Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 14
1.1 Способы биотестирования пищевых продуктов, ингредиентов и кормов 14
1.2 Микрофлора мясных продуктов и способы ее изучения
1.2.1 Бактериальные стартовые культуры в мясной промышленности. 19
1.2.2 Применение молекулярно-генетических методов для оценки микробной безопасности мясных продуктов 22
1.2.3 Применение T-RFLP-анализа для изучения микрофлоры пищевых продуктов 24
1.3 Применение микроорганизма Lactobacillus plantarum для профилактики
и лечения заболеваний ЖКТ сельскохозяйственных животных и птицы .28
1.3.1 Использование Lactobacillus plantarum в рационе сельскохозяйственных птиц 29
1.3.2 Использование Lactobacillus plantarum в свиноводстве .32
Заключение по обзору литературы 35
2 Объекты и методы исследований 37
2.1 Схема проведения исследований 37
2.2 Объекты исследований 38
2.3 Методы исследований 38
2.3.1 Методы культивирования и исследования клеток животных и человека 38
2.3.2 Микробиологические методы .42
2.3.3 Молекулярно-генетические методы .51
2.3.4 Методы оценки безопасности микроорганизмов на мышах 58
2.3.5 Исследования образцов мясных продуктов 62
2.3.6 Исследования на бройлерах 64
2.3.7 Статистическая обработка экспериментальных данных 66
Результаты исследований 67
3 Разработка способа биотестирования на клеточных тест-системах 67
3.1 Выбор клеточных тест-систем 67
3.2 Анализ ростовой кинетики клеточных тест-систем .68
3.3 Метод определения безопасности пищевых ингредиентов 71
3.4 Метод определения безопасности пробиотических микроорганизмов .73
Заключение к главе 3 76
4 Выделение и комплексные исследования стартовых культур – новых пищевых ингредиентов микробного происхождения .77
4.1 Анализ микрофлоры ферментированного мясного продукта .77
4.1.1 Определение общего количества микроорганизмов и лактобактерий методом ПЦР-РВ .77
4.1.2 Исследование микрофлоры продукта методом T-RFLP .78
4.2 Выделение, идентификация и комплексное исследование новых штаммов микроорганизмов 81
4.2.1 Идентификация выделенных микроорганизмов 81
4.2.2 Морфологические и культуральные свойства 83
4.2.3 Физиолого-биохимические свойства выделенных штаммов .84
4.2.4 Технологические свойства выделенных микроорганизмов. 86
4.2.5 Пробиотические свойства выделенных микроорганизмов .87
4.3 Биотестирование молочнокислых микроорганизмов на клеточных тест системах 88
4.4 Исследование безопасности молочнокислого микроорганизма Staphylococcus carnosus на мышах .97
Заключение к главе 4 98
5 Получение нового пробиотического штамма для животноводства на основе молочнокислого микроорганизма Lactobacillus plantarum L-211 .100
5.1 Исследование комплекса характеристик штамма L. plantarum L-211...100
5.1.1 Идентификация штамма по биохимическому профилю. 100
5.1.2 Морфологические и культуральные свойства .100
5.1.3 Физиолого-биохимические свойства штамма 101
5.1.4 Технологические свойства молочнокислого микроорганизма 104
5.1.5 Пробиотические свойства штамма 104
5.1.6 Молекулярно-генетическая идентификация штамма .
5.2 Биотестирование L. plantarum L-211 на клеточных тест-системах .113
5.3 Оценка безопасности Lactobacillus plantarum L-211 на мышах 114
Заключение к главе 5 115
6 Комплексная оценка технологических и потребительских характеристик ферментированного мясного продукта с бактериальной композицией стартовых культур 117
6.1 Выбор заквасочных микроорганизмов для ферментированного мясного продукта 117
6.2 Выработка сырокопченой колбасы со стартовыми культурами 119
6.3 Исследование характеристик конечного мясного продукта 121 Заключение к главе 6 122
7 Оценка пробиотической активности штамма Lactobacillus plantarum L-211 и влияние на микрофлору цыплят-бройлеров . 123
7.1 Результаты T-RFLP-анализа микрофлоры слепых отростков бройлеров 123
7.2 Влияние L. plantarum на нормофлору кишечников бройлеров. 124
7.3 Влияние Lactobacillus plantarum на «нежелательную» микрофлору .125
7.4 Влияние L. plantarum на количество патогенных микроорганизмов .126
7.5 Влияние L. plantarum на количество некультивируемых бактерий... 127
7.6 Влияние Lactobacillus plantarum L-211 на транзитную микрофлору .128
Заключение к главе 7 128
Выводы 129
Сокращения 131
Список использованных источников
- Микрофлора мясных продуктов и способы ее изучения
- Методы культивирования и исследования клеток животных и человека
- Метод определения безопасности пробиотических микроорганизмов
- Влияние L. plantarum на количество патогенных микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность работы
Биотехнология является одним из важнейших и перспективных направлений развития технологий в Российской Федерации. На 2013–2020 годы принята государственная программа «Развитие науки и технологий», в которой определены приоритетные направления развития сферы исследований и разработок в тематической области «Биотехнологии».
