РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ МЕТАНОЛА Венков Дмитрий Александрович

Содержание к диссертации

Введение

1 Обзор литературы 10

1.1 Использование метанола в газовой промышленности 10

1.2 Свойства метанола 20

1.3 Метилотрофия 26

1.4 Специализированные биопрепараты 46

2 Материалы и методы исследования 56

2.1 Микроорганизмы 56

2.2 Плотные и жидкие питательные среды 58

2.3 Приготовление рабочей культуры 60

2.4 Экспериментальные животные 61

2.5 Материалы, растворы, реактивы 62

2.6 Технологическое оборудование 62

2.7 Методы исследований 63

3 Результаты экспериментов и обсуждение 70

3.1 Выбор штаммов микроорганизмов и компонентов биопрепарата 70

3.1.1 Выбор штаммов микроорганизмов 70

3.1.2 Выбор компонентов биопрепарата

3.2 Конструирование биопрепарата 77

3.3 Эколого-биологические исследования

3.3.1 Токсикологические исследования и установление класса опасности биопрепарата 90

3.3.2 Биотестирование на гибробионтах

3.4 Вариант аппаратурно-технологической линии получения биопрепарата методом контактно-сорбционного обезвоживания на глауконите .

3.5 Разработка технических условий на биопрепарат «БИОМ-М» и технологического регламента на промышленный выпуск биопрепарата

3.6 Разработка технологического регламента применения биопрепарата в полевых условиях

3.7 Полевой опыт по очистке от метанола загрязненной местности газодобычи 111

4.Заключение 125

5. Выводы

• Свойства метанола
• Экспериментальные животные
• Выбор компонентов биопрепарата
• Вариант аппаратурно-технологической линии получения биопрепарата методом контактно-сорбционного обезвоживания на глауконите

Введение к работе

Актуальность темы. Одним из важнейших условий развития страны и повышения качества жизни населения является функционирование и развитие экономически эффективного, соответствующего экологическим требованиям топливно энергетического комплекса. По данным Министерства энергетики Российской Федерации добыча природного и попутного нефтяного газа составило 640,2 млрд куб. м в 2016 г., что выше уровня 2015 г. на 0,7 %. В технологических процессах добычи, подготовки и транспорта газа, в качестве ингибитора гидратообразования, широко применяют метанол. Однако использование метанола представляет серьезную проблему с точки зрения его высокой токсичности и приводит к возникновению геоэкологических рисков, связанных со сбросами и выбросами метанола в окружающую среду, увеличивающихся с ростом потребления метанола. Существующие физические, химические и технологические методы очистки не только дороги и недостаточно эффективны, но и могут наносить дополнительный вред окружающей среде. Поэтому необходимость разработки и применения новых, эффективных, недорогих и экологически безвредных методов очистки от метанола очевидна. Показано, что биоремедиация имеет огромный потенциал и конкурентные преимущества, прежде всего, вследствие экологической безопасности и низкой стоимости (Грунвальд А.В., 2007, Wang et al., 2011).

Методы биоремедиации основаны на использовании метилотрофных бактерий для очистки загрязненной окружающей среды (Мурзаков Б.Г.и др., 2006). Задачей, решаемой авторами являлось создание универсального и эффективного биопрепарата-метанолдеструктора.

Технической задачей являлось создание композиции микроорганизмов, способных не только перерабатывать метанол, но и сопутствующие нефтепродукты (газовый конденсат), и одновременно облагораживать обработанную среду.

Степень разработанности.

Все известные технологии утилизации метанола сопряжены с большими экономическими затратами и угрозой загрязнения окружающей среды. В связи с этим, разработка, создание и применение новых экономичных и экологичных приёмов и методов выделения метанола из биотехнологической среды являются одной из важных задач промышленной биотехнологии. Очевидно, что актуальной проблемой для совершенствования технологии очистки загрязненных метанолом территорий является использование микроорганизмов, способных не только перерабатывать метанол, но и сопутствующие нефтепродукты (газовый конденсат).

