.И., Самуйленко А.Я.
Цель диссертационной работы – разработка технологии получения бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса.
Для реализации поставленной цели сформулированы следующие задачи:
– научное обоснование выбора продуцента и исследование влияния условий культивирования (pH, концентрация глюкозы в питательной среде, температура, соотношение объемом культуральной среды и воздуха, влияние стимулирующих добавок) на выход бактериальной целлюлозы;
– исследование физико-химических и фундаментальных свойств бактериальной целлюлозы, синтезированной на синтетической питательной среде выбранным продуцентом;
– исследование процесса биосинтеза бактериальной целлюлозы в зависимости от способа предварительной химической обработки плодовых оболочек овса;
– исследование физико-химических свойств бактериальной целлюлозы, синтезированной на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса;
– разработка технологии получения бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса;
– исследование перспективы применения бактериальной целлюлозы в ветеринарии и гуманной медицине.
Научная новизна
Научно обоснована и экспериментально разработана технология получения бактериальной целлюлозы на ферментативном гидролизате технической целлюлозы плодовых оболочек овса, полученной азотнокислым способом, с помощью продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12.
Экспериментальным путем определены условия биосинтеза бактериальной
целлюлозы продуцентом Мedusomyces gisevii Sa-12, обеспечивающие ее
максимальный выход: концентрация редуцирующих веществ от 20 до 25 г/л; pH регулируется симбиозом; температура от 24 С до 27 C; содержание экстрактивных веществ черного чая в питательной среде от 1,6 до 4,8 г/л; продолжительность культивирования от 7 до 12 суток.
Экспериментально подтверждена возможность использования ферментативных гидролизатов плодовых оболочек овса в качестве питательных сред для микробиологического синтеза бактериальной целлюлозы; при этом выход колеблется от 2,5 % до 9 % в зависимости от химического способа получения субстрата для ферментативного гидролиза.
Научно обосновано и экспериментально доказано использование
симбиотической культуры Мedusomyces gisevii Sa-12 для биосинтеза бактериальной целлюлозы на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса. Степень кристалличности образцов бактериальной целлюлозы, синтезированных продуцентом
Мedusomyces gisevii Sa-12 составляет от 87 % до 90 %. Образцы бактериальной целлюлозы имели сетчатую структуру со средней толщиной микрофибрилл от 28 до 33 нм. В образцах бактериальной целлюлозы преобладала низкосимметричная фаза I, ее содержание изменялось от 93,7 % до 100 %.
Доказана принципиальная возможность получения нитратов бактериальной целлюлозы.
Подтверждена перспективность использования бактериальной целлюлозы в качестве гемостатического средства в ветеринарии и гуманной медицине.
Новизна технических решений подтверждена патентами РФ № 2597291 и № 2624242.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана технология
получения бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса, включающая
предварительную химическую обработку последовательно разбавленными
растворами азотной кислоты и гидроксида натрия с получением технической
целлюлозы; ферментативный гидролиз технической целлюлозы с помощью
ферментных препаратов «Целлолюкс-А» и «Брюзайм BGX»; приготовление
питательных сред для биосинтеза бактериальной целлюлозы; биосинтез
бактериальной целлюлозы с помощью симбиотической культуры Мedusomyces gisevii Sa-12; промывку бактериальной целлюлозы с помощью разбавленных растворов гидроксида натрия и соляной кислоты; стерилизацию и упаковывание бактериальной целлюлозы.
Подтверждены высокая степень кристалличности бактериальной целлюлозы и преобладание низкосимметричной фазы І в образцах бактериальной целлюлозы (Акт испытаний выдан ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет», г. Петрозаводск).
Подтверждена возможность применения полученных образцов бактериальной целлюлозы в медицине в качестве гемостатического средства (Акт внедрения выдан ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава РФ, г. Москва).
Подтверждена возможность применения полученных образцов бактериальной целлюлозы в абдоминальной хирургии (Акт испытаний выдан ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России и КГБУЗ «Краевая клиническая больница», г. Барнаул).
По результатам исследований разработана технологическая документация, утвержденная директором ИПХЭТ СО РАН.
Методология и методы исследования Объектами исследований являлись:
– плодовые оболочки овса;
– продуцент Мedusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 (симбиотическая культура, состоящая из 15-30 родов дрожжей, в том числе Zygosaccharomeces sp., Saccharomyces
sp., Schizosaccharomyces pombe и др., 8-10 родов уксуснокислых бактерий, в том числе Acetobacter sp., Gluconobacter oxydans, Bacterium kutzingianum).
Методики экспериментов:
Предварительную химическую обработку сырья проводили четырьмя различными способами: одностадийная обработка плодовых оболочек овса (ПОО) раствором 4 %-ной азотной кислоты позволила получить лигноцеллюлозный материал (ЛЦМ); одностадийная обработка раствором 4 %-ного гидроксида натрия – волокнистый продукт (ВП). Дальнейшая обработка ЛЦМ раствором 4 %-ного гидроксида натрия позволила получить техническую целлюлозу (азотнокислый способ) (ТЦ (АС)); дальнейшая обработка ВП раствором 4 %-ной азотной кислоты – техническую целлюлозу (комбинированный способ) (ТЦ(КС)).