Актуальными направлениями клеточной биотехнологии являются разработка методов и способов культивирования клеток человека, животных и растений, изучение их культурально-морфологических свойств и ультраструктуры, разработка способов идентификации и оценки эффективности ингибиторов онкологических и инфекционных заболеваний.
Биотехнологические подходы играют все большую роль в пищевой промышленности при разработке и производстве продуктов функциональной направленности, в том числе с применением пробиотических микроорганизмов, заквасочных и стартовых культур.
Фундаментальные исследования в данной области направлены на поиск и скрининг новых промышленно-ценных штаммов, пробиотиков и синбиотиков, изучение их свойств, метаболических путей, физиологических функций и продуцируемых биологически активных соединений. Современным подходом является изучение генома молочнокислых бактерий, разработка методов молекулярной идентификации и таксономии, благодаря чему появляется возможность применять выявленные и изученные микроорганизмы в производстве новых видов продуктов питания и продовольственного сырья, функциональных пищевых продуктов, диетических (лечебных и профилактических) продуктов (Ганина В.И., Громовых Т.И., Костенко Ю.Г., Семенихина В.Ф., Хорольский В.В., Bover-Cid S., DeVuyst L., Eerola S., Klaenhammer T.R., Leroy F., Madsen S.M., Niinivaara F., Tanous C., Vandamme E.J. и др.).
Прикладные аспекты состоят в разработке технологий получения и характеристике функциональных свойств продуктов, имеющих в своем составе биологически активные соединения и биокомпозиции, а также в проектировании и оптимизации технологических процессов для получения продуктов с высокой добавленной стоимостью. На основе новых штаммов осуществляется создание высокоактивных молочнокислых и других технологических микроорганизмов, высококонцентрированных заквасок и стартовых культур с заданными биологическими характеристиками и оптимизированными технологическими свойствами для промышленной биотехнологии.
Важным является мониторинг качества и безопасности пищи и ингредиентов, поэтому ведутся разработки методов тестирования функциональных свойств пищевых продуктов и ингредиентов, включающие выявление новых тест-объектов, проведение работ по оценке индикаторной значимости организмов, их адаптационной способности к действующим факторам в различных условиях, создание лабораторных моделей и модельных систем. Результаты направлены на создание и внедрение эффективных биотест-систем, в том числе экспрессных, на основе биологического материала и живых организмов, разработку биосенсоров, создание методов и критериев оценки состояния биоиндикаторов по их физиологическому состоянию и морфологическим изменениям в ходе онтогенеза (Гроздов А.О., Децина А.Н., Елисеева Л.Г., Еремец В.И., Зуев Е.Т., Рогов И.А., Скрябин К.Г., Черемных Е.Г., Bhunia A.K., Deshpande S.S., Jay J.M., Rasooly R., Wiseman A., Yamashoji S. и др.).
Пробиотические микроорганизмы обладают огромным метаболическим потенциалом и осуществляют множество биохимических процессов, предотвращают колонизацию желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микроорганизмами, участвуют в формирования местного и системного иммунитета. На сегодняшний день пробиотики широко используются как в пищевой промышленности (Ганина В.И., Королева Н.С., Семенихина В.Ф., Fuller R., Gibson G., Klaenhammer T.D. и др.), так и в сельском хозяйстве (Артемьева О.А., Егоров И.А., Зиновьева Н.А., Иванова А.Б., Малик Н.И., Лаптев Г.Ю., Неминущая Л.А., Ноздрин Г.А., Панин А.Н., Самуйленко А.Я., Субботин В.В., Эрнст Л.К., Фисинин В.И., Oggioni M.R., Ouwehand A.C. и др.).
Изучение роли пищевых биологически активных веществ и их влияния на рост и развитие клеток откроет возможности для разработки и использования функциональных пищевых продуктов в целях оптимизации питания, профилактики и минимизации риска заболеваний.
Степень разработанности темы
Согласно Доктрине продовольственной безопасности РФ от 30 января 2010 г решение ключевых задач в сфере обеспечения продовольственной безопасности предполагает развитие фундаментальных и прикладных научных исследований по медико-биологической оценке безопасности новых и традиционных источников пищи и ингредиентов, внедрение инновационных биотехнологий, эффективную переработку пищевого сырья, развитие производства пищевых продуктов, в том числе обогащенных незаменимыми эссенциальными нутриентами, функциональных пищевых продуктов, продуктов детского питания, диетических, лечебных, профилактических, а также биологически активных добавок к пище.
