Разработка технологии молекулярно-генетического анализа генетически модифицированных сельскохозяйственных растений и продуктов их переработки Алексеев Яков Игоревич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1 Генетически модифицированные организмы (определение, проблемы использования) .

1.2. Основные цели создания ГМ линий сельскохозяйственных растений 12

1.3. Классификация ГМО 15

1.4. Законодательство в сфере оборота и анализа ГМ продукции. Обзор линий ГМО, 15 разрешенных к применению в продуктах питания и кормах на территории Российской Федерации

1.5. Основные методы обнаружения ГМО 20

1.5.1. Физико-химические методы анализа (хроматография, спектрофотомтрия, 20 спектрофлюорометрия и др.) .

1.5.2. Иммуноферментный анализ 20

1.5.3. Методы, основанные на полимеразной цепной реакции 21

1.6. Типы ПЦР анализа образцов на наличие ГМО 24

1.7. Схема анализа ГМО методом ПЦР-РВ в России 26

1.8. Современное состояние использования ПЦР-РВ в диагностике ГМО 27

1.9. Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР 29

1.10. Другие методы определения ГМО, основанные на анализе ДНК 30

1.11. Диагностические системы для выявления ГМО 34

Глава 2. Материалы и методы 37

2.1. Конструирование, синтез и очистка праймеров и зондов для ПЦР-РВ 37

2.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 40

2.3. Спектрофотометрическое определение концентрации нуклеиновых кислот 41

2.4. Биологический материал (стандарты, опытные образцы) 41

2.5. Определение процентного содержания чужеродной ДНК относительно геномной ДНК 43 растений

2.6. Методика приготовления калибровочных растворов на примере сои линии GTS 40-3-2 44 и кукурузы линии MON 810

2.7. Статистическая обработка результатов исследования 44

2.8. Получение плазмиды для внутреннего положительного контроля (клонирование) 44

Глава 3. Результаты исследований 48

3.1 Разработка метода и набора реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов .

3.2 Разработка скрининговых методов выявления трансформационных событий

3.2.1 Разработка праймеров и зондов для обнаружения трансформационных событий методом ПЦР в реальном времени .

3.2.2. Выявление последовательностей генов устойчивости к фосфинотрицину - bar, pat и лифосату – epsps

3.2.3. Выявление растительной ДНК и ДНК сои 72

3.2.4. Разработка наборов реагентов для скринингового обнаружения промоторов 35S CaMV, Р-FMV и терминатора NOS

3.2.5. Разработка набора реагентов для скринингового обнаружения генов bar, pat и epsps методом ПЦР в реальном времени .

3.3. Разработка набора реагентов для обнаружения вируса мозаики цветной капусты и ромотора CaМV 35S методом ПЦР в реальном времени

3.4. Разработка набора реагентов для выявления ГМ рапса методом ПЦР в реальном времени

3.5. Разработка набора реагентов для количественного определения ДНК ГМ сои лини 98 GTS 40-3-2, устойчивой к глифосату методом ПЦР в реальном времени

3.6. Разработка набора реагентов для количественного определения ДНК ГМ кукурузы 103 линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку .

3.7. Пример исследования продуктов питания на содержание в них ДНК ГМО 109

Выводы 111

Список литературы

• Законодательство в сфере оборота и анализа ГМ продукции. Обзор линий ГМО, 15 разрешенных к применению в продуктах питания и кормах на территории Российской Федерации
• Спектрофотометрическое определение концентрации нуклеиновых кислот
• Разработка праймеров и зондов для обнаружения трансформационных событий методом ПЦР в реальном времени
• Разработка набора реагентов для количественного определения ДНК ГМ кукурузы 103 линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку

Введение к работе

Актуальность темы, степень ее разработанности. Одной из важнейших задач современной биотехнологии является повышение эффективности и безопасности производства основных сельскохозяйственных культур. Эффективным способом интенсификации сельского хозяйства является придание традиционным растениям новых свойств (устойчивость к болезням, вредителям, гербицидам) с помощью генной инженерии. При этом необходимо глубокое изучение и исключение возможных негативных воздействий на человека и экологию от введения в растение генетических изменений. Современное законодательство Российской Федерации регламентирует использование генетически модифицированных организмов (ГМО): в продуктах питания и кормах могут быть использованы только прошедшие государственную регистрацию линии сельскохозяйственных культур, для которых доказана их безопасность для человека и экологии (Тутельян В.А., 2007, Соколов М.С., 2011). При этом, если количество ДНК генетически модифицированного растения в продукте питания превышает 0,9%, соответствующее указание должно содержаться на этикетке данного продукта. Основным эффективным способом контроля за применением ГМО является анализ выделенной из продуктов питания и кормов ДНК на наличие в ней специфических последовательностей нуклеотидов, являющихся регуляторными элементами трансгенов (промоторов и терминаторов). Наиболее эффективным методом-применениятакого анализа является метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), обладающий высокими результативностью, аналитической чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью и повторяемостью результата. Метод является быстрым, автоматизируемым и стандартизуемым и позволяет получать как качественный, так и, что особенно важно, количественный результат. Кроме того, метод ПЦР-РВ позволяет детектировать несколько ДНК мишеней в мультиплексном формате, что существенно снижает стоимость исследования.