Ферментативный гидролиз полученных субстратов проводили в ферментере объёмом 11 л в водной среде при (47±2) С в течение 72 ч с помощью ферментных препаратов Целлолюкс-А (0,04 г/г субстрата) и Брюзайм BGX (0,1 мл/г субстрата), активную кислотность поддерживали на уровне (4,7±0,2) с помощью гидроксида аммония и ортофосфорной кислоты, начальная концентрация субстрата составила 30 г/л.
Поддержание жизнеспособности продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12 осуществляли методом субкультивирования. Для этого использовали стандартную питательную среду, приготовленную растворением глюкозы в экстракте черного чая.
Исследования проводили на питательных средах, приготовленных на основе ферментативных гидролизатов. В отфильтрованный ферментативный гидролизат вносили охлажденный настой чая, при этом питательную среду стандартизовали по содержанию редуцирующих веществ (РВ). Далее вносили симбиотическую культуру Мedusomyces gisevii Sa-12 – 10 % инокулята от объема питательной среды. Культивирование проводили в термостате при постоянной температуре в статических условиях.
Удаление с поверхности бактериальной целлюлозы (БЦ) остатков питательной среды и клеток осуществляли поэтапной обработкой раствором 2 %-ного гидроксида натрия и раствором разбавленной соляной кислоты (pH 3) с последующей промывкой дистиллированной водой.
Состав и характеристики исследуемых субстратов, ферментативных
гидролизатов и БЦ определяли по общепринятым методикам: массовая доля целлюлозы по Кюршнеру по Оболенской и др., 1991; массовая доля -целлюлозы по ГОСТ 6840-78; массовая доля кислотонерастворимого лигнина по Оболенской и др. (1991); массовая доля пентозанов по ГОСТ 10820-75; массовая доля золы по ГОСТ 18461-93. Степень полимеризации целлюлозы определяли по ГОСТ 25438-82.
Ферментативный гидролиз БЦ проводили в условиях, описанных ранее.
Нитрование БЦ проводили нитрующей смесью состава: 56-59 % HNO3 и 41-44 % HSO4, при 30 С в течение 40 мин, с последующей стабилизацией (Пат.
2556940). Определение массовой доли азота в нитрате БЦ проводили ферросульфатным методом. Определение вязкости нитрата БЦ – по ГОСТ В 5769-75. Определение растворимости нитрата БЦ – по ГОСТ В 5766-75.
Технологическое оборудование
Концентрацию РВ в пересчете на глюкозу и концентрацию ксилозы определяли на спектрофотометре Unico UV-2804. Уровень активной кислотности контролировали с помощью иономера И-160 МИ. Определение моносахаридного состава ферментативных гидролизатов проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02. ИК-спектроскопию образцов БЦ проводили на спектрофотометре Инфралюм ФТ-801 в таблетках KBr, исследование образцов БЦ методом ЯМР – на спектрометре Bruker «Аvance 400» с высокотемпературными датчиками высокого разрешения твердого тела (до 300 C), исследование образцов БЦ методом рентгеноструктурного анализа – на дифрактометре ДРОН-6, исследование образцов БЦ методом растровой электронной микроскопии – на микроскопах JSM-840 и Zeiss SIGMA VP.
Общее количество дрожжей и уксуснокислых клеток определяли методом прямого подсчета клеток в счетных камерах с использованием оптического микроскопа Optika B-150.
Методы доклинических исследований. Исследование перспективы
применения бактериальной целлюлозы в ветеринарии и гуманной медицине проводили согласно методике, утвержденной Фармкомитетом МЗ РФ для доклинической оценки потенциальных лекарственных средств (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. – М.: Гриф и К, 2013. – 994 с.)
Структурно-методологическая схема исследований для достижения цели диссертационной работы представлена на рисунке 1.
Основные положения, выносимые на защиту:
– технология получения бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса;
– результаты исследования зависимости выхода бактериальной целлюлозы, синтезируемой продуцентом Мedusomyces gisevii Sa-12 от условий культивирования: pH, концентрации редуцирующих веществ, температуры, соотношения объемов культуральной среды и воздуха, наличия стимулирующих добавок;
– результаты исследования зависимости выхода бактериальной целлюлозы, синтезируемой продуцентом Мedusomyces gisevii Sa-12, от способа предварительной химической обработки плодовых оболочек овса;
– эффективность применения продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12 для биосинтеза высококачественной бактериальной целлюлозы.
