Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современные энтеросорбенты и их место в лечении и профилактике острых кишечных заболеваний 14
1.1 Энтеросорбенты в медицинской практике 14
1.2 Механизмы действия энтеросорбентов 21
ГЛАВА 2 Биотехнологические основы конструирования селективных энтеросорбционных препаратов
2.1 Методы получения селективных энтеросорбентов 25
2.2 Матрицы-носители в сорбционных системах 31
Собственные исследования 36
Глава 3 Объекты, материалы и методы 36
3.1 Объекты исследования 36
3.1.1 Бактериальный штамм 36
3.1.2 Бактериальный антиген 36
3.1.3 Лабораторные животные 37
3.1.4 Сыворотки и иммуноглобулины 37
3.1.5 Сорбционные матрицы 38
3.2 Материалы и методы исследований... 38
3.2.1 Реактивы и растворы 38
3.2.2 Питательные среды 40
3.2.3 Приборы и оборудование 40
3.2.4 Проведение осадительной коацервации 43
3.2.5 Определение концентрации белка 43
3.2.6 Определение емкости сорбционной матрицы и степени извлечения белка 43
3.2.7 Реакция диффузной преципитации по Оухтерлони 44
3.2.8 Определение токсиннейтрализующей активности 44
3.2.8.1 Постановка кожной пробы по Крейгу 44
3.2.8.2 Постановка теста отека задней конечности 45
3.2.8.3 Определение токсиннейтрализующей активности в тонком кишечнике кроликов-сосунков 46
3.2.9 Дот-иммуноанализ 46
3.2.10 Определение адсорбционной способности по метиленовому синему 46
3.2.11 Определение белок-связывающей способности 47
3.2.12 Определение сыпучести лиофилизированного специфического энтеросорбента 48
3.2.13 Определение насыпного объема и угла откоса порошка и гранулята специфического энтеросорбента 48
3.2.14 Определение потери в массе при высушивании 48
3.2.15 Определение прочности таблеток 48
3.2.16 Испытания на истираемость таблеток 49
3.2.17 Определение распадаемости таблеток специфического энтеросорбента 49
3.2.18 Статистическая обработка результатов исследований 49
Результаты и обсуждение 50
ГЛАВА 4 Разработка биотехнологической схемы получения противохолерного антитоксического энтеросорбента 50
4.1 Получение высокоактивных антитоксических сывороток и
иммуноглобулинов 50
4.1.1 Обоснование выбора адъюванта для получения высокоактивных антитоксических сывороток 53
4.1.2 Выделение иммуноглобулиновой фракции 56
4.2 Обоснование выбора и подготовка сорбционных матриц 59
4.3 Изучение эффективности иммобилизации антитоксических иммуноглобулинов на сорбционных матрицах 61
4.4 Изучение процесса десорбции иммуноглобулинов с сорбционных
4.5 Конструирование антитоксического противохолерного энтеросорбента 67
ГЛАВА 5 Изучение функциональной активности сконструированного антитоксического энтеросорбента 72
5.1 Изучение токсиннейтрализующей активности специфического энтеросорбента в тестах на лабораторных животных 72
5.1.1 Исследование токсиннейтрализующей активности специфического энтеросорбента в кожной пробе по Крейгу 72
5.1.2 Изучение токсиннейтрализующей активности в тесте отека задней конечности 74
5.1.3 Изучение токсиннейтрализующей активности в тонком кишечнике кроликов-сосунков 77
5.2 Определение общей адсорбционной способности специфического энтеросорбента по фармакологическим маркерам 80
5.3 Определение специфической активности антитоксического энтеросорбента in vitro в дот-иммуноанализе 83
5.4 Выявление корреляции результатов дот-иммуноанализа in vitro и теста по Крейгу in vivo 86 CLASS ГЛАВА 6 Разработка экспериментальной лекарственной формы выпуска специфического энтеросорбента CLASS
6.1 Лиофилизация специфического энтеросорбента и изучение технологических характеристик порошка-лиофилизата 89
6.2 Гранулирование специфического энтеросорбента 92
6.3 Таблетирование специфического энтеросорбента 93
6.4 Изучение лечебно-профилактической эффективности специфического энтеросорбента при внутрикишечном заражении биомоделей вирулентным штаммом Vibrio cholerae О1 96