Цель работы. Целью настоящего исследования являлась разработка технологии получения бактериального биопрепарата для очистки окружающей среды от метанола.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- научно обосновать и разработать технологию получения биопрепарата
«БИОМ-М»;

разработать технологическую схему получения биопрепарата «БИОМ-М»;

провести доклинические и эколого-биологические исследования;

определить критические концентрации метанола в воде и почве, позволяющих использовать биопрепарат;

- оценить возможность применения биопрепарата в средах с повышенным
содержанием соли;

- провести полевой опыт по очистке от метанола загрязненной местности;

- разработать и утвердить нормативно-техническую документацию на
производство препарата «БИОМ-М».

Научная новизна. Впервые на основании консорциума бактерий

иммобилизованных на природном глауконите разработан биопрепарат «БИОМ-М», предназначенный для очистки загрязненной метанолом (до 100 см³/дм³) в присутствии соли (до 100 г/кг) почвы, воды и технологических конструкций хранения и переработки метанола с одновременным восстановлением физико-химических свойств и естественного биоценоза почв и акваторий.

Научная новизна работы подтверждена положительным решением о выдаче патента на изобретение «Препарат для утилизации метанола «БИОМ-М» и способ его получения».

Теоретическая и практическая значимость работы. Практическая значимость работы заключается в том, что разработанный биопрепарат «БИОМ-М» позволяет эффективно проводить биоремедиацию территорий, загрязненных метанолом.

Создана технология КСО, позволяющая получать сухой биопрепарат, предназначенный для очистки загрязненной метанолом почвы и воды.

В практику экологической очистки территорий от метанола введен

биопрепарат «БИОМ-М», получен Сертификат соответствия на его серийный выпуск, Экологический сертификат для применения.

Разработаны технические условия, промышленный регламент и

технологический регламент применения биопрепарата «БИОМ-М».

Методология и методы диссертационного исследования. Методология
включает стандартные для данной области знаний процедуры с использованием
различных материалов и естественно-восприимчивых животных.

Экспериментальные исследования осуществляли в лаборатории ЗАО «Альфахимпром», на базе кафедры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина, на базе ООО «Синбионт» г. Киров, ФГУП «ВНИИПРХ» Московская область, п. Рыбное и на территории газодобывающей компании, расположенной в Ямало-Ненецком автономном округе.

Объектами исследования служили разработанный биопрепарат «БИОМ-М» на основе штаммов: Acinetobacter calcoaceticus 134, Methylobacterium sp. IK и Bacillus megaterium. Глауконит из Каринского месторождения Челябинской области.

Микроорганизмы: Штаммы были получены из коллекции штаммов Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ Генетика.

Плотные и жидкие питательные среды: плотная питательная среда Ворошиловой - Диановой с добавлением метанола (пропись1), плотная питательная среда FT–агар (пропись 2), жидкая питательная тиогликолевая среда (пропись3), жидкая минимальная минеральная среда Ворошиловой - Диановой с добавлением метанола (пропись 4), жидкая защитная среда (пропись 5).

Доклинические испытания проводились на:

мыши белые беспородные массой 18-24 г;

мыши линии СВА массой 18-24 г., возраст 8-9 недель;

крысы белые беспородные массой 140-160 г, возраст 13-14 недель;

золотые рыбки;

гольян;

дафнии после четвертой стадии развития.

Технологическое оборудование: Культивирование штаммов проводили во флаконах (объемом 0,1 дм³) на качалках New Brunswick (США, модель G-53) в ферментерах марки «БИОР-0,25», оптическую плотность нативных культур определяли с помощью колориметра фотоэлектрического концентрационного КФК-2МП, а рН - иономером типа ЭВ-74. Просеивание глауконита осуществляли на вибросите ВС-100 с диаметром отверстий сетки - 1 мм, прокаливание глауконита осуществляли в сухожаровом шкафу ШСС-250 при температуре (200±15)С. Для иммобилизации смеси культур на глауконите применяли установку гранулирования и сушки типа 524Р-АК. Смешение с аэросилом проводили в барабанном смесителе с 1-2 кг стальных шаров

диаметром от 6 до 14 мм. Готовый биопрепарат рассыпали в двойные пакетики из ламинированной бумаги на автомате типа АР – И 3.

Основные положения, выносимые на защиту:

- технология получения биопрепарата для очистки окружающей среды от
метанола с применением глауконита «БИОМ-М»;

- критические концентрации метанола в воде и почве, позволяющие
использовать биопрепарат;

- возможность применения биопрепарата «БИОМ-М» в средах с повышенным
содержанием соли;

- результаты полевого опыта по очистке от метанола загрязненной местности с
использованием разработанного биопрепарата «БИОМ-М».