Анализ существующих способов получения БЦ из целлюлозосодержащего сырья
т
Разработка алгоритма технологии БЦ из целлюлозосодержащего сырья
Обоснование выбора объектов исследования
Плодовые оболочки овса
Симбиотическая культура Мedusomyces gisevii Sa-12
Предварительная химическая обработка
Ферментативный гидролиз
Исследование влияния
условий культивирования
на биосинтез БЦ
Исследование физико-химических и фундаментальных свойств БЦ
Исследование биосинтеза БЦ на ферментативных гидролизатах из плодовых оболочек овса
т
Исследование
физико-химических
свойств БЦ
Акт испытания
Разработка технологии получения БЦ из плодовых оболочек овса
Патент
Исследование перспективы
применения БЦ в ветеринарии
и гуманной медицине
Патент
Акт испытания
Акт внедрения
Рисунок 1 – Структурно-методологическая схема исследований
Степень достоверности и апробация результатов. Обработку полученных данных проводили с использованием программы «Microsoft Excel 2010» и «Microsoft Word 2010». Экспериментальные данные были получены в трехкратной повторности, результаты в виде среднего значения, а погрешности – в виде стандартного отклонения по выборке.
Достоверность результатов исследований подтверждается соответствием
теоретических данных с полученными результатами экспериментальных
исследований и производственных испытаний. Экспериментальные данные, выводы и рекомендации основаны на общепринятых теоретических закономерностях, не противоречат и с достаточной степенью точности согласуются с известными концепциями.
Основные положения и научные результаты диссертационной работы
доложены и обсуждены на всероссийских и международных конференциях:
«Биотехнологии в химико-лесном комплексе» (г. Архангельск, 2014 г.), «Новые
достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул,
2014, 2017 гг.), «Низко-температурные и пищевые технологии в XXI веке» (г. Санкт-
Петербург, 2015 г.), «Химия и химическая технология в XXI веке» (г. Томск, 2015 г.),
«Перспективы развития химических и биологических технологий в XXI веке» (г.
Саранск, 2015 г.), «Биотехнология и общество в XXI веке» (г. Барнаул, 2015 г.),
«Химия и технология новых веществ и материалов» (г. Сыктывкар, 2015-2016 гг.),
«Структура и физико-химические свойства целлюлоз и нанокомпозитов на их основе»
(г. Петрозаводск, 2016 г.), «Технологии и оборудование химической,
биотехнологической и пищевой промышленности» (г. Бийск, 2014-2017 гг.), «Материалы и технологии XX века» (г. Бийск, 2015 г.), «Перспективы создания и применения конденсированных высокоэнергетических материалов» (г. Бийск, 2014, 2016 гг.).
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 26 научных работах, в том числе 13 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, имеются 2 патента РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Результаты научных исследований соответствуют пп. 2, 3, 4 и п. 7 паспорта специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе биотехнологии).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы, включающего 209 источника и приложения. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста и содержит 44 рисунка, 28 таблиц.
Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы и разработке основных положений, выносимых на защиту, постановке целей и задач исследований, решении поставленных задач, планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении результатов. Результаты диссертационной работы являются совокупностью научных исследований, проведенных в ИПХЭТ СО РАН лично автором и при его непосредственном участии в качестве ответственного исполнителя.
Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю, к.т.н., доценту, Е.А. Скибе за практическую и консультативную помощь при выполнении данной работы; к.х.н., доценту, В.В. Будаевой, коллективу Лаборатории биоконверсии ИПХЭТ СО РАН; а также сотрудникам САФУ: д.т.н., профессору, Новожилову Е.В. и к.т.н., доценту, Болотовой К.С. – за исследование БЦ методом растровой электронной микроскопии; сотруднику ИК им. Г.К. Борескова СО РАН, д.х.н., Степанову А.Г. за исследование БЦ методом ядерного магнитного резонанса; сотруднику ПетрГУ к.ф.-м.н., доценту, Алешиной Л.А. за исследование БЦ методом рентгеноструктурного анализа; сотруднику ФГБУ ГНЦ Минздрава РФ, д.м.н.,
Белозерской Г.Г. за исследование гемостатической активности БЦ; сотрудникам ФГБОУ ВО АГМУ: д.м.н., профессору, В.Г. Лубянскому и д.м.н., доценту, А.Н. Жарикову – за исследование применения БЦ в абдоминальной хирургии.
Синтетические среды
Стандартной питательной средой для биосинтеза БЦ считается среда Хестрина-Шрэмма, состоящая, из (%): глюкозы – 2,0; пептона – 0,5; дрожжевого экстракта – 0,5; динатрия фосфата (безводный) – 0,27; лимонной кислоты (моногидрат) – 0,115; рН доводят до 6,0 с помощью разбавленных растворов соляной кислоты или гидроксида натрия [24].