Молекулярно-генетические и метаболические факторы определяют нормальное протекание метаболизма в клетках, их дифференциацию, деление и апоптоз, осуществление физиологических функций тканей и органов и, в конечном счете, здоровье организма. Множество эпидемиологических и доклинических исследований свидетельствует, что между данными детерминантами и конкретными пищевыми субстанциями существует множество разнообразных взаимоотношений. Выяснение этих взаимосвязей, в том числе на клеточном уровне, способно обеспечить научную базу для наиболее обоснованных рекомендаций использования соответствующих нутриентов с целью сохранения и укрепления физического и психического здоровья и снижения риска возникновения заболеваний (Тутельян В.И., Шендеров Б.А., Milner J.A., Shils M.E.).
Поскольку клетки позвоночных in vitro реагируют на воздействие химических и биологических факторов адекватно исходному организму, предлагается использовать метод биотестирования на клеточных культурах различных типов тканей человека и животных. Данный подход позволит определить морфофизиологические и хемотаксические изменения тест-систем, сигнализирующие о положительном либо неблагоприятном эффекте, и провести оценку безопасности потенциальных пищевых ингредиентов, в том числе функциональных, включая пробиотические микроорганизмы.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлась разработка метода биотестирования безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем.
Исходя из цели исследований, были сформулированы следующие задачи:
– разработка метода биологической оценки безопасности пищевых ингредиентов и пробиотических микроорганизмов с использованием культур клеток животных и человека; выбор клеточных тест-систем и оценка их характеристик в культуре in vitro, включая показатели ростовой кинетики;
– получение новых пищевых ингредиентов микробного происхождения – скрининг
молочнокислых микроорганизмов из микробных сообществ мясных продуктов естественной
ферментации, изучение их физиолого-биохимических, молекулярно-генетических,
пробиотических и технологических свойств; оценка безопасности вновь выделенных микроорганизмов и уже используемых в промышленности стартовых культур в опытах на культурах клеток in vitro и подтверждение in vivo на мышах;
– получение нового пробиотического штамма для животноводства – изучение его физиолого-биохимических, молекулярно-генетических и пробиотических свойств; оценка безопасности пробиотического микроорганизма на культурах клеток in vitro и подтверждение in vivo на мышах;
– технологическая характеристика микробных пищевых ингредиентов, изучение их влияния на комплекс потребительских и технологических свойств пищевых продуктов; изучение влияния пробиотического штамма на микрофлору сельскохозяйственных животных на примере цыплят-бройлеров.
Научная новизна работы
Предложен метод оценки безопасности пищевых ингредиентов и пробиотических микроорганизмов с помощью тест-систем на основе клеток человека и животных in vitro, патенты № 2604802 РФ «Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем» и № 2604804 РФ «Способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов с помощью клеточных тест-систем».
При исследовании профиля микробного сообщества мясного продукта естественной ферментации методом T-RFLP установлено, что большая часть микрофлоры колбасы (около 80%) представлена безопасными (64,8%), некультивируемыми (14,8%) и условно-патогенными (19,7%) микроорганизмами; 0,7% приходилось на патогенные бактерии Campylobacter lari. Из мясного продукта естественной ферментации выделены и идентифицированы молочнокислые микроорганизмы Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus sakei KD-2 и Enterococcus faecalis KD-3.
С помощью метода биотестирования определено влияние на клеточные тест-системы
штаммов Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus sakei KD-2 и Enterococcus faecalis KD-3,
выделенных из ферментированного мясного продукта и стартовых культур
Lactobacillus curvatus 111-1, Lactobacillus sakei 306-1, Lactobacillus casei 10, Lactobacillus plantarum 19, Pediococcus acidilactici 3, Pediococcus acidilactici 38, Pediococcus pentosaceus 39, Pediococcus pentosaceus 55, Staphylococcus carnosus S-1, Staphylococcus xylosus Р-1 из коллекции ФГБОУ ВО МГУПП. Все штаммы являются безопасными. Наибольшее воздействие в отношении опухолевых клеток при дозозависимом ингибировании жизнеспособности проявили штаммы Lactobacillus curvatus 111-1, Lactobacillus plantarum 19 и Pediococcus acidilactici 3. Результаты, полученные на клеточных тест-системах, подтверждены исследованиями на мышах.
Проведена идентификация, изучены физиолого-биохимические, пробиотические и молекулярно-генетические свойства молочнокислого микроорганизма Lactobacillus plantarum L-211, рекомендуемого в качестве пробиотика для животноводства. С помощью метода биотестирования на клеточных тест-системах установлено, что штамм является не токсичным и не токсигенным, что подтверждено в исследованиях на мышах.
Практическая значимость работы
Разработан метод биотестирования объектов пищевого назначения на клеточных тест-системах.
Предложен молекулярно-генетический метод T-RFLP-анализа для исследования профиля микробного сообщества ферментированных пищевых продуктов и поиска новых технологических штаммов микроорганизмов.
Выделенные из мясного продукта естественной ферментации и идентифицированные молочнокислые микроорганизмы Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus sakei KD-2 и Enterococcus faecalis KD-3 депонированы во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов под номерами B-12732, B-12733 и B-12734 соответственно.