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты работы докладывались и вошли в ежегодные отчеты ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА им. К.И. Скрябина. Материалы диссертационного исследования изложены в докладе на XXV международной конференция «Развитие науки в XXI веке». Разработанный препарат «БИОМ-М» прошел полевые испытания на территории газодобывающей компании, расположенной в Пуровском районе Ямало-Ненецкого автономного округа, показав высокую эффективность очистки местности от метанола.

Получены Сертификат соответствия, Экологический сертификат и Экспертное Заключение о соответствии требованиям «Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)», утвержденным решением Комиссии таможенного союза № 299 от 28.05. 2010 г. гл. II. разд. 15.

Достоверность выводов основывается на значительном объеме полученных соискателем экспериментальных данных. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили общепринятым методом (Лакин Г.Ф., Биометрия, 1990 г.). Расчеты и построение технологических таблиц и схем осуществляли с помощью программы «Microsoft Office Excel 2010», входящей в пакет программ «Microsoft Office 2010».

Соответствие диссертации паспорту специальности. Выполненная

диссертационная работа соответствует пунктам 1, 2, 3, 4, 5, 7 и 8 паспорта специальности 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работы, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах из списка ВАК, а также 1 статья в сборнике докладов научных конференций. Получено положительное решение Российского агентства по патентам и товарным знакам.

Объем и структура диссертации. Диссертация представлена на 164 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, список сокращений и условных обозначений, список литературы и приложения. Работа содержит 22 рисунка и 32 таблицы. Список литературы включает 131 источник, из которых 55 отечественных и 76 зарубежных авторов.

Личный вклад автора заключается в формулировании и разработке основных положений диссертации, постановке цели и задач исследований методологическом обосновании путей решения поставленных задач, планировании экспериментов и непосредственном выполнении исследований, анализе и обобщении полученных результатов, проведенных лично автором и их оформлении в виде научных публикаций и нормативно-технической документации.

Благодарности. Автор выражает благодарность директору ФГБНУ ВНИТИБП, академику РАН А. Я. Самуйленко; доктору биологических наук, профессору М.Ю. Волкову, кандидату биологических наук Г.В. Комоско и доктору медицинских наук С.М. Кузнецову.

Свойства метанола

Общие требования Инструкции, предъявляемые к безопасности применения метанола на различных объектах газовой промышленности, заключаются в следующем.

На объектах газовой промышленности разрешается использовать метанол только как средство предотвращения или разрушения кристаллогидратных пробок в аппаратах, приборах и газопроводах, а также для обработки призабойных зон газовых скважин.

Порядок применения метанола на технологические нужды определяется в соответствии с утвержденными проектами обустройства газовых месторождений, «Правилами технической эксплуатации магистральных газопроводов» и «Правилами безопасности в нефтегазодобывающей промышленности».

Ответственность за обеспечение необходимых условий для правильной организации работ с метанолом и контроль за соблюдением настоящей Инструкции возлагается на руководителей предприятий.

Руководители объединений и управлений обязаны специальным приказом определить предприятия, в которых разрешается создание базовых складов метанола, а также обеспечить места и условия его содержания на производственных объектах.