Цель работы – разработка и внедрение технологии молекулярно-генетического анализа генетически модифицированных (ГМ) сельскохозяйственных растений и продуктов их переработки. Задачи работы

1. Разработать метод и набор реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов.

2. Разработать наборы реагентов для скринингового обнаружения ДНК ГМ линий методом мультиплексной ПЦР в реальном времени.

3. Разработать набор реагентов для одновременного обнаружения вируса мозаики цветной капусты и промотора 35S CaMVметодом мультиплексной ПЦР в реальном времени.

4. Разработать набор реагентов для выявления ДНК ГМ рапса методом мультиплексной ПЦР в реальном времени.

5. Разработать набор реагентов для идентификации и количественного обнаружения ГМ сои линии GTS 40-3-2 методом ПЦР в реальном времени.

6. Разработать набор реагентов для идентификации и количественного обнаружения ГМ кукурузы линии MON 810 методом ПЦР в реальном времени. Научная новизна выполненных исследований. Впервые разработаны

наборы реагентов с уникальными системами праймеров и зондов, подобранными на основе анализа международной базы генетических данных GenBank. Изучены и подтверждены их высокие аналитические характеристики.

Впервые разработаны наборы реагентов для скринингового обнаружения ГМО, для выявления ГМ рапса, а также наборы реагентов для идентификации и количественного обнаружения ГМ сои линии GTS 40-3-2 и ГМ кукурузы линии MON 810 методом ПЦР в реальном времени.

Впервые разработана комплексная технология молекулярно-генетического анализа ГМ растений и продуктов их переработки, реализующая все стадии исследования – выделение нуклеиновых кислот из растительного сырья и пищевых продуктов на магнитных частицах, скрининг разрешенных для использования на территории Российской Федерации ГМО, идентификацию линий и их количественный анализ.

Теоретическая и практическая значимость полученных результатов. Разработанные наборы реагентов позволяют выявлять 22 из 24 линии ГМ растений, разрешенных для использования в продуктах питания и кормах на территории Российской Федерации. Разработанная технология молекулярно-генетического анализа ГМ сельскохозяйственных растений и продуктов их переработки используются испытательными лабораториями Роспотребнадзора, Россельхознадзора, Ростеста, государственными научно-исследовательскими и образовательными учреждениями и частными компаниями как на территории Российской Федерации, так и за рубежом (Украина, Беларусь, Казахстан, Узбекистан, Таджикистан). Использование разработанных наборов реагентов для количественного обнаружения ГМ сои линии GTS 40-3-2 и ГМ кукурузы линии MON 810 методом ПЦР в реальном временирегламентируется постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.11.2007 №80 «О надзоре за оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО» и методическими указаниями МУК 4.2.2304-07.

Методология и методы исследований. Исследования проводились современными стандартными и вновь разработанными методами. В работе использовались референтные образцы, а также молекулярно-генетические методы. Достоверность и обоснованность результатов и выводов работы подтверждается использованием статистических методов.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод и набор реагентов на магнитных частицах для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов обеспечивает прохождение последующей ПЦР в реальном времени с эффективностью не ниже 91%.

2. Пентаплексный набор реагентов позволяет выявлять в анализируемых образцах растительного происхождения одновременно ДНК растений (по гену NADH-дегидрогиназы растений), ДНК ГМ растений по промоторам CaMV 35S и P-FMV, терминатору NOS и имеет внутренний положительный контроль для исключения ложноотрицательных результатов. Эффективностьвсех пяти реакций - в диапазоне 91-93,5%; специфичность на исследованной выборке образцов - 100%; аналитическая чувствительность - в пределах 10³ копий ДНК мишени в мл. Разработанный набор реагентов позволяет выявлять 22 из 24 разрешенных для применения на территории Российской Федерации линий ГМ растений.