Разработана бактериальная композиция на основе стартовых культур Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus plantarum 19 и Staphylococcus carnosus S-1, которая рекомендуется к использованию в рецептуре сырокопченых колбас для повышения санитарно-гигиенического состояния и осуществления контролируемой ферментации мясного сырья.
Проведена комплексная оценка технологических и потребительских характеристик ферментированного мясного продукта с бактериальной композицией стартовых культур, которая позволила получить продукт с высокими характеристиками.
Проведена оценка пробиотической активности штамма Lactobacillus plantarum L-211 и его влияния на микрофлору пищеварительного тракта цыплят-бройлеров. Установлено, что при добавлении штамма в рацион цыплят-бройлеров возросла доля представителей нормофлоры: целлюлозолитических бактерий, лактобактерий, селеномонад и некультивируемых бактерий. При этом снизилось количество нежелательных актиномицетов и энтеробактерий, патогенных стафилококков, пептококков, фузобактерий и представителей транзитной микрофлоры – псевдомонад.
Основные положения, выносимые на защиту
Метод биотестирования безопасности пищевых ингредиентов с использованием клеточных тест-систем in vitro.
Молекулярно-генетический способ T-RFLP для исследования профиля микробного сообщества ферментированных мясных продуктов.
Новые штаммы микроорганизмов Lactobacillus sakei KD-1 (B-12732), Lactobacillus sakei KD-2 (B-12733) и Enterococcus faecalis KD-3 (B-12734).
Бактериальная композиция на основе стартовых культур Lactobacillus sakei KD-1, Lactobacillus plantarum 19 и Staphylococcus carnosus S-1 для мясной промышленности.
Пробиотический штамм для животноводства Lactobacillus plantarum L-211.
Апробация работы. Основные положения работы и результаты исследований были
представлены на следующих конкурсах и конференциях: Международной конференции
молодых ученых «Проблемы пищевой безопасности» (Москва, 2013); V Международной
научно-технической конференции «Безопасность и качество продуктов питания. Наука и
образование» (Москва, 2014); Общеуниверситетских научных конференциях молодых ученых и
специалистов «День науки МГУПП» (Москва, 2014, 2015, 2016); XIII научно-практической
конференции с международным участием «Живые системы» (Москва, 2015); Международном
научном форуме молодых ученых «Наука будущего – наука молодых» (Севастополь, 2015); 8-м
Международном научно-практическом симпозиуме «Перспективные ферментные препараты и
биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2016); VI
Международной научно-практической конференции «Современные достижения
биотехнологии. Новации пищевой и перерабатывающей промышленности» (Ставрополь, 2016); 62-м Международном Конгрессе по вопросам науки и технологии мясной промышленности (Бангкок, Тайланд, 2016).
Работа «Биотестирование пробиотиков на клеточных тест-системах in vitro для разработки бактериальной композиции и создания кисломолочного продукта» отмечена дипломом на конкурсе молодых ученых 8-го Международного научно-практического симпозиума «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» 26–27 апреля 2016 г, Москва.
Автором получен сертификат за участие в составе программного комитета секции «Агро-, био- и продовольственные технологии» Международного научного форума молодых ученых «Наука будущего – наука молодых», 29 сентября – 2 октября 2015, Севастополь.
Публикации. По материалам исследований, изложенных в диссертационной работе, опубликовано 19 печатных работ, в том числе статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ – 4, в других изданиях – 14, 2 патента, одно учебное пособие для студентов группы направлений подготовки 19.00.00 уровней бакалавриата и магистратуры.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов, результатов исследований, выводов, сокращений, списка литературы и приложений. Работа содержит 19 таблиц, 46 рисунков и 8 приложений. Список литературы включает 115 источников, в том числе 50 работ зарубежных авторов.
Благодарности. Автор выражает благодарность директору Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» ГНЦ РФ, д.б.н., профессору Синеокому С.П., главному специалисту ООО «Биотроф» Никонову И.Н.
Часть работ была выполнена за счет гранта Российского научного фонда «Изучение механизмов биосинтеза и деградации специфических биологически активных белков и пептидов под действием ферментативного и неферментативного протеолиза тканей Sus scofa и Bos taurus и разработка на их основе специализированных пищевых продуктов» (проект № 16-16-10073) и при поддержке субсидии Минобрнауки РФ «Создание полифункционального биологического препарата для обеспечения сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы L-лизином in situ и технологии его производства» (шифр заявки «2014-14-579-0001-023»).
Микрофлора мясных продуктов и способы ее изучения
Контроль качества и безопасности пищевых продуктов направлен на разработку биотехнологических подходов к медико-биологической оценке новых и нетрадиционных источников пищи, пищевых добавок и ингредиентов. Обеспечение безопасности пищевых ингредиентов является важной частью санитарно-эпидемиологического благополучия населения, поскольку некачественные компоненты и продукты питания могут приводить к заболеваниям различной этиологии. В животноводстве обеспечение надлежащего качества кормов и добавок необходимо для реализации генетического потенциала, роста, развития и продуктивности животных, во избежание ухудшения санитарного состояния и последующих экономических потерь. Для предотвращения этого необходимо тщательно проводить испытания токсичности объектов пищевого и сельскохозяйственного назначения, в том числе пробиотических микроорганизмов.