Существующая сегодня транспортная схема обеспечения метанолом добывающих предприятий ОАО «Газпром» и независимых недропользователей в Надым-Пур-Тазовском регионе достаточно сложна и включает в себя несколько этапов: – залив метанола в специализированные железнодорожные цистерны на заводе-изготовителе; – транспортировка метанола по железной дороге до железнодорожной станции назначения (Коротчаево); – транспортировка метанола в железнодорожных цистернах на базу ООО «Газкомплектимпекс»; – перелив метанола на терминале базы ООО «Газкомплектимпекс» из железнодорожных цистерн в стационарные емкости для хранения; – возврат порожних специализированных железнодорожных цистерн на завод-изготовитель метанола; – подготовка метанола к его использованию на объектах добычи природного газа (добавление к метанолу чернил или одоранта); – перелив метанола из стационарной емкости в специализированную, автомобильную цистерну; – транспортировка метанола автотранспортом до базы метанола на газодобывающем предприятии; – перелив метанола из специализированной автомобильной цистерны в стационарную специальную емкость на базе метанола газодобывающего предприятия; – возврат порожних специализированных автомобильных цистерн на базу ООО «Газкомплектимпекс»; – перелив из стационарной емкости на базе метанола газодобывающего предприятия в автоцистерны и развоз метанола на конкретные объекты потребления. Однако анализ этой схемы показывает следующие недостатки: – очень большое количество операций с метанолом в ходе одной поставки. Каждая операция – потенциальный риск срыва всей поставки и возможной транспортной аварии и, соответственно, розлива метанола и загрязнения окружающей среды; – при транспортировке метанола как железнодорожным, так и автомобильным транспортом требуется соблюдение особых мер безопасности, которые предусмотрены в соответствующих нормативных документах, регламентирующих транспортировку метанола; – наличие промежуточного склада хранения требует соблюдения специальных мер, которые предусмотрены в соответствующих нормативных документах, регламентирующих хранение метанола; – многочисленные операции по сливу – наливу метанола увеличивают риск загрязнения окружающей среды и отравления обслуживающего персонала; – перевозка метанола автотранспортом на большие расстояния в условиях Крайнего Севера требует наличия достаточно качественной и разветвленной сети автомобильных дорог, отсутствие или недостаточное качество которых может вести к автомобильным авариям, розливу метанола и загрязнению окружающей среды.

Высокая токсичность метанола и его пожароопасность обуславливают необходимость строгого соблюдения требований техники безопасности, что практически сводит к минимуму возможность отравлений метанолом подготовленного технического персонала. Тем не менее, всегда существует вероятность аварии на любом этапе применения метанола в качестве ингибитора гидратообразования на том или ином объекте газовой промышленности и, как следствие, розливов метанола, загрязнения окружающей среды и отравления персонала. Тем более вероятность аварии увеличивается с ростом потребления метанола в качестве ингибитора гидратообразования.

С учетом роста в ближайшей перспективе доли валанжинского газа в общем объеме добываемого природного газа, а также повышенного расхода метанола при предотвращении гидратообразования на установках НТС, используемых для подготовки валанжинского газа, вопрос расходных показателей метанола становится актуальным.

В настоящее время основная добыча газа (более 90 %) на северных месторождениях России осуществляется за счет разработки чисто газовых залежей – главным образом сеноманского продуктивного горизонта. Достаточно упомянуть только такие уникальные месторождения-супергиганты, как Медвежье, Уренгойское и Ямбургское. В стадии проектирования и разработки находится ряд крупных чисто газовых месторождений Западной Сибири и п-ова Ямал, намеченных к освоению уже в ближайшие годы. Основные требования к качеству товарного природного газа, транспортируемого по магистральным газопроводам, регламентируются ОСТом 51.40-93 «Газы горючие природные, поставляемые и транспортируемые по магистральным газопроводам. Технические условия».

Для предотвращения образования гидратов используется метанол - по существу, предотвращение гидратообразования является одним из элементов подготовки газа к транспорту. При этом, чем ниже температура реализации технологических процессов добычи, сбора и промысловой подготовки газа, тем выше вероятность образования гидратов и тем больше ингибиторов, а именно метанола, требуется для предотвращения процесса выпадения гидратов [4,5,12,55].

С точки зрения гидратообразования рассмотренные выше технологии подготовки газа к транспорту неравнозначны. При прочих равных условиях детандерные технологии обеспечивают подготовку газа при более низких температурах по сравнению с другими рассмотренными выше технологиями. Поэтому для реализации и поддержания процесса подготовки газа по детандерной технологии требуются более высокие расходы метанола.

В зависимости от используемой технологии подготовки природного газа к транспорту, а также от состава добываемого природного газа, расходные показатели потребления метанола в качестве ингибитора гидратообразования также различаются.