3. Тетраплексный набор реагентов, позволяет проводить скрининг и выявлять в анализируемых образцах растительного происхождения три основных специфичных для ГМ растений гена: bar и pat, обеспечивающих устойчивость к фосфинотрицину, и гена epsps, придающего устойчивость к глифосату (Раундап), имеет внутренний положительный контроль для исключения ложноотрицательных результатов исследования. Эффективность всех четырех реакций в диапазоне 92,4 - 95,3%. Набор обладает 100% специфичностью на исследованной выборке образцов и высокой аналитической чувствительностью, находящейся в пределах 10³ копий ДНК мишени в мл, позволяет выявлять 12 из 24 разрешенных на территории Российской Федерации линий ГМ растений.

4. Набор реагентов для одновременного обнаружения вируса мозаики цветной капусты и промотора 35S CaMVметодом мультиплексной ПЦР-РВ обладает следующими характеристиками: эффективность - 91%; специфичность на исследованной выборке образцов - 100%; аналитическая чувствительность составляет 1*10³ копий ДНК в мл. по фрагментам промотора 35S CaMVи ДНК вируса мозаики цветной капусты. Разработанный набор реагентов позволяет исключать ложноположительные результаты исследования при анализе генетически модифицированных растений, возникающие за счёт попадания в них ДНК вируса мозаики цветной капусты.

5. Набор реагентов позволяет выявлять ДНК рапса и обнаруживать чужеродные гены pat, epspsp и терминатор NOS, присутствующие в большинстве коммерчески используемых линий ГМ рапса методом ПЦР-РВ, обладает следующими характеристиками: эффективность - 91%; специфичность на исследованной выборке образцов - 100%; аналитическая чувствительность - 2*10³ копий определяемых ДНК мишеней в мл.

6. Набор реагентов для идентификации и количественного обнаружения ГМ сои линии GTS 40-3-2 методом ПЦР-РВ позволяет определять количество ДНК ГМ сои линии GTS 40-3-2 с чувствительностью 0,1% стандарта IRMM GTS40-3-2 и диапазоном количественных измерений (0,1-10) масс % ГМО.

7. Набор реагентов для идентификации и количественного обнаружения ГМ кукурузы линии MON 810 методом ПЦР-РВ позволяет определять количество ДНК ГМ кукурузы линии MON 810 с

чувствительностью 0,5 % стандарта IRMM MON810 и диапазоном количественных измерений (0,5-10) масс % ГМО.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на семинарах и годовых отчетах лаборатории анализа генетически модифицированных растений ФГБНУ ВНИИСБ; на 1 st Global Conference on GMO Analysis Villa Erba, Italy 24-27 June, 2008; XIII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСБ, 10.04.2013г.; XVI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Москва, ВНИИСБ, 14.04.2016 г.

Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие в разработке программы исследований, планировании экспериментов, проведении, оптимизации и разработке методов, клонировании и секвенировании фрагментов генов, синтезе и очистке праймеров и зондов, учете и оценке полученных данных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, выводов, списка литературы, приложения, списка сокращений и условных обозначений. Работа изложена на 128 страницах, содержит 33 рисунка и 31 таблицу. Библиографический указатель литературы включает 107 источников, из них 89 зарубежных авторов.

Законодательство в сфере оборота и анализа ГМ продукции. Обзор линий ГМО, 15 разрешенных к применению в продуктах питания и кормах на территории Российской Федерации

Примерами могут служить соя MON87712 с усиленным ростом и репродуктивным развитием (содержит ген bbx32 Arabidopsis thaliana, кодирующий белок, регулирующий суточные физиологические процессы растения) и эвкалипт Н421, который содержит ген cel1 Arabidopsis thaliana, кодирующий белок, способствующий быстрому росту.

Изменение качества продукта

Томат FLAVR SAVR содержит ген pq, подавляющий продукцию фермента, ответственного за расщепление пектиновых молекул в клеточной стенке, что приводит к задержке размягчения плодов; роза WKS82/130-4-9 содержит ген bp40 Viola wittrockiana катализирующий синтез синего пигмента антоциана дельфинидина и его производных

Устойчивость к абиотическому стрессу (климатическим и погодным условиям) Примером может служить соя MON87460, которая содержит ген cspB Bacillus subtilis, поддерживающий нормальные клеточные функции в условиях засухи. Стекерные линии – обладают одновременно несколькими ГМ признаками Примерами служат кукуруза 3272 х Bt11 х MIR604 х TC1507 х 5307 х GA21 – сочетание признаков устойчивости к гербицидам, устойчивости к насекомым, изменения качества продукта и кукуруза 5307 х MIR604 х Bt11 х TC1507 х GA21 х MIR162 GA21 – сочетание признаков устойчивости к гербицидам и устойчивости к насекомым. 1.3. Классификация ГМО

ГМО могут быть классифицированы на основе происхождения трансгена. ГМО подразделяют на ГМО первого поколения, в которых экспрессия гена, определяющего желаемый признак, находится под контролем универсального промотора (например, вируса мозаики цветной капусты, cauliflower mosaic virus, CaMV P35S) и терминатора T35S. Большинство коммерческих ГМО принадлежит к этому типу. ГМО второго поколения (stacked) были получены либо путем скрещивания ГМО первой генерации между собой, либо путем внедрения второй трансгенной конструкции в уже существующий ГМО (на стадии полевых испытаний). ГМО третьего поколения (near-intragenic) содержат трансген, в котором кодирующая желаемый признак генетическая последовательность хозяйского происхождения, и лишь регуляторные последовательности являются чужеродными. В связи с тем, что чужеродные последовательности в ГМО этого поколения существенно уменьшены, обнаружение таких ГМО значительно сложнее (находятся на стадии разработок).