Для оценки существующих способов биотестирования объектов пищевого и кормового назначения был проведен анализ литературных и патентных источников. Предметом которого являлись разработки и исследования в РФ и мире в области определения безопасности, в том числе оценки токсичности и токсигенности объектов пищевого и кормового назначения, в том числе функциональных пищевых ингредиентов, БАВ, продуктов микробного синтеза и пробиотических микроорганизмов с использованием живых тест-объектов.
Известен способ определения безопасности растительных масел с помощью Tetrahymena pyriformis (Пат. РФ № 2415417), который позволяет повысить точность и достоверность результатов определения безопасности растительного масла. Способ включает подготовку исследуемого и контрольного (нерафинированное масло) образцов масла; приготовление питательной среды, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт, морскую соль, масляный раствор витамина Е концентрацией 30% и дистиллированную воду; внесение в количестве по 5 мл 30 мл исследуемого и контрольного образца масла в питательную среду; перемешивание; стерилизацию при температуре 80 С и охлаждение полученной смеси; внесение в нее тест-организма Tetrahymena pyriformis в количестве 0,2 мл; термостатирование для размножения микроорганизмов в течение 3 суток при температуре 25 С; встряхивание среды пробы для аэрации 3 раза в сутки через равные промежутки времени; фиксацию микроорганизмов раствором Люголя; подсчет в камере Горяева и оценку безопасности (Б) в процентах.
В патенте РФ № 2512751 рассмотрен способ оценки биологической ценности молочных продуктов, который осуществляют с использованием в качестве тестирующего объекта имаго комнатной мухи (Musca domestica) (Пат. РФ № 2512751). Биологическая ценность продукта определяется путем сравнения продолжительности жизни имаго, в рацион которых включен исследуемый молочный продукт, и имаго, в рационе которых исключены молочные продукты.
Способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов позволяет сократить время проведения биоанализа, получить сведения о наличии токсинов. Он заключается в использовании инфузорий Paramecium caudatum, культивируемых на зернах длиннозерного риса (Пат. РФ № 2266015). Оценку токсичности проводят по проценту выживших инфузорий в водном растворе ацетонового экстракта исследуемого продукта.
Другое изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при выявлении токсигенных кишечных палочек (Пат. РФ № 2262529). Способ предусматривает проведение испытания по выживаемости инфузорий вида стилонихии путем смешивания среды инфузорий вида стилонихии с кишечной палочкой, выращенной на бульоне Хоттингера со сроком инкубации 1–3 суток в соотношении 3:1 и определение степени токсичности исследуемого объекта, оцениваемой по степени выживания инфузорий. Изобретение позволяет обнаружить патогенные штаммы кишечной палочки, осуществлять эпидемиологический надзор за ее присутствием и распространением, оптимизировать сроки культивирования при производстве вакцинных препаратов против эшерихиоза молодняка животных.
Патент РФ № 2377561 описывает способ биотестирования активности препарата, полученного из дождевых червей, с помощью олигохет (Пат. РФ № 2377561). Способ включает смешивание препарата с водой, помещение олигохет в полученный раствор, выдерживание в течение 30 мин с последующим определением активности препарата по поведенческой реакции олигохет, причем об активности препарата судят по отсутствию сползания олигохет в клубок в присутствии активного препарата.
Известен способ определения биологической активности вещества, заключающийся в том, что выделяют клетки из биологических тканей человека или животных, проводят мечение с использованием флюоресцентного красителя, ко-культивируют с пораженными заболеванием клетками, к ко-культуре добавляют исследуемое вещество, определяют биологическую активность исследуемого вещества, анализируя жизнеспособность определенной клеточной популяции в ко-культуре здоровых и пораженных заболеванием клеток по увеличению или снижению процента мертвых клеток (Пат. РФ № 2492472).
Для автоматизированного биотестирования разработан приборно вычислительный комплекс БиоЛаТ-3.2 с системой визуализации и программным обеспечением для математической обработки данных. Предназначен для биологической оценки действия кормовых и пищевых продуктов и добавок, с/х сырья растительного и животного происхождения, а также фармацевтических препаратов и БАД. Биологическая оценка осуществляется с помощью регистрации тест-реакций инфузорий Paramecium caudatum, Stylonychia mytilus и Tetrahymena pyriformis на пробы исследуемых объектов (утв. РАСХН и ГНУВНИИВСГЭ, 2009 г).