Исходя из опыта эксплуатации различных установок подготовки газа, можно принять следующие расходные показатели потребления метанола: – сеноманский газ – адсорбционная или абсорбционная осушка, средние удельные показатели потребления метанола составляют 30–50 г/1000 м3 обрабатываемого газа; – сеноманский газ – низкотемпературная сепарация с детандер-компрессорным агрегатом «среднего давления», средние удельные показатели потребления метанола составляют 400–1200 г/1000 м3 обрабатываемого газа; – валанжинский газ – низкотемпературная сепарация, средние удельные показатели потребления метанола составляют 1500–1800 г/1000 м3 обрабатываемого газа; – валанжинский газ – низкотемпературная сепарация с турбодетандерным агрегатом при температуре минус 70 С, средние удельные показатели потребления метанола составляют 2000–2500 г/1000 м3 обрабатываемого газа. [11]. Прогноз потребления метанола в газовой промышленности Российской Федерации и в Западной Сибири (Надым-Пур-Тазовский регион и п-ов Ямал) на перспективу до 2030 г.

Экспериментальные животные

При приеме в дозах 100 и 5000 мг/кг «БИОМ-М» острой токсичностью не обладает: не вызывает каких-либо видимых изменений в общем состоянии животных и не вызывает их гибели.

Изучение токсических свойств «БИОМ-М» на лабораторных животных не позволило установить их основные токсические характеристики: средне смертельную дозу (LD50) и дозу, вызывающую появление клинической картины токсикоза. В течение периода наблюдений установлено, что введение «БИОМ-М» в диапазоне доз от 1 до 5000 мг/кг массы тела не вызвало гибели и острой интоксикации животных, не влияло отрицательно на их общее состояние и поведение. Рефлексы оставались сохраненными. При этом нарушения функциональной активности органов пищеварения и мочеотделения не наблюдалось. Определение класса опасности Результаты изучения острой токсичности оценивают по 4 классам опасности согласно классификации по ГОСТ 12.1.007-76 для внутрижелудочного введения. Установлено, что «БИОМ-М» относится к 4 классу опасности – вещества малоопасные.

Исследование воздействия биопрепарата «БИОМ-М», предназначенного для очистки водоемов и почвы от метанольных загрязнений, на гидробионтах проведено с использованием нескольких методов, позволяющих оценивать изменения в поведении, состоянии хемосенсорных систем и репродукции подопытных животных. Выбор перечисленных методов обусловлен их высокой чувствительностью и возможностью адекватной интерпретации получаемых результатов для оценки воздействия на организмы и сообщества различных внешний факторов естественного и искусственного происхождения. Поведенческие критерии являются тонкими высокоразрешающими индикаторами состояния животных и условий их существования. Критерии, основанные на поведенческих тест-реакциях, являются одними из наиболее чувствительных методов обнаружения и оценки степени влияния на рыб различных внешних воздействий. Регистрация двигательной активности позволяет зарегистрировать влияние на животных многих слабых факторов, воздействие которые не обнаруживается другими методами. Для многих рыб характерен высокий уровень двигательной активности, поддерживаемый неизменным в течение длительного времени. Плавательная способность рыб рассматривается как основной критерий их жизнестойкости.

Пищевое поведение – сложно организованная форма, включающая ряд последовательных фаз и этапов от поиска и обнаружения добычи животным до ее схватывания, внутриротовой обработки, оценки пищевой пригодности и принятия решения о заглатывании или отвергании. У рыб в сенсорном обеспечении пищевого поведения принимают участие все без исключения органы чувств. Многокомпонентность этологической структуры пищевого поведения, мультисенсорность и лабильность делают рыб весьма уязвимыми к действию химических загрязнителей водной среды. Многие из этих агентов могут оказывать либо прямое повреждающее воздействие на центральную нервную систему рыб, координирующую поведение, либо нарушать функцию сенсорных систем, обеспечивающих получение и переработку биологической информации. Вызванные таким путем изменения в пищевом поведении, в свою очередь, неизбежно приведут к нарушениям в питании рыб, негативно отразятся на их росте, репродукции, выживании, численности и многих других индивидуальных и популяционных характеристиках, изменят сложившиеся трофические связи в сообществе.

Среди сенсорных систем особое место занимают так называемые экстерохеморецепторные системы, обонятельная и вкусовая, рецепторные структуры которых непосредственно открыты в окружающую среду и могут испытывать прямое негативное воздействие попадающих в воду загрязняющих и иных агентов. Исследованиями последних лет показано, что функциональные и структурные нарушения обонятельной и вкусовой чувствительности рыб возникают даже после относительно непродолжительной по времени экспозиции их в крайне низких концентрациях различных загрязняющих веществ. Обонятельная система участвует в регуляции всех форм поведения рыб. Вкусовая рецепция является по существу единственной системой, ответственной за селективный выбор и потребление адекватных кормовых организмов. Поэтому оценка состояния этих систем у рыб, их способность воспринимать запаховые и вкусовые раздражители и проявлять в ответ на их действие адекватные поведенческие реакции представлялась важной и необходимой.