ГЛАВА 7 Исследование стабильности экспериментального специфического энтеросорбента 9
7.1 Изучение стабильности антитоксического энтеросорбента в условиях, моделирующих желудочно-кишечный тракт 99
7.2 Изучение стабильности антитоксического энтеросорбента в процессе хранения
Заключение
Выводы
Список сокращений список литературы
- Механизмы действия энтеросорбентов
- Матрицы-носители в сорбционных системах
- Сыворотки и иммуноглобулины
- Обоснование выбора адъюванта для получения высокоактивных антитоксических сывороток
Введение к работе
Актуальность темы. Холера остается одной из серьезных проблем мирового здравоохранения в связи с эпидемиями на различных континентах и появлением измененных вариантов Vibrio cholerae O1 (Смирнова и др., 2012; Goel et al., 2008; Grim et al., 2010). По оценкам экспертов, ежегодно в мире от холеры погибает до 140 000 человек . Cоблюдение необходимых правил личной гигиены, безопасность источников воды, продуктов питания и наличие соответствующих санитарных условий являются основой в деле борьбы с холерой, однако добиться за короткий период времени значительного улучшения в этом направлении в эндемичных странах очень сложно. На данном этапе седьмой пандемии холеры ВОЗ и ее партнеры активно проводят оценку предлагаемых новых методов в лечении и профилактике данного конвенционного заболевания в дополнение к существующим традиционным мерам патогенетической и этиотропной терапии ( /pdf_file/0007/127618/9244594218R.pdf).
В последнее время для лечения и профилактики ряда инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) широко применяются энтеросорбенты, которые являются перспективным лекарственным средством патогенетической терапии (Николаев и др., 2007; Учайкин и др., 2007; Новокшонов и др., 2009). Энтеросорбенты устраняют и (или) ослабляют токсико-аллергические реакции, снижают метаболическую нагрузку на органы экскреции и детоксикации, корректируют процессы обмена веществ, восстанавливают целостность и проницаемость слизистых оболочек (Никонов и др., 2006). Однако применение неселективных энтеросорбентов ограничивает их способность сорбировать токсины и микробные клетки в связи с отсутствием специфической нейтрализации токсических веществ.
Степень разработанности проблемы. При разработке новых энтеросорбентов ключевым моментом является конструирование специфических стабильных препаратов, выполняющих не только свои «очищающие» функции, но и способных осуществлять функции носителя для доставки, выделения и пролонгации действия биологически активных целевых продуктов. В практику здравоохранения внедрены сорбционные препараты направленного действия, позволяющие не только эффективно детоксицировать организм, но и восстанавливать нормальную микрофлору ЖКТ за счет дополнительной колонизационной функции (Бородин и др., 1998; Нагорная и др., 2005; Новокшонов и др., 2011), повышать эффективность терапии хронических гастритов (Лосева и др., 2007; Бурмистров и др., 2014), восстанавливать функции печени (Коненков и др., 2008; Сухотерина, 2007). Несмотря на большой ассортимент направленно действующих энтеросорбентов (СУМС-1, СИАЛ-С, Ноолит, Эко-Сорб, Биосорб, Панзисорб и др.), на сегодняшний день не существует технологии изготовления специфических
энтеросорбционных препаратов для эффективной внутрикишечной нейтрализации экзотоксина холерного вибриона для лечения и/или экстренной иммунопрофилактики холеры, что определило актуальность диссертационного исследования.
Цель работы - разработка экспериментальной биотехнологии получения
противохолерного антитоксического энтеросорбционного препарата, характеризующегося направленной сорбцией холерного токсина в кишечнике.