В работе [25] исследовано влияние различных источников углерода (глюкоза, фруктоза, сахароза и этанол) и азота (дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и сульфата аммония) на биосинтез БЦ продуцентом Acetobacter lovaniensis HBB5. Наибольший выход БЦ получен при использовании в качестве источника углерода – глюкозы, в качестве источника азота – дрожжевого экстракта. В питательной среде, состоящей из 2 % глюкозы и 0,5 % дрожжевого экстракта, выход сухой БЦ составил 0,040 г/л через 7 дней культивирования.
Для штамма Gluconacetobacter sp. RV28 наиболее предпочтительным источником углерода является сахароза. Выход БЦ, полученный на питательной среде, содержащей сахарозу, составил 2,3 г/л. Исследования показали, что источник углерода влияет на выход БЦ, но не оказывает влияние на ее молекулярную структуру [3].
В работе [26] для штамма Gluconacetobacter xylinus АТСС 53524 кроме сахарозы предпочтительным источником является глицерин. Выход БЦ, на питательных средах, содержащих сахарозу и глицерин составил 3,83 и 3,75 г/л соответственно. Исследования методом ЯМР показало, что независимо от источника углерода, БЦ имела высокую степень кристалличности.
Изучение биосинтеза БЦ продуцентом Gluconacetobacter xylinus ATCC 10245 показало, что наибольший выход (28,7 %) получен при культивировании на питательной среде, содержащей глицерин. С помощью рентгенографических исследований установлено, что образцы БЦ, синтезированные на питательных средах, содержащих в качестве источника углерода глюкозу и фруктозу, имеют степень кристалличности – 88 и 86 %. Степень кристалличности образца БЦ полученного при культивировании на питательной среде, содержащей глицерин составила 78 % [27].
В работе [28] исследован биосинтез БЦ продуцентом Acetobacter xylinum 1FO 13693 на питательных средах, содержащих различные источники углерода. Установлено, что глюкоза, фруктоза и глицерин – предпочтительные источники углерода для биосинтеза БЦ. Однако в работе [29] для продуцента Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 показано, что выход БЦ на питательной среде, содержащей глицерин, меньше, чем на питательной среде, где в качестве источника углерода использовалась сахароза.
Для продуцента Мedusomyces gisevii исследован биосинтез БЦ на питательных средах, содержащих различные источники углерода: фркутозу, сахарозу, глюкозу и мальтозу. Показано, что наиболее предпочтительным источником углерода является глюкоза [30].
В работе [31] исследован процесс биосинтеза БЦ продуцентом Gluconacetobacter xylinus ATCC 53524 на различных питательных средах, содержащих разные источники углерода, модифицированных добавлением кукурузного экстракта. Полученные образцы БЦ, исследованные методом рентгеноструктурного анализа, имели близкие размеры кристаллитов и состояли преимущественно из фазы I . Однако, степень кристалличности образцов БЦ при использовании различных питательных сред значительно отличалась: от 50 до 95 %.
Условия культивирования для биосинтеза БЦ продуцентом Acetobacter xylinum BPR2001 оптимизированы с помощью статистической обработки [32]. Согласно полученным данным, выход БЦ на уровне 14 г/л может быть достигнут через 72 часа ферментации при использовании питательной среды, содержащей 4,99 % фруктозы, 2,85 % кукурузного экстракта, 28,33 % растворенного кислорода и 0,38 % агара.
Исследована зависимость выхода БЦ от содержания в питательной среде пептона и дрожжевого экстракта. Установлено, что концентрация дрожжевого экстракта, обеспечивающего наибольший выход БЦ, составляет 7 г/л, пептона – 9 г/л. При этом выход БЦ составляет 11,65 г/л [33].
Дрожжевой экстракт в питательных средах является источником азота и аминокислот. Однако, использование дрожжевого экстракта повышает стоимость питательной среды. В работе [3] предложено использовать гидролизат рыбного порошка в качестве источника азота и аминокислот. Опыты показали, что 15 г/л гидролизата рыбного порошока в питательной среде увеличивает объемный выход до 3,0 г/л.
Изучение процесса биосинтеза БЦ продуцентом Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans на синтетических питательных средах с добавлением различных стимулирующих компонентов показало, что присутствие в питательной среде лактата в динамических условиях культивирования позволяет повысить выход БЦ приблизительно в 4-5 раз [34].
Есть данные, что на биосинтез БЦ положительную роль играет добавление в питательную среду этанола [4, 9, 35, 36]. Этанол подавляет спонтанные мутации целлюлозосинтезирующих бактерий, снижающие их продуктивность. Такие мутации могут появляться при динамических условиях культивирования. Кроме того, этанол может использоваться как дополнительный источник углерода. Так, для Gluconacetobacter hansenii выход БЦ увеличивается от 1,30 до 2,31 г/л при добавлении 1 % этанола [35]. Для Acetobacter sp. A 9 добавление 1,4 % этанола в питательную среду увеличивает выход БЦ на 400 % (до 15,2 г/л), что примерно в 4 раза больше чем на питательной среде, не содержащей этанол [36]. По другим данным, добавление 1 % этанола к стандартной питательной среде увеличивает выход БЦ в 2-10 раз [9]. Для продуцента Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 выход БЦ вырос в два раза при добавлении 0,5 % этанола [4]. Однако исследования методом растровой электронной микроскопии показали, что добавление этанола изменяет сетчатую структуру БЦ на более плоскую структуру с тонкими микрофибриллами [37].