Было оценено также влияние биопрепарата «БИОМ-М» на репродуктивный потенциал гидробионтов, их воспроизводительную способность – интегральный показатель не только состояния отдельных особей, но и популяции в целом.

При выборе объектов для выполнения настоящей работы приоритет был отдан наиболее массовым и широко распространенным видам, являющимся обычными обитателями многих отечественных пресноводных водоемов (см. табл. 20). Задачи исследования: – оценка двигательной активности (тестирование по методу "открытое поле"); – оценка проявления поведенческой поисковой реакции на естественные пищевые химические сигналы; – оценка отношения рыб к вкусовым раздражителям и проявления поведенческого вкусового ответа; – оценка воспроизводительной способности дафний и моллюсков. Исследования по оценке влияния биопрепарата «БИОМ-М» на рыб и других гидробионтов выполнены на базе отдела экологической безопасности ФГУП «ВНИИПРХ». Объект исследования – Биопрепарат «БИОМ-М», серия – 180516, дата производства – 18.05.2016, срок годности – 18.05.2018.

Эксперименты по оценке влияния биопрепарата «БИОМ-М» проведены на молоди золотой рыбки, Carassius auratus (тест «открытое поле» для оценки двигательной активности), на половозрелых гольянах, Phoxinus phoxinus (оценка вкусовых предпочтений и вкусового поведения рыб), на молоди данио-рерио, Danio rerio (оценка способности рыб реагировать на пищевые запахи), см. рис. 4– 6.

Выбор компонентов биопрепарата

Биосинтез кормового белка. Промышленные процессы с использованием метилотрофных бактерий были созданы с целью получения больших количеств белка одноклеточных (SCP) для питания людей и животных. Масштабное промышленное производство кормового белка (гаприна) из природного газа с использованием термотолерантного штамма Мс. capsulatus 874 было реализовано в СССР в середине 1980-х гг.

Экзополисахариды (ЭПС). Многие метанотрофы родов Methylomonas, Methylococcus и Methylomiсrobium, а также метилобактерии родов Methylobacillus, Methylophilus, Methylophaga и Xanthobacter, реализующие РМФ- или РБФ-пути C1-метаболизма, синтезируют ЭПС из метана или метанола, причем выход ЭПС можно регулировать факторами среды и условиями культивирования [47,56]. Цитохромы, Пигменты (каротиноиды, меланин). Метилобактерии синтезируют пигменты, наиболее обычными из которых являются каротиноиды, придающие культурам розовый цвет. Термофильные метанотрофы рода Methylocaldum образуют меланиновый пигмент при понижении температуры культивирования до 42С. В случае необходимости синтез этих пигментов можно интенсифицировать, варьируя дозы физико-химических факторов (pH, температуру, рО2). Метилотрофы как биокаталитические агенты. Из многочисленных примеров практической реализации биокаталитической активности аэробных метилотрофов приведем лишь несколько наиболее значимых. Прежде всего, это использование замечательного свойства растворимой ММО окислять широкий спектр алифатических и ароматических замещенных производных метана, n-алканов и терминальных алкенов [57,62,116,131].

На основе известных метаболических путей рассчитана эффективность превращения углерода для различных продуктов у ряда микроорганизмов, растущих на метаноле или глюкозе. Для ЭПС, ПГБ и глутамата расчеты эффективности преобразования энергии свидетельствуют о том, что биопроцессы на основе метанола могут быть экономически конкурентоспособны с процессами на сахарах. Однако большую потребность метилотрофов в кислороде можно считать недостатком, хотя в случае глутамата расчетный расход кислорода у бактерий, растущих на метаноле, в 2-3 раза ниже, чем на глюкозе. Сопоставление конверсии метанола в РМФ- или сериновом цикле показывает расчетный выход в 0,76 г/г и 0,92 г/г, соответственно, в то время как теоретический выход синтеза глутамата у микроорганизмов, растущих на глюкозе – 0,82 г/г. Теоретические выходы конверсии метанола в лизин через формальдегид и формиат у В.methanolicus составили 0,82 и 0,71, соответственно, что сравнимо с показателем для С. glutamicum, использующим глюкозу.

