Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы. Во второй половине XX столетия в нашей стране активизировались научные изыскания по получению новых иммунобиологических препаратов, разрабатывались качественно новые вакцины, сыворотки, диагностические и лечебные препараты. Быстро увеличивалось поголовье продуктивных животных, происходила концентрация их в сельско-хозяйственных комплексах: Численность крупного рогатого скота в 1965-75 гг. выросла на 25 млн. голов. Особенно актуально стояла проблема нераспространения таких высококонтагиозных инфекционных болезней как ящур, бруцеллез, лептоспироз, пастереллез, чума и многие другие. Так, эпизоотия ящура в 1964-65 гг. принесла экономический ущерб в сумме, исчисляемой сотнями миллионов рублей. В 1973 г. государство вынуждено было закупить во Франции технологию и оборудование по изготовлению надежных противоящурных препаратов в необходимом объеме. Одновременно с пуском производства вакцин возникла актуальная задача удешевить импортную технологию путем использования отечественных ингредиентов, таких как гидроокись алюминия, компоненты питательных сред, ферменты, инактиванты и др.
Проблемы повышения качества сырья и компонентов, используемых в технологиях изготовления биопрепаратов, а также привлечения нетрадиционных видов сырья решались научными коллективами ВНИТИБП, ВГНКИ, ВНИЯИ и биопредприятиями отрасли на протяжении многих лет. Значительный вклад в решение указанных проблем внесли такие ученые и организаторы производства как И.В. Звягин (1976), А.А. Бойко- (1974, 1979), АЛ. Простяков (1972, 1977), И.А. Хорьков (1978), АЛ. Самуйленко (1976, 1984), Н.И. Передереев (1975,1980) и др.
В получении качественных высокоактивных вакцин, несомненно, очень высока роль адсорбентов-абсорбентов, так как эти компоненты пролонгируют срок годности вакцин, стимулируют иммунный ответ организма, депонируют антигены, обеспечиивая высокий уровень антител в крови. Наиболее приемлемым по этим качествам в вакцинологии оказался гель гидроокиси алюминия (ГОА). Вопросыповышения качества этого сорбента и создания новых, более совершенных технологий его получения, являются актуальными при создании новых и усовершенствовании существующих адсорбат-вакцин.
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ і БИБЛИОТЕКА J
і ————д
Известно применение гидрогеля алюминия как энтеросорбента в медицине. Получение сорбционно-активного и очищенного геля ГОА открывает возможности его применения для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных. Представляет интерес использование для этих целей полисахарида хитозана, полученного из панциря ракообразных. Хитозан обладает сорбционным эффектом, пленкообразующими, противовоспалительными свойствами и био-деградируемостью, что расширяет области его применения в народном хозяйстве и делает актуальным изучение вопросов его получения и использования.
В технологии получения противовирусных прививочных препаратов важную роль выполняет протеолитический ферментный препарат трипсин, используемый для дезинтеграции клеток, в которых культивируется вирус. Для вакцин ветеринарного назначения качественный трипсин приобретался за рубежом, поэтому крайне важно было разработать и наладить выпуск отечественного препарата, способного заменить импортный. Технология получения трипсина из поджелудочной железы жвачных и свиней была разработана в Латвии, где и осуществлялось его производство. Однако в дальнейшем резко сократилась сырьевая база для получения трипсина; и его выпуск прекратился. Поэтому внимание исследователей было обращено на фермент коллагеназу, выделенный дальневосточными исследователями из гепатопанкреаса крабов (Г.Б. Еляков и др., 1986 г., А.А. Артюков и др., 1989 г.).,Полученный ими комплекс протеолитических энзимов, наряду с коллагенолитическим; проявлял трипсиноподобное действие на субстрат, в связи с чем возник повышенный интерес к нему разработчиков и производителей вакцин, лекарственных средств, пищевых гидролизатов.и других продуктов.