Методы культивирования и исследования клеток животных и человека
Исследования проводились на 140 белых мышах б/п, массой 12–14 г. Формирование группы осуществляли из животных одной партии методом случайной выборки. Культуру штамма Staphylococcus carnosus S-1 высевали на плотную питательную среду L, инкубировали при 37 С в течение 18–20 ч. У выросшей микробной культуры с помощью стандарта мутности ОСО 42-28-59-85 определяли количество микробных клеток в 1 мл (ОЕ). Изучение безвредности Изучение безвредности образцов штамма проводили на 10 белых беспородных мышах массой 12–14 г при введении per os дозы 1011 КОЕ/0,5 мл. Контролем служила группа мышей (10 гол), получавших физиологический раствор. Животные должны оставаться живыми, не должны терять в весе. Учет смертности и динамики веса проводили через 5 сут. Изучение вирулентности Для исследования вирулентности штаммы выращивали на агаре Гаузе № 2 в течение 18–20 ч при температуре 37 С. Выросшую культуру смывали 0,9% раствором натрия хлорида и готовили бактериальные суспензии с концентрацией клеток 106, 107, 108 ОЕ /0,5 мл. Полученные суспензии вводили внутрибрюшинно 15 белым беспородным мышам массой 12–15 г. Контролем служила группа мышей (5 гол), получавших физиологический раствор. Наблюдение за состоянием животных осуществлялось в течение 5 сут. Изучение токсичности
Для исследования токсичности штамм выращивали на агаре Гаузе № 2 в течение 24 ч при 37 С. Смытые с агара микробные клетки разводили стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до необходимого количества (по оптическому стандарту ОСО 42-28-59-85) и затем инактивировали прогреванием при 100 С в течение 1 ч. Трем группам животных (5 гол в каждой) вводили в/б по 106, 107, 108 ОЕ /0,5 мл. Контролем служила группа мышей (5 гол), получавших физиологический раствор. За животными наблюдали в течение 5 сут.
Изучение токсигенности
Для изучения токсигенности штаммы выращивали в течение 10 сут на жидкой среде Гаузе № 2 при температуре 37 С. По истечении срока культуральную жидкость центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость вводили трем группам животных (5 гол в каждой) внутрибрюшинно по 0,25, 0,5 мл и 1,0 мл. Контролем служила группа мышей (5 гол), получавших стерильную жидкую среду Гаузе № 2. За животными наблюдали в течение 5 сут.
Изучение хронической токсичности
Исследования проводились на 50 белых мышах б/п массой 12–14 г. Животным вводили ежедневно в течение 30 суток per os суточную живую культуру штамма в концентрации 3103 КОЕ/0,5 мл. Контрольная группа животных (n=10) ежедневно в течение 30 суток получала per os 0,5 мл физиологического раствора.
Животных забивали эфиром через 24 часа и 7 сут после последнего введения культур. Патоморфологическое исследование включало в себя некропсию, выполняемую непосредственно патоморфологом, и гистологическое исследование следующих внутренних органов: место введения (корень языка), сердце, легкие с бронхами, тимус, печень, почки, тонкий кишечник, толстый кишечник, селезенка, головной мозг. При вскрытии обращали внимание на состояние внутренних органов. Кусочки органов, взятых для гистологического исследования, фиксировали в 10% нейтральном формалине.
Испытания пробиотической культуры проводились на 140 белых мышах SHK – линии обоего пола. Для исследования отбирали клинически здоровых белых мышей с хорошей упитанностью, активных, подвижных, хорошо обволошенных, с нормальной окраской слизистых оболочек и оформленным стулом. Средний вес животных составлял 10–15 г. Было проведено 6 серий экспериментов для определения вирулентности, токсигенности, токсичности, безвредности и острой токсичности, хронической токсичности. Сформированы 14 групп животных по массе тела и возрасту, из них 12 экспериментальных и 2 контрольные группы. Контрольным группам вместо штамма вводили физиологический раствор (серии С080812, годен до 09.2017) соответствующим образом. В ходе всего эксперимента проводилось динамическое отслеживание с ежесуточным общеклиническим наблюдением за состоянием животных (масса тела, характер стула, активность, состояние шерсти, окраска слизистых оболочек), отмечалось количество павших и выживших животных.
Определение вирулентности
Были сформированы 4 группы по 10 мышей в каждой: 3 опытные и 1 контрольная группа. Клетки штамма Lactobacillus plantarum L-211 вводили животным внутрибрюшинно в концентрации 108, 109 ,1010 микробных клеток в объеме 0,5 мл (опытная группа). Наблюдение за животными осуществлялось в течение 14 суток.
Определение токсигенности
Была сформирована опытная 5-я группа из 10-и особей. Препарат для определения токсигенности из Lactobacillus plantarum L-211 готовили с концентрацией клеток 21010 КОЕ/мл. Культуру испытуемого штамма сеяли на жидкую питательную среду, выдерживали в термостате при 37 С в течение 10 суток для накопления в ней токсина. Затем ее фильтровали через бактериальный фильтр. Полученный при этом прозрачный фильтрат разводили стерильным физиологическим раствором в той же кратности, в какой нужно было бы развести исходный препарат для определения токсигенности для получения максимальной переносимой при внутрибрюшинном введении дозы – 3,79107 КОЕ на 1 г массы мыши. Каждому животному вводили внутрибрюшинно 0,5 мл фильтрата, разведенного во столько раз, что и суспензия лактобацилл, в 0,5 мл которой должно было бы содержаться 109 живых клеток. Наблюдение за животными осуществлялось в течение 14 суток.