Несмотря на быстрое накопление биохимических и генетических знаний, пока известно не много примеров разработанных технологий биопроцессов на метилотрофах. Причина заключается в том, что технология биопроцессов на метаноле не обеспечена ферментерами особого типа и периферийным оборудованием. Тем не менее ряд важных различий касается питательных сред и физиологии метилотрофов, что имеет последствия для дизайна биопроцессов, в особенности, если целью является производство химических веществ в большом объеме.

Во-первых, это обусловленные использованием простых минеральных сред экономичность и значительное уменьшение сферы образуемых внеклеточных продуктов. Кроме того, устраняются различия в биопроцессах из-за незначительных изменений в составе исходного сырьевого комплекса. Еще один важный фактор, который необходимо учитывать, – это потенциальная токсичность метанола. Наконец, для культивирования на метаноле характерны высокие потребности в кислороде, приводящие к усилению выделения тепла и, следовательно, к увеличению расходов на охлаждение систем культивирования. Снизить затраты на охлаждение удается, используя термотолерантные метилобактерии В. methanolicus, оптимально растущие при 50С [47].

Работы по оптимизации лабораторных процессов с метилотрофами направлены на получение ПГБ, рекомбинантных белков и особенно аминокислот. Для оптимизации этих процессов исследователи обычно управляют концентрцией метанола посредством анализа выходящих газов чувствительными газовыми датчиками или пламенно-ионизационными детекторами, что способствует повышению плотности клеток и производительности.

Для синтеза специфических продуктов разработаны специальные методы культивирования с целью повышения уровня целевого продукта. Например, общая стратегия синтеза ПГБ – это двухстадийный процесс, разделенный на фазу наращивания биомассы и фазу накопления биополимера; последняя индуцируется лимитированием по азоту. С помощью этой стратегии были достигнуты высокие уровни биомассы (130 г/л) и ПГБ (до 60%).

Биодеградация токсичных соединений. Перспективность аэробных метилотрофов в биотехнологии обусловлена не только способностью синтезировать различные полезные продукты, довольствуясь минимальными, в сравнении с гетеротрофами, питательными потребностями, но и разлагать широкий спектр токсичных соединений. Природа конечных продуктов биодеградации важна для экологии произ водства. Аэробные метилотрофы способны утилизировать вещества наиболее полно и без нежелательных побочных продуктов. Существенное значение имеют условия наработки биомассы для сорбции в биореакторе на носителе. Метилотрофы хорошо растут на простых минеральных средах, активно атакуют поллютанты. Иммобилизованные клетки метилотрофов обеспечивают полную конверсию ряда токсичных соединений в проточных условиях, что открывает перспективы их широкого использования для целей биодеградации и биоремедиации.

Вариант аппаратурно-технологической линии получения биопрепарата методом контактно-сорбционного обезвоживания на глауконите

При приеме в дозах 100 и 5000 мг/кг «БИОМ-М» острой токсичностью не обладает: не вызывает каких-либо видимых изменений в общем состоянии животных и не вызывает их гибели.

Изучение токсических свойств «БИОМ-М» на лабораторных животных не позволило установить их основные токсические характеристики: средне смертельную дозу (LD50) и дозу, вызывающую появление клинической картины токсикоза. В течение периода наблюдений установлено, что введение «БИОМ-М» в диапазоне доз от 1 до 5000 мг/кг массы тела не вызвало гибели и острой интоксикации животных, не влияло отрицательно на их общее состояние и поведение. Рефлексы оставались сохраненными. При этом нарушения функциональной активности органов пищеварения и мочеотделения не наблюдалось. Определение класса опасности Результаты изучения острой токсичности оценивают по 4 классам опасности согласно классификации по ГОСТ 12.1.007-76 для внутрижелудочного введения. Установлено, что «БИОМ-М» относится к 4 классу опасности – вещества малоопасные.