Установлено, что на выход БЦ влияет присутствие в питательной среде гептагидрата сульфата магния. Установлен оптимальный состав питательной среды для биосинтеза БЦ: 1,5 % глюкозы; 0,2 % сульфата аммония; 0,3 % дигидрофосфата калия; 0,3 % гидрофосфата натрия; 0,08 % гептагидрата сульфата магния; 0,0005 % сульфата железа (); 0,0003 % борной кислоты; 0,00005 % никотинамида; 0,6 % этанола. Максимальный выход БЦ – 4,16 г/л получен через 8 дней культивирования при перемешивании 200 об/мин [38].
Продуцент Мedusomyces gisevii очень чувствителен к содержанию экстрактивных веществ чая в питательной среде. Экстрактивные вещества, такие как кофеин, теофилин, теобромин являются активаторами роста БЦ. Следует отметить, что эти компоненты не потребляются микроорганизмами, однако их отсутствие очень критично. Наибольший выход БЦ получен при содержании экстрактивных веществ чая в питательной среде от 0,5 до 1,5 % [30].
Проведен биосинтез БЦ продуцентом Acetobacter xylinum NUST4.1 на стандартных питательных средах с добавлением альгината натрия и без него. Установлено, что при добавлении в питательную среду альгината натрия масса БЦ достигает 6 г/л. Рентгенографические исследования показали снижение степени кристалличности у образца БЦ, синтезированного на питательной среде с добавлением альгината натрия [39].
Исследование влияния начальной концентрации редуцирующих веществ на биосинтез бактериальной целлюлозы
Исследовано влияние различных начальных концентраций РВ в питательной среде на выход БЦ: 5, 10, 15, 20, 25, 35, 45, 55 г/л. Культивирование проводили в статических условиях при (30±2) С в течение 21 суток.
На рисунке 3.3 и 3.4 показано изменение количества клеток дрожжей и уксуснокислых бактерий в зависимости от начальной концентрации глюкозы в питательной среде.
Численность дрожжевых клеток в течение всего процесса культивирования изменялась прямо пропорционально концентрации субстрата в среде: при концентрации глюкозы в питательной среде от 5 до 45 г/л увеличение количества дрожжевых клеток происходило до 8 суток культивирования, далее происходило их снижение; при концентрации 55 г/л увеличение численности дрожжевых клеток происходило до 10 суток, а потом также происходил спад.
Зависимость численности уксуснокислых бактерий от концентрации глюкозы в питательной среде не однозначна. Максимальная численность наблюдалась при концентрации глюкозы в среде 20 г/л, затем, по мере повышения концентрации глюкозы до 55 г/л, численность уксуснокислых бактерий снижалась. Концентрация глюкозы 15 г/л и ниже являлась недостаточной, вследствие чего численность бактерий снижалась прямо пропорционально снижению концентрации глюкозы.
На рисунке 3.5 представлены изменения концентрации РВ в процессе культивирования Medusomyces gisevii Sa-12 на средах с различной начальной концентрацией глюкозы, на рисунке 3.6 – изменение уровня активной кислотности.
Полная утилизация субстрата при концентрациях глюкозы 5, 10 и 15 г/л происходила на 6 сутки культивирования, при концентрациях 20 и 25 г/л – на 10 сутки, при концентрации 35 г/л – на 17 сутки. При концентрациях 45 и 55 г/л не происходило полной утилизации глюкозы, в питательной среде оставалось 6 г/л и 14 г/л.
Значение активной кислотности снижалось при повышении начальной концентрации глюкозы в питательной среде (рисунок 3.6): при начальной концентрации глюкозы 5 и 10 г/л к концу культивирования значение рН составляло 3,2, при 45 и 55 г/л эта величина снижалась до 2,3 рН.
Из литературных данных известно, что избыточная концентрация глюкозы в питательной среде приводит к активации синтеза побочного продукта – глюконовой кислоты (через 2, 5 - кетоглюконат) для продуцента Gluconoacetobacter xylinum [13]. Для симбиотической культуры Medusomyces gisevii побочным продуктом кроме глюконовой кислоты, могут быть этанол, уксусная кислота, глицерин и ряд других соединений (янтарная, молочная, яблочная кислоты) [30]. Побочные кислоты могут оказывать негативное влияние на биосинтез и снижать выход БЦ.
На рисунке 3.7 представлена зависимость выхода БЦ от начальной концентрации глюкозы в питательной среде на 7 и 21 сутки культивирования.
