Введение к работе
Актуальность темы: Микробные полинуклеотиды в виде денатурированных РНК и ДКК низких и средних молекулярных масс являются перспективными источниками сырья для производства нуклеозидов и 5'- мо-нонуклестидов, составляющих основу в синтезе современных лекарственных средств, применяемых в лечении широкого круга заболеваний. Интерес к производству данной группы препаратов не только не ослабевает, но и в последнее время значительно растет в связи с угрозой иммунодифицита и с необходимостью создания,прежде всего, высокоэффективных противовирусных средств.
Преимущество микробных РНК и ДНК перед другими источниками сырья состоит в том, что их гидролиз приводит к образованию 4-х основных нуклеозидов или 5'- мононуклеотидов, которые в дальнейшем разделяют и получает очищенные кристалические препараты, используемые в синтезе лекарственных форм. Конкурентноспособность данного способа производства в сравнении с традиционным химическим синтезом зависит, прежде всего, от себестоимости получаемых пслинуклеотидрв, которая напрямую связана со стоимостью микробиологического сырья. Это, в свое время, привело к развитию двух подходов в создании технологий микробных полинуклеотидоз. Первый из них основывается на гидролизе нуклеопротеинов, извлеченных из микробных клеток, до нуклеозидов в среде с формамидом, а второй - на предварительной глубокой очистке нуклеопротеинов от белковых примесей с последующим гидролизом полученных полинуклестидов в водном растворе.В том и другом случае образующиеся нуклеозиды разделяют ионным обменом, причем для первого варианта объем стоков с колонн оказывается на порядок выше, чем во втором.
Учитывая зарубежный опыт организации такого производства в промышленно-развитых странах, потенциальными производителями микробных полинуклеотидов и продуктов их гидролиза должны быть биохим-заЕоды, выпускающие в значительных объемах микробную биомассу в виде дрожжей или бактерий, клетки которых содержат наибольшее количество нуклеиновых кислот. В России такими заводами являются предприятия - производители кормового белка. Сегодня они могут выпускать практически только кормовой белок - один вид продукции с высокой себестоимостью из-за высоких цен на сырье и энергию. Это ставит задачу их частичного, по крайней мере, перепрофилирования на выпуск нового вида продукции, полинуклеотидов и продуктов их гидролиза. При этом необходимо учитывать особенности существующего производства кормового белка, построенного на переработке больших объемов водных суспензий и солевых растворов и не использующего, кроме как субстрата, органические вещества.
Целью настоящей работы явилось разработка научных основ технологии препаратов полинуклеотидов (РНК и концентрата ДНК), свободных от белковой примеси из клеток бактерий Methylococcus capsulatus -продуцента кормового белка, выращиваемого на природном газе - и
проверка результатов работы в условиях опытного производства.
В задачу работы входило 1) Разработать основные стадии процесса получения очищенных полинуклеотидов, исключающие применение органических растворителей и фенолсодержащих растворов для предварительной обработки клеток бактерий и ферментов в очистке полинуклеотидов от белковой примеси.
-
Изучить количественные закономерности этих стадий и на основе полученных данных построить математические модели, обеспечивающие проведение технологического процесса в оптимальных условиях.
-
Создать нормативно-техническую документацию на организацию опытного производства.
Научная новизна. Впервые показана возможность получения препаратов полинуклеотидов (РНК и ДНК) из клеток бактерий без применения органических растворителей и технических ферментов.
Впервые на примере бактерий проведено количественное изучение и дано описание процессов экстракции нуклеопротеинов, центрифугирования суспензии денуклеинизированных клеток, концентрирования бесклеточных растворов нуклеопротеинов ультрафильтрацией, их осаодения в изоэлектрической точке из водных растворов и очистки от белков в водно-солевом растворе моноаммонийфосфата.
Практическая значимость. Разработана технология препарата РНК из бактерий, не уступающего по качеству дрожжевой РНК, и концентрата ДНК, свободного от белковой примеси, которые можно использовать для последующего гидролиза в нуклеозиды или в 5'-мононуклеотиды. На основе разработанных математических моделей предложены алгоритмы управления основными технологическими стадиями.
Апробация работы: отдельные материалы работы были представлены на конференциях - 1. "Химия и технология лекарственных средств" (СПб. 28-30 июня 1994 г.).
Публикации: По материалам работы опубликовано 2 статьи и подана одна авторская заявка на патент РФ " Способ получения нуклеиновых кислот из бактерий."
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, об
зора литературы, материалов и методов, изложения экспериментальных
результатов и их обсуждения, заключения, выводов и приложений. Ра
бота изложена на стр. машинописного текста, проиллюстрирова
на таблицами и рисунками. Библиография включает наи
менований работ, из них на иностранных языках.