Введение к работе
Нарушения оплодотворяющей способности спермы являются существенным ограничением для использования искусственного оплодотворения как в животноводстве, так и в работах по репродукции человека.
В некоторых из обследованных групп населения до 87% случаев бесплодия обусловлено мужским фактором. Вероятность повреждения спермы увеличивается при ее криоконсервации. Для многих видов адекватные режимы криоконсервации спермы еще не разработаны. В криобанках хранятся образцы спермы, полученные от погибших диких животных, изначально имеющие разную степень деградации.
Необходимость использования спермы с нарушенной оплодотворяющей способностью привела к развитию методов вспомогательной репродукции, которые позволяют добиваться оплодотворения in vitro поврежденными спермиями.
Метод подоболочечного осеменения (ПОО - subzonal insemination, -SUZI), введения спермиев под блестящую оболочку яйцеклетки, достаточно успешно используется в тех случаях, когда спермин сохраняют хотя бы ограниченную подвижность (Kaplan at all, 1995). При необходимости использовать для оплодотворения неподвижные спермин применяют метод внутрицитоплазматической инъекции спермия (ВЦИС -intracytoplazmic sperm injection, - ICSI). Если ядра таких спермиев сохранны, то оплодотворение с использованием ВЦИС может быть успешным, тогда как никакими другими способами добиться этого не удается (Никитин, 1996).
В то же время, прежде всего из-за технической сложности операции и низкой выживаемости яйцеклеток некоторых видов, ВЦИС применяется ограниченно. Кроме того, показано, что после этой манипуляции, несмотря на формирование зиготы, часть эмбрионов не проходит необходимого числа делений дробления на доимплантационной стадии развития или совсем не делится (Hewitson et all, 1996). Гибель значительной части эмбрионов или нарушение их развития после различных микрохирургических операций вообще является основным фактором, лимитирующим развитие и применение методов эмбриотехнологии. В значительной Степени это обусловлено тем, что механизмы гибели клеток на начальных стадиях эмбриогенеза не изучены, а, следовательно, и не разработано адекватных способов ее снижения. При применении ВЦИС повреждение зигот в результате использования для инъекции клеток микропипеток с большим диаметром (5-9мкм) становится практически неизбежным (Plachot, 1996). По всей видимости, можно уменьшить степень повреждения зиготы, если использовать неинвазивный способ введения спермия.
Еще одна проблема, возникающая при использовании ВЦИС, состоит в том, что у некоторых видов, в том числе у мышей, вероятность
образования мужского пронуклеуса после инъекции спермия в цитоплазму яйцеклетки очень низка (Keefer, 1989). Обнаруженный факт формирования пронуклеусов из ядер спермиев, инъецированных в цитоплазму яйцеклетки другого вида (Naish et al, 1987) открывает дополнительные возможности для получения зигот.
Мы предположили, что эффективность микрохирургического оплодотворения может быть увеличена за счет развития инструментальной базы, снижения гибели эмбрионов после микрохирургических операций в результате выяснения механизмов гибели клеток на начальных стадиях эмбриогенеза, и, главным образом, при замене радикальной операции введения инъекционной микропипетки в цитоплазму оплодотворяемой яйцеклетки неинвазивной процедурой (без нарушения целостности плазматической мембраны) - электрослиянием с кариопластом, содержащим пронуклеус.
Мы решили проверить возможность осуществления выработанной нами схемы, предполагающей формирование пронуклеусов в гетерологичных яйцеклетках (для которых ВЦИС эффективен) и дальнейшую их трансплантацию в виде кариопласта в яйцеклетку мыши (использована в качестве модельного объекта) с целью ее оплодотворения.
Цель исследования
Цель настоящей работы заключалась:
а) в создании эффективной микрохирургической технологии
искусственного оплодотворения яйцеклеток таких видов животных, у
которых вероятность повреждения яйцеклеток при ВЦИС велика;
б) в изучении возможности реализации апоптоза в ранних эмбрионах.
Основные задачи исследования.
1. Разработать специальные приспособления и методические
приемы для повышения эффективности микрохирургических операций по
инъекции спермиев и пересадке ядер.
2. Подобрать виды лабораторных животных, яйцеклетки которых
могут быть использованы в качестве "промежуточного хозяина" для
формирования пронуклеусов из спермиев мыши, для чего провести
оплодотворение яйцеклеток других видов спермиями мыши.
3. Изучить возможность эффективного электрослияния
гетерологичных кариопластов с яйцеклетками и зиготами мыши.
4. Провести трансплантацию мужских пронуклеусов мыши,
сформированных в гетерологической яйцеклетке, в активированную
яйцеклетку или зиготу с удаленным мужским пронуклеусом мыши.
5. Исследовать возможность гибели яйцеклеток и эмбрионов
мышей начальных стадий развития по механизму апоптоза.
Научная новизна.
Разработан метод искусственного микрохирургического неинвазивного оплодотворения (МОН) путем электрослияния яйцеклетки с кариопластом, содержащим мужской пронуклеус, позволяющая избежать разрушения плазматической мембраны яйцеклетки.
Показано, что гибель тотипотентных бластомеров эмбрионов начальных стадий развития может проходить по механизму апоптоза.
Обнаружено, что мужские пронуклеусы, образовавшиеся в чужеродной цитоплазме, обеспечивают доимплантационное развитие эмбрионов.
Продемонстрирована возможность электрослияния клеточных мембран разных видов животных при гетерологической трансплантации ядер.
Показано, что ограниченное привнесение гетерологичной цитоплазмы из зиготы крысы в зиготу мыши не оказывает заметного воздействия на ее дальнейшее развитие.
Практическая значимость работы.
Разработана технология - микрохирургического неинвазивного оплодотворения яйцеклеток мышей, позволяющая реализовать генетическую информацию спермиев, имеющих повреждения и функциональные нарушения. Технология позволяет оплодотворять яйцеклетки таких видов животных, у которых вероятность образования пронуклеусов при ВЦИС низка, а повреждаемость яйцеклеток высока. Технология может быть адаптирована применительно к другим видам млекопитающих и наряду с ВЦИС использована для воспроизведения мутантных линий животных, страдающих нарушениями сперматогенеза, для для межвидовой гибридизации, для преодоления мужского бесплодия.
Разработан прибор для изготовления микропипеток специальной формы, обеспечивающей высокую эффективность микрохирургических операций трансплантации и микроинъекции ядер.
Разработаны технические приспособления и методические приемы, позволяющие оптимизировать проведение операций по пересадке ядер и микроинъекции спермиев: вибрационная микронасадка для прокалывания мембраны; микропульсатор предотвращающий адгезию спермия к стеклу за счет вибрации спермия внутри микропипетки при пульсациях давления инъекционного раствора; усовершенствована сама микропипетка за счет изменения формы и помещения внутрь ее микропоршня из инертного вещества.
Апробация работы.
Результаты работы были , представлены на Евроазиатском биотехнологическом симпозиуме (Анкара, 1995), Международном экологическом конгрессе (Воронеж, 1996), Совещании по консервации
генетических ресурсов (Пущино, 1996), Симпозиуме по сохранению биоразнообразия (Лондон, 1997), Международной конференции по биотехнологии и разведению животных (Киев, 1997).
Структура работы.
Диссертация состоит из трех глав, изложена на 117 стр., содержит 8 таблиц, 16 фотографий и 5 рисунков. Список литературы включает 187 наименований.
Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 16 работ.