Наибольший выход БЦ получен при концентрации глюкозы в питательной среде 20 и 25 г/л. Выход БЦ на 7 сутки культивирования составил 6,8 и 6,1 %, на 21 сутки – 9,0 и 8,7 %. Следует отметить, что большая масса БЦ синтезировалась в первые 7-10 суток культивирования, далее в последующие дни культивирования выход БЦ увеличивался всего на 3,2 % - 2,6 %, поэтому длительное культивирование проводить нецелесообразно. Это согласуется с численностью уксуснокислых клеток в питательной среде (рисунок 3.4). После 10 суток культивирования численность целлюлозосинтезирующих микроорганизмов снижалась, следовательно, нельзя ожидать увеличения объмов биосинтеза БЦ.
При длительном культивировании наблюдалось ухудшение состояния пленок: потеря эластичности, неравномерность роста, водянистость, расслаиваемость. Ухудшение качества пленок БЦ увеличивало продолжительность их очистки.
По выходу БЦ начальные концентрации глюкозы (г/л) в питательных средах располагались в ряд по мере убывания: 20 25 35 45 55 15 10 5. Таким образом, биосинтез БЦ сопряжен с увеличением численности уксуснокислых бактерий и условия, отвечающие максимуму численности уксуснокислых бактерий, соответствовали максимуму выхода БЦ. Можно предположить, что при концентрации глюкозы в среде более 25 г/л глюкоза расходовалась преимущественно на синтез побочных продуктов – органических кислот, о чем свидетельствовало понижение уровня активной кислотности (рисунок 3.6). Образование органических кислот в питательной среде в свою очередь угнетало рост уксуснокислых бактерий, при этом процесс биосинтеза БЦ замедлялся. При концентрациях глюкозы менее 20 г/л происходило незначительное образование органических кислот (рисунок 3.6), однако целлюлозосинтезирующим бактериям не хватало питания для жизнедеятельности (рисунок 3.4) и биосинтеза БЦ.
Таким образом, оптимальной концентрацией редуцирующих веществ, обеспечивающих максимальный выход БЦ можно принять 20-25 г/л. Результаты эксперимента опубликованы в следующих работах [180-182].
Исследование процесса биосинтеза бактериальной целлюлозы на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса
Количество клеток дрожжей в питательной среде в процессе культивирования оказалась выше, чем уксуснокислых бактерий. На ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного материала увеличение концентрации клеток дрожжей происходило с 0 по 10 сутки, после 11 суток количество дрожжей снижалось до конца культивирования. На ферментативном гидролизате волокнистого продукта увеличение концентрации клеток дрожжей отмечалось с 0 по 9 сутки, с 9 по 14 сутки их количество оставалось постоянным, после 14 суток происходила фаза отмирания. На ферментативном гидролизате технической целлюлозы, полученной комбинированным способом, с 0 по 7 сутки наблюдался экспоненциальный рост, с 7 по 15 сутки – стационарная фаза, далее фаза отмирания. На ферментативном гидролизате технической целлюлозы, полученной азотнокислым способом, с 0 по 4 сутки наблюдался экспоненциальный рост клеток, с 4 по 22 сутки – стационарная фаза, далее – фаза отмирания.
Для уксуснокислых бактерий во всех вариантах лаг-фаза наблюдалась с 0 по 2 сутки. На ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного материала до 8 суток их количество увеличивалось, с 8 по 10 сутки количество уксуснокислых бактерий оставалось на постоянном уровне, с 10 по 24 сутки отмечалась фаза отмирания. На ферментативном гидролизате волокнистого продукта увеличение уксуснокислых бактерий происходило до 9 суток, с 9 по 12 сутки количество клеток оставалось постоянным, с 12 суток происходила фаза отмирания. На ферментативных гидролизатах технической целлюлозы, полученных комбинированным и азотнокислым способами, увеличение уксуснокислых бактерий наблюдалось до 8 суток, с 8 по 16 сутки количество клеток оставалось постоянным, с 16 суток происходила фаза отмирания.
Следует отметить, что наибольшая численность дрожжей и уксуснокислых бактерий наблюдалась при использовании в качестве питательной среды технической целлюлозы, полученной азотнокислым способом. Биологически – это самая доброкачественная среда для роста и размножения продуцента Medusomyces gisevii Sa-12, поэтому можно предположить, что на ней будет наблюдаться эффективный биосинтез БЦ.
Полученные данные подтверждают высказанное в литературе предположение, что у симбиотического организма сформировался особый вариант обмена веществ, элементы которого локализованы у разных партнеров. Дрожжи перерабатывают РВ в этанол, потребляемый уксуснокислыми бактериями, те, в свою очередь, синтезируют гель-пленку БЦ для защиты дрожжей от окружающей среды [30].
На рисунке 3.29 представлено изменение уровня активной кислотности при культивировании Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативных гидролизатах ПОО.
В процессе культивирования симбиотической культуры Мedusomyces gisevii Sa-12 в питательной среде накапливаются промежуточные продукты гликолиза: уксусная, глюконовая кислоты, этанол и глицерин [30], косвенно об их накоплении можно судить по изменениям рН.