1973 год принято считать годом возникновения генной инженерии постольку, поскольку именно в это время американский биохимик П.Берг впервые использовал технологию рекомбинантной ДНК. Одновременно с проведением такого рода исследований стал обсуждаться вопрос и о возможных рисках, сопровождающих применение данной технологии. Поэтому потребовалось формирование правовой основы использования этой технологии, прежде всего, на национальном уровне. И уже в 1976 году Конгресс США одобрил разработанные Комитетом по технологии рекомбинированной ДНК Национального института здоровья США Руководящие принципы проведения исследований с рекомбинантными ДНК (Кузин, 2013).

Пищевая продукция из ГМО подлежит обязательной оценке на безопасность, государственной регистрации и последующему контролю за оборотом. К 2017 г 24 линий ГМ растений имеют действующие разрешения на ввоз в Россию и использование в пищевой промышленности (см. таблицу 1), однако выращивать ГМ-культуры можно только на опытных участках. Пищевые продукты, полученные из ГМО, прошедшие медикобиологическую оценку и не отличающиеся по изученным свойствам от своих аналогов, полученных традиционными методами, являются безопасными для здоровья человека, разрешены для реализации населению и для использования в пищевой промышленности без ограничений в соответствии с письмом «о совершенствовании надзора за пищевыми продуктами, содержащими ГМО и ГММ Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 20 августа 2008 года N 01/9044-8-32».

Пищевая продукция подлежит обязательному этикетированию при содержании компонентов ГМО более 0,9 %. Содержание в пищевых продуктах 0,9% и менее компонентов, полученных с применением ГМО, является случайной или технически неустранимой примесью (СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»).

В Российской Федерации действует законодательная и нормативно-методическая база, необходимая для эффективного осуществления государственного надзора и производственного контроля за пищевой продукцией, произведенной из ГМО растительного происхождения. Кроме того в субъектах Российской Федерации располагаются Центры гигиены и эпидемиологии оснащенные лабораторным оборудованием для проведения исследований методом ПЦР в реальном времени, так как метод ПЦР-РВ является рекомендованным для выявления ГМО (ГОСТ Р 53244-2008, ГОСТ Р 56058-2014, МУК 4.2.2304-07, МУК 4.2.3309-15).

По состоянию на апрель 2017 г., на территории Российской Федерации для использования в продуктах питания, пищевом сырье и кормах для животных разрешены 24 вида линий ГМ растений: 8 линий сои, 12 линий кукурузы, 1 линия риса, 1 линия сахарной свеклы, 2 линии картофеля (http://fp.crc.ru/gosregfr/ реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию (Таблица 1).

Таким образом, задача разработки новых наборов реагентов для идентификации и количественного анализа методом ПЦР-РВ образцов пищевой промышленности на наличие ГМ растений является актуальной в настоящее время на территории РФ.

Спектрофотометрическое определение концентрации нуклеиновых кислот

Для количественного определения содержания ГМО в образцах использовался метод ПЦР-РВ. Процентная концентрация ГМО определялась путем нормализации содержания специфичных для ГМО последовательностей по отношению к содержанию последовательностей, специфичных для растений и представленных единичной копией эндогенных контрольных генов (ген AAT для сои и ген Adh1 для кукурузы). Расчет производился с использованием калибровочной прямой, построенной по значениям пороговых циклов для образцов с известным соотношением чужеродной и эндогенной контрольной ДНК. Реакции ПЦР-РВ проводили в одной побирке. Для сои GTS4032 – амплификация гена AAT по каналу детекции R6G и фрагмента ДНК между 3 -концом ГМ конструкции и геномом сои по каналу детекции ROX, а для MON810 – Adh1 по каналу детекции R6G и фрагмента ДНК между геномом кукурузы и 5 -концом ГМ конструкции по каналу детекции ROX.

Для получения калибровочной прямой использовались сертифицированные референсные материалы с известными концентрациями из института контрольных материалов и измерений (IRMM, Бельгия). В случае ГМ сои линии GTS4032 применялись референсные образцы с содержанием ГМО 0,10%, 1%, 10%. В случае ГМ кукурузы линии MON810 – рефреренсные образцы с содержанием ГМО 0,49%, 1,98% и 9,90%.