Достаточно эффективным является применение в качестве кормовых добавок отходов рыбного промысла, ракообразных, моллюсков и получаемых из них гидролизатов, бульонов, экстрактов (Т.М. Сафронова, 1993). В частности, представляет интерес изучение влияния на рост и развитие молодняка животных препаратов из мидий, выпускаемых в виде кислотных и ферментативных гидролизатов.
1.2. Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка и внедрение в ветеринарную практику и другие отрасли народного хозяйства высакоэффективных сороенгов различного происхождения, а также фер-
ментов и биологически активных веществ, получаемых из гидробионтов, позволяющих повысить качество, снизить себестоимость биопрепаратов различного назначения и расширить область их применения.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
получить новые алюмогели-адсорбенты для противовирусных и проти-вобактериальных вакцин, а также организовать их промышленное изготовление;
разработать физико-химические и биологические тесты для определения адсорбционной активности гелей ГОА по отношению к вирусным и бактерийным антигенам;
изучить условия взаимодействия ящурных антигенов с гидрогелями ГОА, полученными по различным оригинальным методикам, оптимизировать технологию приготовления противоящурных вакцин;
получить высокодисперсный сорбент с повышенным содержанием сухих веществ, обеспечивающий полную сорбцию антигенов вируса ягцура в одну фазу культивирования;
разработать и внедрить в производство технические средства для ускоренной очистки гидроокиси алюминия от примесей с целью стандартизации и удешевления готового продукта;
выяснить эффективность использования высокоочищенного геля ГОА при лечении желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных;
разработать методы получения водорастворимых форм хитозана и промышленные технологии их производства для применения в различных областях народного хозяйства;
определить эффективность хитозана и его производных при необходимости выведения из организма животных радионуклидов, тяжелых металлов и токсинов;
установить режимы применения гелевых форм хитозана для энтеросорб-ции при желудочно-кишечных заболеваниях телят и поросят с симптомо-комплексом диареи;
провести испытания хитозана в качестве флокулянта, компонента фитопрепаратов, а также источника биологически активных добавок к пище и лечебно-косметическимкомпозициям;
разработать способы получения коллагеназы с использованием растворов хитозана вместо органических растворителей для очистки фермента от балластных белков;
исследовать свойства коллагеназы из гепатопанкреаса крабов и разработать рекомендации по ее применению в производстве противовирусных вакцин и в пищевой промышленности;
изучить влияние кормовых добавок из морских моллюсков на рост и развитие молодняка сельскохозяйственных животных. Разработать промышленные технологии получения мидийных препаратов и рекомендации по их применению.
1.3. Научная новизна. Впервые разработаны оригинальные способы получения и промышленные технологии изготовления алюмогидрогелеи для сорбции антигенов вируса ящура. Применение новых отечественных препаратов-адсорбентов обеспечивает сохранение биологических свойств проти-воящурных вакцин в течение 12 месяцев с момента изготовления. Способы получения ГОА защищены 3 авторскими свидетельствами на изобретения (ах. № 566419 с приор, от 19.03.75г., ах. № 1284025 с приор, от 29.01.84г., ах. № 1341820 с приор, от 28.11.85г.).Разработка новых методов контроля качества алюмогелей позволила комплексно решить проблему взаимодействия сорбентов с вакцинными антигенами и оптимизировать процессы приготовления противоящурных вакцин. Новизна исследований по разработке способов определения адсорбционной активности подтверждена двумя авторскими свидетельствами на изобретения (ах. № 747890 с приор, от 18.01.79г., ах. № 1284026 с приор, от 24.04.84г.).
Предложенные варианты сорбентов и критерии их оценки позволили разработать способ получения противоящурных вакцин (ах. №1284025 с приор, от 01.06.82г.). При этом использованы новые подходы к культивированию вируса ящура, позволившие повысить степень накопления специфических антигенов и исключить стадию концентрирования.