Исходное значение pH для всех питательных сред находилось в диапазоне 4,0-4,1. При культивировании во всех вариантах происходило снижение pH: для ферментативного гидролизата лигноцеллюлозного материала значение активной кислотности понизилось до 3,0 на 3-е сутки, в последующие сутки уровень активной кислотности изменялся в диапазоне от 3,0 до 3,3, к концу культивирования pH составляло 3,2. Для ферментативного гидролизата волокнистого продукта значение pH понизилось до 3,15 на 6-е сутки культивирования. Далее в процессе культивирования значение активной кислотности среды медленно повышалось от 3,15 до 3,3. Для ферментативного гидролизата технической целлюлозы, полученной комбинированным способом, в ходе первых 4-х суток культивирования значение pH понизилось до 3,1, с 4 по 16 сутки значение активной кислотности не изменялось, однако затем рН повышался до 3,7. Для ферментативного гидролизата технической целлюлозы, полученного азотнокислым способом в ходе первых 3-х суток культивирования значение pH понизилось до 3,6, затем рН повышалось до 6,1, что нехарактерно для процесса биосинтеза БЦ. Аналогичная зависимость отмечена для биосинтеза БЦ на кислотном гидролизате мискантуса [63]. Предположительно, Мedusomyces gisevii Sa-12 использует кислоты для поддержания нормального метаболизма и жизнедеятельности.
На рисунке 3.30 представлено снижение концентрации РВ в процессе культивирования Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативных гидролизатах ПОО.
На питательных средах ферментативных гидролизатах ПОО утилизация субстрата происходила в два периода: на ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного материала с 0 по 3 сутки культивирования константа скорости утилизации субстрата составила 0,308 сут-1, со 3 по 24 – 0,132 сут-1; на ферментативном гидролизате волокнистого продукта с 0 по 5 сутки культивирования константа скорости утилизации субстрата составила 0,258 сут-1, с 5 по 24 – 0,025 сут-1; на ферментативном гидролизате технической целлюлозы, полученной комбинированным способом, с 0 по 2 сутки культивирования константа скорости утилизации субстрата составила 0,713 сут-1, со 2 по 24 – 0,042 сут-1; на ферментативном гидролизате технической целлюлозы, полученной азотнокислым способом, с 0 по 2 сутки культивирования константа скорости утилизации субстрата составила 0,413 сут-1, со 2 по 24 – 0,061 сут-1. Быстрая утилизация РВ в первый период связана с потреблением дрожжами и их размножением. Высказанное предположение о том, что дрожжи перерабатывают РВ в этанол, который в свою очередь потребляют уксуснокислые клетки, позволяет сделать вывод, что именно после этого происходит размножение уксуснокислых бактерий и биосинтез БЦ. Во второй период РВ медленно расходовались на поддержание жизнедеятельности микроорганизмов. После 20 суток наблюдалась фаза отмирания для микроорганизмов. Расходование РВ в этот период можно объяснить метаболизмом поддержания.
Концентрация ксилозы (рисунок 3.31) в ферментативных гидролизатах в первые 7 суток практически не изменилась от начала культивирования: для ферментативного гидролизата лигноцеллюлозного материала концентрация ксилозы составила 2,9 г/л при общей концентрации РВ – 9,5 г/л; для ферментативного гидролизата волокнистого продукта – 2,4 г/л при общей концентрации РВ – 4,9 г/л; для ферментативного гидролизата технической целлюлозы, полученной комбинированным способом, – 2,1 г/л при общей концентрации РВ – 3,8 г/л; для ферментативного гидролизата технической целлюлозы, полученной азотнокислым способом, – 1,7 г/л при общей концентрации РВ – 7,7 г/л.
После 24 суток культивирования концентрация ксилозы составила: для ферментативного гидролизата лигноцеллюлозного материала – 2,2 г/л при общей концентрации РВ – 7,5 г/л; для ферментативного гидролизата волокнистого продукта – 1,7 г/л при общей концентрации РВ – 3,4 г/л; для ферментативного гидролизата технической целлюлозы, полученной комбинированным способом, – 1,2 г/л при общей концентрации РВ – 1,7 г/л; для ферментативного гидролизата технической целлюлозы, полученной азотнокислым способом, – 0,4 г/л при общей концентрации РВ – 2,3 г/л. Из этого можно сделать вывод, что микроорганизмы, входящие в симбиоз, предпочтительнее потребляют глюкозу.
Выход БЦ в процессе культивирования Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативных гидролизатах ПОО представлен на рисунке 3.32.
Исследование физико-химических свойств образцов бактериальной целлюлозы, полученных на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса
В таблице 3.13 представлены основные характеристические частоты ИК-спектров образцов БЦ, полученных на ферментативных гидролизатах ПОО.