Для построения калибровочной кривой по оси X откладывалась разница пороговых циклов для чужеродной и эндогенной ДНК - каналы детекции FAM и R6G (Ct), по оси Y десятичный логарифм процентного содержания чужеродной ДНК относительно эндогенной ДНК. Дальнейший расчет производили с использованием программы Microsoft Excel 2013.

Для приготовления положительных контрольных и калибровочных образцов использовали референсные материалы (соя линии GTS 40-3-2 0,1%, 1%, 10% и кукуруза линии MON810 0,49%, 1,98%, 9,9% (IRMM, Бельгия)). Для выделения ДНК использовался разработанный метод, описанный в п 3.1 данной работы. Для выделения брали навески образцов массой 50 мг. Качество и концентрацию выделенной ДНК оценивали так, как описано в п.2.2 и п.2.3. Препараты ДНК калибровочных образцов хранили при -20 оС.

Обработку результатов ПЦР-РВ проводили с использованием программного обеспечения к приборам для ПЦР в реальном времени АНК 32 (ИАП РАН, Россия) и CFX 96 (Bio Rad, США). Исследование каждого образца проводили в двойном повторе. Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel 2013.

ПЦР-продукты клонировали методом TA-cloning в pGEM T-easy векторе в соответствии с протоколом производителя ("pGEM Easy Vector Systems" «Promega», США). Вектор pGEM содержит ген устойчивости к ампициллину и ген -галактозидазы, что позволяет проводить бело-голубую селекцию рекомбинантных клонов. ПЦP-фрагменты разделяли препаративным электрофорезом в 1-1,5% агарозном геле. Продукты нужной длины вырезали из геля, очищали с помощью набора Cleanup Standard (Евроген, Россия), спектрофотометрически определяли концентрацию элюированных ампликонов. Трансформацию клеток проводили стандартным методом (Sambrook and Russell, 2001). 2.8.2. Получение компетентных клеток E. Coli

Штамм бактерий E. coli XL10-Gold (Stratagene) рассевали штрихом на чашки Петри с LB-агаром без ампициллина в асептических условиях. Инкубацию проводили в течение ночи при 37С до появления отдельных колоний. Несколько клонов переносили в 50 мл среды SOB (2% бакто-триптона, 1,1% бакто-дрожжевого экстракта, 0,2% NaCl, 1% KCl), содержащей 10мМ MgSO4, культивировали при 20С на шейкере и интенсивной аэрации до оптической плотности OD600=0,3-0,4, после чего суспензию клеток немедленно помещали в лед на 10 мин. Бактерии осаждали центрифугированием (4000g, 10 мин, 4С). Образовавшийся осадок ресуспендировали в 50 мл раствора TB (0С) (10мМ PIPES, 55мМ MnCl2, 250мМ KCl pH 6,7). Далее полученный после центрифугирования осадок ресуспендировали в 5 мл раствора TB (0С), содержащего 7% DMSO. Суспензию клеток разливали по 50 мкл в охлажденные, стерильные пробирки и замораживали в при -70 С.

Продукты ПЦР лигировали с T-вектором pGEM Easy (Promega, США) в эквимолярном соотношении вставка: вектор 1:1. Реакционная смесь содержала амплифицированный фрагмент ДНК, T-вектора, 5 е.а. Т4 ДНК-лигазу («Invitrogen», США), 10 мМ Трис- HCl (pH 8.5, 37oC), 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl и 1 мМ ATP. Реакцию проводили при температуре 22 С в течение 1-2 часов.

Лигазную смесь добавляли к 200 мкл компетентных клеток Escherichia сoli (штамм XL10-Gold) и инкубировали 30 мин при 4С. Затем клетки подвергали тепловому шоку в течение 90 с при 42С (тепловой шок) и быстро охлаждали во льду. После этого добавляли к клеткам 800 мкл жидкой мл среды Луриа-Бертани (LB: 1% NaCl, 1% бакто-триптон, 0.5% бакто-дрожжевой экстракт, рН 7.5) и инкубировали 1 ч при 37С и непрерывном перемешивании при 80 об/мин. Далее клетки высевали на чашки Петри со средой LB, 1,5% бакто-агаром, 50 мкг/мл ампициллина, изопропил--D-тиогалактозидом (IPTG), X-Gal и инкубировали при 37С в течение ночи.