На основании экспериментальных исследований по получению производных хитозана и разработке промышленных технологий их изготовления получены новые данные об этом полисахариде, научно обоснована целесообразность использования его сорбционно-пролонгирующих, противовоспалительных, антацидных и других свойств для терапии и профилактики нарушений липидного обмена, а также некоторых патологических состояний желудочно-кишечного тракта и кожных покровов животных и челове-
5 ка. Новизна исследований в этих направлениях защищена тремя патентами РФ (№ 2144040 от 07.04.99 г., №2204402 г., №2215749 от 14.06.01 г.).
Разработан новый способ удаления балластных белков с помощью хито-зана в технологиях получения ферментов из гепатопанкреаса крабов и поджелудочной железы жвачных, который позволил получать протеазы высокого качества в промышленных объемах без применения органических растворителей и солей аммония. Способы получения коллагеназы и трипсина с использованием хитозанового флокулянта защищены патентом РФ (№ 2112036 от 09.10.92 г.), подано 2 заявки на изобретения.
Впервые коллагеназа из печени крабов использована в нашей стране для получения монослоя культур клеток при промышленном производстве противовирусных вакцин для животных и птиц, что позволило отказаться от закупок ферментного препарата трипсина за рубежом.
Разработаны условия применения коллагеназы для ферментной модификации низкосортного мясного сырья с целью повышения его качества и наиболее полного использования коллагенсодержащих белков кожи, сухожилий и хрящей, что позволяет увеличить выход мясной продукции (патент РФ№ 2147204 с приор, от 16.06.99г.).
Научно обоснованы схемы применения мидийных препаратов при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных и птицы, повышающих скорость роста и уровень естественной резистентности.
1.4. Практическая значимость. Разработан и внедрен в производство противоящурных вакцин новый адъювант-сорбент гель ГОА (ТУ 10-09-95-90), что позволило отказаться от закупок этого препарата за рубежом и увеличить объемы изготавливаемых вакцин. Согласно «Временной инструкции по изготовлению трехвалентной противоящурной вакцины из вируса типов АОС, культивируемого на эксплантатах эпителия крупного рогатого скота» (1975), время изготовления вакцины сокращено в 2 раза при проведении сорбции на новом алюмогеле в одну фазу, что позволило увеличить выпуск прививочного препарата и снизить его себестоимость. За 28 лет выпущено и использовано в ветеринарной практике более 900 млн. доз противоящурных вакцин. Для сорбции протективных антигенов приготовлено свыше 1000 тонн высокодисперсного геля ГОА
Создание новых технологий получения хитозана, мидийных гидролиза-тов и экстрактов, а также организация их промышленного выпуска дали возможность применить:
в ветеринарии - для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных (ТУ9337-008-111734126-01);
в фитотерапии различных заболеваний человека - для пролонгирования и усиления действия экстрактов лекарственных растений (per. удост. Минздрава РФ №00337б.Р.643.10.2001);
в пищевой промышленности — «Хитозан низкомолекулярный пищевой» (сан.-эпидем. закл. Минздрава № 77.99.02.928.Д. 000812.02.04 от 10.02.2004г. совместно с Центром «Биоинженерия» РАН), для получения биологически активных добавок к пище (№001963.Р.09. 2000; №003375.Р.643.10.2001 совместно с ВНИРО);
в косметике - для получения биологически активныхкомпонентов кремов, бальзамов, гелей, шампуней (сан.-эпид. закл. Госсанэпид. Службы РФ № 77.01.12.923Л.02262.02.3 от 05.02.03; №77.01.12.928.П. 12889.05.2 от 07.05.02.; №77.01.12.928.П. 12891.05.2 от 07.05.02).
Организован промышленный выпуск коллагеназы по экологически чистой оригинальной технологии с целью:
- получения культур клеток при производстве противовирусных вакцин
(«Временное наставление по применению препарата коллагеназа из гепато-
панкреаса крабов для получения культур клеток», утвержденное Департа
ментом ветеринарии МСХиП РФ 25.04.95).