Исследование воздействия биопрепарата «БИОМ-М», предназначенного для очистки водоемов и почвы от метанольных загрязнений, на гидробионтах проведено с использованием нескольких методов, позволяющих оценивать изменения в поведении, состоянии хемосенсорных систем и репродукции подопытных животных. Выбор перечисленных методов обусловлен их высокой чувствительностью и возможностью адекватной интерпретации получаемых результатов для оценки воздействия на организмы и сообщества различных внешний факторов естественного и искусственного происхождения. Поведенческие критерии являются тонкими высокоразрешающими индикаторами состояния животных и условий их существования. Критерии, основанные на поведенческих тест-реакциях, являются одними из наиболее чувствительных методов обнаружения и оценки степени влияния на рыб различных внешних воздействий. Регистрация двигательной активности позволяет зарегистрировать влияние на животных многих слабых факторов, воздействие которые не обнаруживается другими методами. Для многих рыб характерен высокий уровень двигательной активности, поддерживаемый неизменным в течение длительного времени. Плавательная способность рыб рассматривается как основной критерий их жизнестойкости.

Пищевое поведение – сложно организованная форма, включающая ряд последовательных фаз и этапов от поиска и обнаружения добычи животным до ее схватывания, внутриротовой обработки, оценки пищевой пригодности и принятия решения о заглатывании или отвергании. У рыб в сенсорном обеспечении пищевого поведения принимают участие все без исключения органы чувств. Многокомпонентность этологической структуры пищевого поведения, мультисенсорность и лабильность делают рыб весьма уязвимыми к действию химических загрязнителей водной среды. Многие из этих агентов могут оказывать либо прямое повреждающее воздействие на центральную нервную систему рыб, координирующую поведение, либо нарушать функцию сенсорных систем, обеспечивающих получение и переработку биологической информации. Вызванные таким путем изменения в пищевом поведении, в свою очередь, неизбежно приведут к нарушениям в питании рыб, негативно отразятся на их росте, репродукции, выживании, численности и многих других индивидуальных и популяционных характеристиках, изменят сложившиеся трофические связи в сообществе.

Среди сенсорных систем особое место занимают так называемые экстерохеморецепторные системы, обонятельная и вкусовая, рецепторные структуры которых непосредственно открыты в окружающую среду и могут испытывать прямое негативное воздействие попадающих в воду загрязняющих и иных агентов. Исследованиями последних лет показано, что функциональные и структурные нарушения обонятельной и вкусовой чувствительности рыб возникают даже после относительно непродолжительной по времени экспозиции их в крайне низких концентрациях различных загрязняющих веществ. Обонятельная система участвует в регуляции всех форм поведения рыб. Вкусовая рецепция является по существу единственной системой, ответственной за селективный выбор и потребление адекватных кормовых организмов. Поэтому оценка состояния этих систем у рыб, их способность воспринимать запаховые и вкусовые раздражители и проявлять в ответ на их действие адекватные поведенческие реакции представлялась важной и необходимой.

Было оценено также влияние биопрепарата «БИОМ-М» на репродуктивный потенциал гидробионтов, их воспроизводительную способность – интегральный показатель не только состояния отдельных особей, но и популяции в целом.

При выборе объектов для выполнения настоящей работы приоритет был отдан наиболее массовым и широко распространенным видам, являющимся обычными обитателями многих отечественных пресноводных водоемов (см. табл. 20). Задачи исследования: – оценка двигательной активности (тестирование по методу "открытое поле"); – оценка проявления поведенческой поисковой реакции на естественные пищевые химические сигналы; – оценка отношения рыб к вкусовым раздражителям и проявления поведенческого вкусового ответа; – оценка воспроизводительной способности дафний и моллюсков. Исследования по оценке влияния биопрепарата «БИОМ-М» на рыб и других гидробионтов выполнены на базе отдела экологической безопасности ФГУП «ВНИИПРХ». Объект исследования – Биопрепарат «БИОМ-М», серия – 180516, дата производства – 18.05.2016, срок годности – 18.05.2018. Эксперименты по оценке влияния биопрепарата «БИОМ-М» проведены на молоди золотой рыбки, Carassius auratus (тест «открытое поле» для оценки двигательной активности), на половозрелых гольянах, Phoxinus phoxinus (оценка вкусовых предпочтений и вкусового поведения рыб), на молоди данио-рерио, Danio rerio (оценка способности рыб реагировать на пищевые запахи), см. рис. 4– 6.