Отбирали белые колонии («бело-голубая селекция»), выросшие на селективной среде и пересевали в 5 мл жидкой среды LB с ампицилином, инкубировали при 37С и 180 об/мин в течение ночи. Ночную культуру использовали для выделения плазмидной ДНК. Для этого клетки E.сoli осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин (на центрифуге minispin, Eppendorf). Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора PlasmidMiniprep (Евроген, Россия). Наличие в плазмиде заданной последовательности и ее ориентацию подстверждали путем секвенирования препаратов плазмид по Сэнгеру с использованием специфичных праймеров (Sanger et al., 1977) с помощью набора для секвенирования BigDye ReadyReaction Mix V3.1 (Life technologies, США) на генетическом анализаторе ABIPrism3130xl (Life technologies, США) и генетическом анализаторе Нанафор-05 (ИАП РАН) в ЦКП «Биотехнология».

Определение значений концентрации рекомбинантных плазмид осуществляли на основе данных, полученных при измерении концентрации ДНК с помощью набора реагентов Quant-iT RiboGreen DNA Assay Kit (Promega, США) согласно инструкциям производителя. Для раствора ДНК концентрацию определяли исходя из значений оптической плотности и размера генома вида растения, приведенного в (Arumuganathan, K. and Earle, E.D, 1991). Полученные препараты использовали для определения аналитической чувствительности реагентов.

Готовили разведения препарата раствора рекомбинантной плазмиды pGEM (с помощью ТЕ-буфера) в диапазоне концентраций: 104 копий/мл, 103 копий/мл и 5 102 копий/мл. Поскольку данные разведения соответствуют предполагаемому пределу обнаружения, при достаточно большой выборке пограничные положительные результаты должны быть зарегистрированы во всех трех смежных разведениях. Рекомбинантные плазмиды использовались для определения аналитической чувствительности разработанных наборов реагентов и для создания внутреннего положительного контроля ПЦР реакций. Перечень рекомбинантных плазмид, использованных в работе приведен в таблице 7.

Разработка праймеров и зондов для обнаружения трансформационных событий методом ПЦР в реальном времени

Белок, синтезируемый с гена epsps, является важным катализатором при синтезе ароматических аминокислот в шикиматном пути. Модификации этого белка, встречающиеся в растениях, чувствительны к глифосату. В противоположность им, белок из штамма CP4 бактерий Agrobacterium species является устойчивым к этому гербициду. Таким образом, на основе внедрения бактериального гена epsps в геном различных сельскохозяйственных растений создано большое количество линий генетически модифицированнах организмов (ГМО). Первоначально в геном растений внедряли ген epsps, идентичный бактериальному. Однако бактериальные гены имеют особенности, ухудшающие их экспрессию в составе растительного генома. Среди таких особенностей выделяют: потенциальные сайты полиаденилирования, богатые аденином (А) и тимином (Т); более высокое содержание в бактериальном геноме гуанина (Г) и цитозина (Ц), в сравнении с большинством двудольных растений; наличие у бактерий Г-Ц богатых участков, а также кодонов, редко встречающихся у растений. Высокое содержание Г-Ц участков в гене epsps повышает вероятность образование шпилек на матричной РНК, что ухудшает экспрессию белка. Учитывая все вышеописанные причины, производителями ГМО была создана синтетическая версия гена epsps, в которой часть Г и Ц остатков было заменено на А и Т без изменения функциональной активности конечного белкового продукта. Таким образом, среди производящихся в настоящий момент линий ГМО встречаются содержащие как исходный, так и модифицированный вариант гена epsps (Demeke T. Et al., 2008).

Для детекции гена epsps использовали праймеры и зонды, спланированные на две различных последовательности, соответствующие двум модификациям гена (GenBank AB209952, A59871) сои линии GTS 40-3-2 и рапса линии GT 73, множественное выравнивание которых приведено на рисунке 15:

Множественное выравнивание целевых последовательностей гена 5-енолпируват-шикимат-З-фосфатсинтазы (epsps) из бактерии Agrobacterium tumefaciens. Подчеркнуты места гибридизации разработанных праймеров, выделены места гибридизации разработанных зондов для ПЦР-РВ. Для исследования аналитических характеристик разработанных праймеров и зондов использовали следующие реакционные смеси:

Реакционная смесь «bar»: 2,5x Реакционная смесь, 10 мкл/реакция, Taq ДНК полимераза «T+» 2,5 единицы/реакция, Bar-for 6 пкмоль/реакция, Bar124 rev 6 пкмоль/реакция, Bar124-ROX 4 пкмоль/реакция. H2O до 25 мкл.

Реакционная смесь «pat»: 2,5x Реакционная смесь, 10 мкл/реакция, Taq ДНК полимераза «T+» 2,5 единицы/реакция, Pat_ F 5 пкмоль/реакция, Pat_ R 5 пкмоль/реакция, Pat_ FAM 3 пкмоль/реакция. H2O до 25 мкл.