использования в качестве пищевой добавки (гигиен. закл. Минздрава РФ №77.99.9.916.П. 16402.12.00 от 06.12.2000).
применения в качестве сырья при производстве косметической продукции (сан. эпид. закл. Гассанэпид. Службы РФ №77.01.12.915.П.02263.02.3. от 05.02.03).
получения пастеризованного пива марки «Хамовническое» (ТУ 9281-004-11734126-00).
1.5. Апробация. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на Всесоюзных, Всероссийских и Международных научно-производственных конференциях: «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 1978, 1981, 1987, 1991, 1996, 2003), на семинаре специалистов стран СЭВ
7 «Разработка и использование новых адъювантов для биотехнологических целей» (Владимир, 1990), на Всероссийской конференции «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных» (Москва, 1996), на научно - производственной конференции «100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России» (Курск,. 1996), на конференции «Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных, посвященной 100-летию открытия вируса ящура» (Владимир, 1997), на межрегиональной конференции «Обеспечение стабилизации АПК в условиях рыночных форм хозяйствования» (Воронеж, 1997), на Международных научно-практических конференциях «Биологически активные вещества и новые продукты в косметике» (Москва, 1996, 1997,1998), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ВАПершина (Щелково, 1998), на 1 Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской экологии» (Орел, 1998), на научных конференциях по фитотерапии и лазеротерапии в современной медицине (Черноголовка, 1997,1999,2000,2002,2004), на V-VI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство». (Москва,-1998, 1999), на Международных конференциях «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва-Щелково, 1999, 2001; С-Петербург, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИ биологической промышленности (Щелково, 2000), на Международной научно-практической конференции «Наука и образование - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (Брянск, 2000), на научно-практической конференции «Фитотерапия и здоровье» (Москва, 2000), на VI Всероссийской научно-практической конференции по квантовой терапии (Москва, 2000), на Всероссийской научно-практической конференции «Разработка и освоение нового поколения лекарственных средств для животных и их применения в ветеринарной практике» (Ставрополь, 2000), на Республиканской научно-практической конференции стоматологов (Уфа, 2000), Российских научно-практических конференциях «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами и создание функциональных продуктов» (Москва, 2001, 2003), на Всероссийской научной конференции, посвященной 70-летию ВЕНКИ «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», (Москва, 2001), на Международных научно-технических конференциях «Пища, экология, человек» (Москва, 2001,2003), на научно-практической конференции
«Эффективность применения биологически активных добавок в различных областях медицины», (Москва, 2001), на V Международной Азиатской конференции по хитин-хитозану (Бангкок, 2002), на VIII съезде Польского хитинового общества (Краков, 2002).
Разработки по материалам диссертационной работы удостоены золотой и бронзовой медалей ВВЦ, 4 медалей «Лауреат ВВЦ» (пост. №10 от 10.07.98; №13 от 23.02.01; №36 от 15.05.02; №105 от 15.05.02), демонстрировались на II Международной выставке «Инновации 99. Технологии живых систем» (Москва, 1999), на VIII выставке «Медицина для Вас» (Москва, 2001), на Международной выставке «Биотехника» (Ганновер, 2001), на II Международной выставке «Планета и здоровье» (Москва, 2001), на выставке «Биотехнологии России» (Берлин, 2001), на Российских агропромышленных выставках «Золотая осень» (Москва, 2002,2003).
-
Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 173 научных статьях, в том числе в 23 авторских свидетельствах и патентах на изобретения РФ, а также освещены в научно-производственных отчетах Государственного Щелковского биокомбината за 1978-89гг., итоговых отчетах НИР и ОКР ВНИТИБП за 1990-2003гг. и в комплектах НТД на разработанные и внедренные препараты.