ИК-спектры образцов БЦ показали, что независимо от используемой питательной среды все образцы имели одинаковую химическую структуру, которая соответствует химической структуре БЦ, полученной на синтетической питательной среде (пункт 3.3.1).
На рисунке 3.33 представлены ЯМР-спектры образцов БЦ, полученных на ферментативных гидролизатах ПОО.
Резонансные линии в ЯМР-спектрах для образцов БЦ, полученных на ферментативных гидролизатах ПОО, полностью соответствуют резонансным линиям в ЯМР-спектре для образца БЦ, полученного на синтетической питательной среде (пункт 3.3.1).
Таким образом, по возрастанию степени полимеризации образцов БЦ, полученных на ферментативных гидролизатах ПОО, можно расположить в ряд: БЦ (ЛЦМ) БЦ (ВП) БЦ (ТЦ(АС)) БЦ (ТЦ(КС)). Следует отметить, что в процессе культивирования происходил процесс деструкции БЦ, из-за снижения степени полимеризации во всех случаях. Степень полимеризации образцов БЦ, полученных на ферментативных гидролизатах ПОО, ниже чем степень полимеризации образцов БЦ, полученных на синтетической среде в аналогичных условиях – 2600 (пункт 3.3.2).
На рисунке 3.34 представлены фотографии сетчатой структуры образцов БЦ.
На всех представленных фотографиях образцы БЦ имели сетчатую структуру, которая идентична структуре, полученной на синтетической питательной среде (пункт 3.3.1). Из этого следует, что питательная среда при биосинтезе БЦ продуцентом Medusomyces gisevii Sa-12 не влияет на структуру микрофибрилл.
На рисунке 3.35 представлены рентгенограммы на отражение (I) и на просвет (II) образцов БЦ, полученных на ферментативных гидролизатах ПОО, в области 26Fe от 3 до 50.
Рентгенограммы, отснятые на отражение и на просвет, отличаются, что свидетельствует об анизотропии образцов БЦ.
В таблице 3.15 приведены результаты расчета степени кристалличности (СК) и областей когерентного рассеяния (ОКР) образцов БЦ, полученных на ферментативных гидролизатов ПОО.
СК образцов БЦ, синтезированных на ферментативных гидролизатах ПОО, составила от 87 % до 90 %, что соответствует СК образца БЦ, синтезированного на синтетической питательной среде (87 %). Минимальные размеры поперечного сечения элементарных фибрилл имел образец БЦ, синтезированный на ферментативном гидролизате технической целлюлозы ПОО, полученной комбинированным способом.
Максимальными размерами характеризовались образцы БЦ, синтезированные на ферментативном гидролизате технической целлюлозы ПОО, полученной азотнокислым способом, и на синтетической питательной среде (пункт 3.3.1).
В таблице 3.16 представлены результаты расчета концентрации фаз I и ip (СI, Сір), периодов (a, b, с) и углов (, р, у) элементарной ячейки фазы I и факторов недостоверности для образцов БЦ, синтезированных на ферментативных гидролизатах ПОО. Расчеты из рентгенограмм, отснятых на отражение.
Размеры элементарной ячейки для образцов БЦ, синтезированных на ферментативных гидролизатах ПОО, соответствовали размерам элементарной ячейки образца БЦ, синтезированного на синтетической питательной среде (пункт 3.3.1). Во всех анализируемых образцах БЦ преобладала низкосимметричная фаза I, что подтверждает бактериальное происхождение образцов БЦ.
Таким образом, ферментативные гидролизаты ПОО являются пригодными для получения БЦ высокого качества. В литературе [10] описаны продуценты, синтезирующие БЦ с выходом более 80 %, степень кристалличности при этом находилась в диапазоне от 52 % до 54 %.
Предположительно, низкая степень кристалличности может влиять на свойства БЦ. В работе [204, 205] степень кристалличности для образцов БЦ, синтезированных на других питательных средах, составила от 89 % до 95 %. Это доказывает, что продуцент Мedusomyces gisevii Sa-12, несмотря на низкий выход, по сравнению с мировым уровнем (таблица 1.3), способен производить БЦ высокого качества. На проведенную работу получен акт испытания (Приложение 6.6).
На рисунке 3.36 приведена принципиальная технологическая схема получения БЦ из ПОО. ПОО подвергали обработке разбавленными растворами азотной кислоты и гидроксида натрия с получением технической целлюлозы. Техническая целлюлоза подвергалась ферментативному гидролизу с помощью ферментных препаратов «Целлолюкс-А» и «Брюзайм BGX». Полученный водный гидролизат – раствор сахаров с преимущественным содержанием глюкозы с помощью симбиотической культуры Мedusomyces gisevii Sa-12 преобразовывался в ценный продукт – БЦ. Далее БЦ промывалась от остатков питательной среды и клеток, стерилизовалась и упаковывалась [206]. По результатам проведенных исследований разработана технологическая документация, утвержденная директором ИПХЭТ СО РАН (Приложения 6.1 – 6.5).