Реакционная смесь «epsps»: 2,5x Реакционная смесь, 10 мкл/реакция, Taq ДНК полимераза «T+» 2,5 единицы/реакция, EPSP_F 6 пкмоль/реакция, EPSP_F 16 пкмоль/реакция, EPSP_R 6 пкмоль/реакция, EPSP_R2 6 пкмоль/реакция, EPSP_ R6G 4 пкмоль/реакция, EPSP_ R6G _R2 4 пкмоль/реакция. H2O до 25 мкл.

Специфичность подобранных праймеров и зондов для выявления последовательностей генов bar, pat и epsps была исследована методом ПЦР-РВ на образцах ДНК, выделенных из ГМ-линий сои (Соя GTS40-3-2, A5547-127, MON89788, BPS-CV-1279, MON 87701), кукурузы (MON810, T25, Bt11, MON863, NK603, GA21, MIR604, MON88017, 3272, MIR 162, 5307, MON 89034), риса (LLRICE62), сахарной свеклы H7-1 и рапса GT73. Результаты исследования суммированы в таблице 14.

Результаты ПЦР-РВ (прохождение реакции и значение порогового цикла) при определении специфичности разработанных праймеров и зондов для выявления генов bar, pat и epsps Как видно из таблицы положительный результат амплификации наблюдался: - в реакции выявления последовательности гена bar в реакциях только с образцом ДНК, выделенной из риса LLRICE62. - в реакции выявления последовательности гена pat только для образцов ДНК, выделенных из линий сои А5547-127, кукурузы T25, кукурузы Bt11. - в реакции выявления последовательности гена epsps только для образцов ДНК, выделенных из линий сои линий GTS40-3-2 и MON89788, кукурузы MON88017, сахарной свеклы H7-1 и рапса GT73. Для всех мишеней получены отрицательные результаты амплификации для образцов ДНК не ГМ растений, а также ДНК млекопитающих, рыб и птиц.

Эти результаты подтверждают 100% специфичность подобранных праймеров и зондов на исследованной выборке образцов и их пригодность для дальнейшего использования.

Для проверки эффективности ПЦР в реальном времени разработанных наборов реагентов проводили анализ серии десятикратных разведений образцов ДНК, выделенных из риса линии LLRICE62 для гена bar, из кукурузы линии Т25 для гена pat, из сои линии GTS 40-3-2 для гена epsps. Результаты ПЦР-РВ представлены на рисунке 14. А) bar Б) pat В) epsps Рисунок 14. Результаты ПЦР-РВ для серии десятикратных разведений ДНК А) рис линии LLRICE62 амплификация фрагмента последовательности гена bar (канал детекции ROX), Б) кукуруза линии Т25 амплификация фрагмента последовательности гена pat (канал детекции FAM), В) соя линии GTS 40-3-2 амплификация фрагмента последовательности гена epsps (канал детекции R6G). Эффективность реакций, наклон кинетической кривой и коэффициент корреляции R2, рассчитанные с помощью метода наименьших квадратов при исследовании серии четырех десятикратных разведений приведены в таблице 15.

Разработка набора реагентов для количественного определения ДНК ГМ кукурузы 103 линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку

Так как количественное определение содержания ГМО в образцах методом ПЦР-РВ определяется путем нормализации содержания специфичных для ГМО последовательностей по отношению к содержанию последовательностей, специфичных для растений и представленных единичной копией, нами в качестве эндогенногого контроля был взят ген AAT (Glycine max aspartate aminotransferase glyoxysomal isozyme AAT1 precursor (AAT)). Подбор системы праймер-зонд и ее характеристики описаны в разделе 3.2.2.

Рекомендованные протоколы для количественного определения ДНК линий ГМО предполагают проведение ПЦР-РВ для референсных генов ДНК растений и ГМО специфичных рекомбинантных ДНК в 2-х разных пробирках, нами же был разработан вариант мультиплексной системы, позволяющей проводить амплификацию в одной пробирке.

Для создания мультиплексной реакции были объединены две реакции в одной реакционной смеси РС «Соя+GTS4032» : 2,5x Реакционная смесь 10 мкл/реакция, Taq ДНК полимераза «T+» 2,5 единицы/реакция, SG2_up 3 пкмоль/реакция, SG2_low 3 пкмоль/реакция, SG2_Pr_up_R6G 4 пкмоль/реакция, 4032_JRC_F 5 пкмоль/реакция, 4032_JRC_R 5 пкмоль/реакция, 4032_Taq_ROX 4 пкмоль/реакция, H2O до 25 мкл.