Определение токсичности
Были сформированы опытные группы 6 и 7 по 10 животных в каждой. Культуру Lactobacillus plantarum L-211 (В-11235) прогревали при температуре 100 С в течении 30 мин. Прогретую культуру в нативном и разведенном виде вводили внутрибрюшинно животным в объеме 0,5 мл. Каждому животному 6-й группы было введено 1010 инактивированных клеток. Доза для мышей 7-й группы составила 109 инактивированных клеток лактобацилл. Наблюдение за животными осуществлялось в течение 14 суток.
Метод определения безопасности пробиотических микроорганизмов
К микроорганизмам, предлагаемым для использования в качестве пищевых ингредиентов и пробиотиков, в обязательном порядке предъявляются требования по отсутствию таких показателей как токсигенность и токсичность. Это учитывает разработанный метод определения безопасности микроорганизмов, в том числе пробиотических, используемых в качестве пищевых ингредиентов. Данный метод использует культуры клеток млекопитающих и человека в качестве тест-систем и включает следующие этапы:
1. подготовку исследуемого объекта: для исследования токсичности микробные клетки выращивают на соответствующей плотной питательной среде в течение 24 ч при 37 С, смытые с агара микробные клетки разводят стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида до необходимого количества (используя стандарты мутности ОСО 42-28-59-85 или стандарт McFarland) и инактивируют прогреванием при 100 С в течение 1 ч; для изучения токсигенности микробные клетки выращивают в течение 10 суток в соответствующей жидкой питательной среде при температуре 37 С, после чего культуральную жидкость центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин;
2. подготовку тест-систем: выращивают монослой клеток в культуральном флаконе площадью 25 см2 на соответствующей питательной среде EMEM, DMEM или 199, включающей 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС, 0,05% антибиотика гентамицина или пенициллина-стрептомицина; удаляют со сформировавшегося монослоя питательную среду; промывают монослой клеток дважды фосфатно-солевым буфером или раствором Версена или физраствором; вносят 10 мл питательной среды EMEM, DMEM или 199, включающей 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС;
3. определение безопасности объекта на тест-системах: для исследования токсичности сформировавшийся монослой клеток обрабатывают инактивированными бактериями в количестве 107, 108, 109 ОЕ / 0,5 мл; для изучения токсигенности супернатант бактериальных клеток вводят во флаконы со сформировавшимся монослоем по 0,25, 0,5 мл и 1,0 мл; в обоих случаях выдерживают 1 ч в СО2-инкубаторе при 37 С и концентрации газа 5,0%, затем удаляют питательную среду и промывают монослой клеток дважды фосфатно-солевым буфером или раствором Версена или физраствором, вносят 10 мл свежей питательной среды EMEM, DMEM или 199 с содержанием 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС, флаконы на 24 ч помещают в СО2-инкубатор при температуре 37 С и концентрации газа 5,0%, удаляют питательную среду, производят снятие клеток растворами Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1, окрашивают клетки раствором красителя трипанового синего, производят подсчет живых и мертвых клеток и определение жизнеспособности с помощью камеры Горяева. Схема данного этапа изображена на рисунке 3.2.
В качестве контроля используют флакон с клетками, выросшими на питательной среде без добавления микроорганизмов или надосадочной жидкости. Испытания повторяют минимум трехкратно. Полученные данные сравнивают с контролем, а результат – жизнеспособность (Ж) – выражают в процентах по формуле (3.1) как отношение количества живых клеток, выросших на среде с добавлением исследуемого ингредиента, к общему числу клеток.
Если во всех опытах жизнеспособность более 50%, штамм считают не токсичным и не токсигенным, безопасным при использовании в пищевой промышленности. Если хотя бы в одном случае происходит гибель 50% и более клеточной популяции, опыт повторяют. При подтверждении результата определяют TC50 – цитопатическую активность, характеризующую количество микроорганизмов в питательной среде, которое приводит к уничтожению клеточной популяции на 50%, при этом штамм признается небезопасным и не рекомендуется к использованию в пищевой промышленности в качестве пробиотического препарата. Заключение к главе 3 Безопасность любого нового ингредиента, в том числе функционального, для использования в пищевой промышленности в обязательном порядке должна быть доказана эмпирически. Современные достижения клеточной биологии позволяют провести подобную оценку, поскольку культуры клеток in vitro способны дать адекватный ответ на воздействие того или иного вещества, который можно экстраполировать на организм в целом.