-
Основные положения диссертационной работы, выносимые-на защиту:
-
Разработка технологии получения высокоактивного минерального сорбента гидрогеля алюминия (оптимизация параметров синтеза, очистка от примесей, гидротермальная обработка продукта, механизация, автоматизация и стандартизация), применение которого улучшает качество и сохраняет иммуногенную активность противоящурных вакцин в пределах срока годности.
-
Создание промышленных технологий получения различных форм хито-зана и его производных с заданными свойствами, их сертификация и организация производства с последующим внедрением в сельское хозяйство, медицину, пищевую и косметическую промышленность.
3. Решение проблемы расширения практического применения про-
теолитических ферментных препаратов коллагеназы из гепато-панкреаса
крабов и трипсина из поджелудочной железы (по оригинальным методикам,
удешевляющим и стандартизирующим технологический процесс) в про-
мышпенных объемах для производства вакцин, пищевых добавок, напитков и мясных продуктов.
4. Научное обоснование схем использования мидийных препаратов в качестве кормовой добавки при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.
-
Личный вклад автора заключается в постановке целей и задач исследований, теоретическом и методическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном выполнении исследований, обобщении результатов, организации апробации и промышленного производства разработанных препаратов.
-
Объем и структура научного доклада. Доклад изложен на 59 страницах, содержит I рисунок, 14 таблиц и включает следующие разделы: «Общая характеристика работы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Выводы», «Практические предложения», «Список работ, опубликованных по теме диссертационного доклада».
Работа проводилась в 1978-2003 гг. во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП) и в его производственном подразделении — ЗАО «Биопрогресс», а также в ФГУП «Щелковский биокомбинат».
В качестве материала для исследований использованы существующие и разработанные нами сорбенты минерального, животного и растительного происхождения: гидрогели алюминия, хитин - хитозан и его производные, а также фитосорбенты на основе отходов деревопереработки. Биоактивными компонентами из гидробионтов служили коллагенолитические протеиназы из гепато-панкреаса камчатского краба (коллагеназа), гидролизаты и экстракты из мидий и других моллюсков.
Для оценки качества препаратов, применялись общепринятые физико -химические методы исследований: определение сухого остатка при 105С, рН, содержание неорганических примесей, аминного азота, белка, седиментация и вязкость гелевых растворов. Адсорбционная активность гидроокиси алюминия определялась с помощью белка казеина, красителя конго-рот и по сорбции вируса ящура в РСК, емкость хитозанов и фитосорбов контролировали по адсорбции ионов меди (З.А. Агапова, 1970). Степень деацети-
лирования (СД) и степень замещенния (СЗ) хитозана определяли кондукто-метрическим титрованием, молекулярную массу устанавливали по степени вязкости растворов хитозана с помощью вискозиметра Уббелоде. Степень токсичности хитозана определяли на мышах по общепринятой методике с обработкой результатов по L.Miller, M.Tainter (1944).
Динамику поступления хитозана в различные ткани при введении его мышам per os и его выведение из организма изучали с помощью 3Н - хитозана. В образцах тканей и крови, полученных от животных, определяли радиоактивность с помощью счетчика SL —40 (Ю.И. Митрохин и др., 1987).
Содержание форменных элементов крови определяли по стандартным методикам (И.П. Кондрахин, Н.В. Курилов и др., 1985).
Коллагенолитическую активность ферментов из печени крабов выявляли по методу Мандла, протеолитическую активность - по белку казеину (Шоу -Петиколас, 1976).
Терапевтическая и профилактическая активность гелевого хитозана при желудочно-кишечных заболеваниях телят и поросят оценивалась в производственных условиях в хозяйствах Курской, Московской, Брянской и Тульской областей.
Препараты серии фитохитодезов испытывались на лабораторных и сельскохозяйственных животных.
Разработка и конструирование новых сорбентов, ферментов, гидролиза-тов и других биологически активных веществ проводили на основе принципов доступности, целесообразности и перспективности.