Для подтверждения отсутствия взаимного влияния двух реакций амплификации при проведении в одной пробирке, мы сравнили значения пороговых циклов и эффективности реакций по отдельности и в мультиплексе. Полученные результаты суммированы в таблице 26.

Как видно из полученных данных нет сдвига по значениям пороговых циклов и эффективности реакции ПЦР для амплификации фрагмента гена AAT1 сои и фрагмента ДНК между 3 -концом ГМ конструкции и геномом сои GTS40-3-2. Изменения форм кривых флуоресценции также не наблюдалось. Следовательно, они могут быть использованы в одной реакционной смеси.

Определение процентного содержания сои GTS40-3-2 проводили с использованием калибраторов на основе стандартных калибровочных образцов (КО) производства Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM, Бельгия), которые представляют собой смеси сои или кукурузы дикого типа (0 % ГМО) и ГМ сои или кукурузы (100 % ГМО) в определенном процентном соотношении. Разность значений пороговых циклов двух реакций для калибровочных образцов используется для построения калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается процентное содержание ДНК ГМ сои в анализируемых образцах (рисунок 30).

Рисунок 30. Слева - кинетические кривые амплификации образцов с различным содержанием ДНК сои линии GTS40-3-2 (0,1%, 1% и 10 %). Справа – калибровочная кривая и параметры реакции: коэффициент корреляции R2 составил 0,9994, эффективность ПЦР-РВ – 96,9%.

В таблице 27 приведен пример расчета процента содержания ДНК сои линии GTS 40-3-2 в исследуемом образце по калибровочной кривой. Для количественного анализа использовались образцы ДНК выделенные из сертифицированных стандартов соевой муки (IRMM, Бельгия) с массовой долей 0,1% , 1% и 10 % сои GTS40-3-2. Чувствительность теста составила 0,1% стандарта IRMM GTS40-3-2. Диапазон количественных измерений (0,1-10) масс % ГМО.

Кукуруза линии MON810 разработана компанией «Monsanto Canada Inc.». Она обладает устойчивостью к насекомым вредителям, а в большей степени к Ostrinia nubilalis, что существенно снижает потери урожая кукурузы. Кроме того, при выращивании кукурузы линии MON810 нет необходимости обрабатывать посевы инсектицидами, что уменьшает экологический ущерб. Устойчивость кукурузы линии MON810 обусловлена вставкой гена, кодирующего натуральный инсектицидный полипептид (ген выделен из Bacillus thuringiensis spp. kurstaki). Данный полипептид действует на некоторые виды чешуекрылых. Полипептид, экспрессирующийся в MON810, - это несколько урезанная форма инсектицидного полипептида, называемого CRYIA(b) d-эндотоксин, который собственно и обусловливает устойчивость к насекомым-вредителям (Патрушев М.В., 2004).

В геноме MON810 присутствует единственная копия гена cryIA(b) и находящегося под контролем сильного конститутивного CaMV E35S промотора и лидирующей последовательности кукурузного интрона HSP70 (рисунок 31). Нами был разработан метод на основане мультиплексной ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной для трансформационного события MON 810 на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции. Для разработки системы для обнаружения ДНК кукурузы линии MON 810 за основу был взят официальный международный протокол http://gmo crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/Mon810_validation_report.pdf, в котором предложены следующие праймеры и зон, спланированные фрагмент ДНК между геномом кукурузы и 5 -концом ГМ конструкции: M810-1: TCg AAg gAC gAA ggA CTC TAA CgT, M810-2: gCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT, M810-Pr-ROX: ROX-AAC ATC CTT TgC CAT TgC CCA gC-BHQ2

Для исследования эффективности праймеров и зонда для амплификации использовалась реакционная смесь РС "MON810": 2,5x реакционная смесь 10 мкл/реакция, Taq ДНК полимераза «T+» 2,5 единицы/реакция, Adh1_up3 пкмоль/реакция, Adh1_low3 пкмоль/реакция, Adh1_Pr_up_R6G4 пкмоль/реакция, H2O до 25 мкл.

Для подтверждения специфичности праймеров и зонда были использованы образцы ДНК, выделенные из сертифицированных референсных стандартов: соя GTS40-3-2, А5547-127 и MON89788, BPS-CV127-9, MON 87701, кукуруза MON810, GA21, NK603, MON863, MON88017, Т-25, Bt11, MIR604, 3272, MIR162 ,3272, MON89034, рис LLRICE62, рапс GT73 , сахарная свекла H7-1 и ДНК из негенномодифицированных растений кукурузы, сои, гречихи, офса, гороха, свеклы и риса, а также ДНК свиньи, барана, мыши, курицы и семги. Положительный результат был получен только для образца ДНК из кукурузы линии MON810, что демонстрируют 100% специфичность выбранных праймеров и зонда на исследованной выборке образцов.