Учитывая это, в работе предложены методы оценки безопасности пищевых ингредиентов и пробиотических микроорганизмов на клеточных тест-системах. Они включают подготовку объекта исследования, подготовку тест-системы, внесение тест-объекта в культуральный флакон, подсчет жизнеспособных клеток и оценку цитостатических свойств изучаемого объекта. На разработанные методы получены патенты № 2604802 РФ «Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем» и № 2604804 РФ «Способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов с помощью клеточных тест-систем» (приложения 1 и 2).
Влияние L. plantarum на количество патогенных микроорганизмов
Результаты оценки токсического и токсигенного воздействия при биотестировании L. plantarum L-211 (В-11235) показаны на рисунках 5.10 и 5.11. В некоторых случаях проявлялось дозозависимое ингибирование жизнеспособности, т.е. с увеличением концентрации бактерий увеличивался процент мертвых животных клеток, что свидетельствует о возможном противоопухолевом действии штамма. Поскольку жизнеспособность всех линий составила более 60% и не была определена TC50, штамм безопасен в качестве пробиотика в пищевой промышленности и сельском хозяйстве.
Для определения вирулентности, токсигенности, безвредности, острой и хронической токсичности пробиотической культуры Lactobacillus plantarum L-211 было проведено 6 серий экспериментов в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.2.2.2602-10 на 140 мышах SHK – линии обоего пола. Установлено, что штамм L. plantarum L-211: - является вирулентным для белых мышей SHK – линии обоего пола при внутрибрюшинном введении в дозе 3,35108 КОЕ на 1 г массы животного; - не обладает токсигенностью для белых мышей SHK – линии обоего пола при введении максимально переносимой дозы 3,79107 КОЕ на 1 г массы животного; - не обладает токсичностью для белых мышей SHK – линии обоего пола при внутрибрюшинном введении максимальной дозы 3,35108 инактивированных клеток лактобацилл на 1 г массы животного (в 0,5 мл введенной мышам суспензии лактобацилл содержалось 1010 инактивированных клеток); - является безвредным для белых мышей SHK – линии обоего пола. При пероральном введении не была определена доза LD50, т.к. клинических признаков отравлений при введенных дозах не наблюдалось (ограничение дозы обуславливалось возможностью максимального накопления клеток штамма в биомассе при культивировании); - не обладает хронической токсичностью для белых мышей SHK – линии обоего пола в дозе (для мышей массой 14 г – 2,14106 КОЕ) при пероральном введении. При определении «хронической токсичности» у всех животных контролируемые показатели (состояние шерсти, активность, окраска слизистых, характер стула) в течение всего времени проведения опыта оставались без изменений. Все животные прибавляли в весе все время наблюдения. При вскрытии визуальных изменений внутренних органов, в том числе лимфоузлов, обнаружено не было. Все животные были здоровы.
Таким образом, подтверждены хорошая переносимость и полная безвредность культуры Lactobacillus plantarum L-211для организма мышей.
Накопленные знания о промышленно-ценных свойствах микроорганизма позволяют судить об общей активности штамма по виду, к которому он относится, а затем уже изучать его штаммоспецифические характеристики. Для молочнокислого микроорганизма Lactobacillus plantarum L-211 проведена идентификация и комплексное исследование свойств.
Изучение культуральных, морфологических и биохимических характеристик, идентификация микроорганизма с использованием тест-систем API50 CH, молекулярно-генетические исследования, в т.ч. анализ 16S рРНК последовательностей, идентификация методом ПЦР с использованием видоспецифических праймеров рибосомальных последовательностей, фингерпринт штамма позволили отнести микроорганизм к семейству Lactobacillaceae, виду Lactobacillus plantarum.
Были изучены технологические свойства штамма Lactobacillus plantarum L-211. Энергия кислотообразования за 24 ч составила 80 Т, предел кислотообразования – 140 Т (семь суток). Микроорганизм не обладает декарбоксилазной активностью аминокислот, проявляет антагонистическую активностью по отношению к тестовым штаммам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, при этом не несет плазмид разистентности, т.е. не обладает трансмиссивной антибиотикоустойчивостью.
Установлено, что пробиотические характеристики штамма способны обеспечить его выживание в пищеварительном тракте организма животного. На модельной клеточной системе пищеварительного тракта показано, что Lactobacillus plantarum L-211 характеризуется среднеадгезивными свойствами. Определена степень чувствительности бактерий к различным антибиотикам, определены МПК для некоторых распространенных антибиотиков. Проведена оценка токсичности и токсигенности штамма при биотестировании L. plantarum L-211 на клеточных тест-системах. Поскольку жизнеспособность всех линий составила более 60% и не была определена TC50, штамм безопасен в качестве пробиотика в сельском хозяйстве.
Результаты экспериментов на клеточных тест-системах подтверждены исследованиями вирулентности, токсигенности, безвредности, острой и хронической токсичности штамма L. plantarum L-211 in vivo на мышах. Подтверждены хорошая переносимость и полная безвредность культуры.