Задачи исследования:
1. Оптимизировать схему иммунизации кроликов-продуцентов и получить активные
антитоксические сыворотки для выделения специфических иммуноглобулинов как
структурного компонента иммуноэнтеросорбента.
2. Экспериментально обосновать выбор наиболее эффективной и технологичной
сорбционной матрицы. Определить оптимальные условия иммобилизации антитоксических
иммуноглобулинов на выбранных сорбционных носителях.
3. В тестах in vivo и in vitro провести анализ сорбционных свойств полученного
противохолерного иммуноэнтеросорбента.
4. Оценить возможность применения дот-иммуноанализа с использованием
диагностикума на основе белка А, меченного наночастицами коллоидного золота, для
определения специфической активности антитоксического иммуноэнтеросорбента.
5. Разработать стабильную лекарственную форму антитоксического
иммуноэнтеросорбента. В долгосрочных испытаниях изучить стабильность препарата
антитоксического иммуноэнтеросорбента при хранении и установить его срок годности.
Научная новизна и теоретическая значимость работы.
Впервые сконструирован специфический противохолерный антитоксический
энтеросорбент для интраинтестинальной нейтрализации холерного экзотоксина и
охарактеризованы его физико-химические и биологические свойства. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность применения полисахарида хитозана в качестве сорбционной матрицы для антитоксических иммуноглобулинов. Разработан комплекс методов оценки токсиннейтрализующих свойств и общей адсорбционной способности сконструированного иммуноэнтеросорбента. В тестах in vivo показана способность специфического энтеросорбента нейтрализовать холерный токсин. Разработан методический подход для оценки специфической активности противохолерного энтеросорбента in vitro в дот-иммуноанализе с использованием диагностикума на основе белка А, меченного наночастицами коллоидного золота. Научно обоснована технология получения стабильной лекарственной формы противохолерного иммуноэнтеросорбента – таблетки, покрытой кишечнорастворимой оболочкой, обеспечивающей направленность доставки активного компонента к месту
локализации патологического процесса. Получены данные о стабильности противохолерного энтеросорбента в процессе хранения и установлен срок годности.
Практическая значимость работы. Разработана стабильная лекарственная форма антитоксического иммуноэнтеросорбента для применения при экстренных лечебно-профилактических мероприятиях в очагах холеры.
По результатам исследований разработаны методические рекомендации «Получение
специфических противохолерных энтеросорбентов на основе хитозана и полисорба» и
«Определение функциональной активности специфического противохолерного
энтеросорбента» (утверждены директором института 20.05.2014, протокол № 3 и 28.04.2015, протокол № 3).
Подана заявка на изобретение №2015131239, приоритет 27.07.2015 «Энтеросорбент для направленной сорбции холерного экзотоксина, лекарственная форма энтеросорбента для направленной сорбции холерного токсина».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная экспериментальная технология позволяет получать противохолерный иммуноэнтеросорбент, обладающий нейтрализующей активностью в отношении холерного экзотоксина.
-
Оптимизированная схема иммунизации продуцентов с использованием в качестве адъюванта низкомолекулярного хитозана позволяет получать высокоактивные антитоксические сыворотки для выделения специфических иммуноглобулинов – активного компонента противохолерного иммуноэнтеросорбента.
3. Высокомолекулярный хитозан является эффективной матрицей для обратимой
сорбции антитоксических иммуноглобулинов, сохраняя после иммобилизации белкового
компонента собственную адсорбционную активность.
4. Антитоксический иммуноэнтеросорбент в дозе 1000 мг защищает опытных животных
от заболевания холерой при внутрикишечном заражении вирулентным штаммом Vibrio сholerae
569В О1 серогруппы в заражающей дозе 1105 м.к./мл.
5. Разработанная лекарственная форма противохолерного иммуноэнтеросорбента –
таблетка, покрытая кишечнорастворимой оболочкой, обеспечивает стабильность препарата при
хранении (срок наблюдения – 2 года).
Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных исследователей по вопросам получения антитоксического иммуноглобулина – специфического компонента противохолерного препарата, подбора эффективных сорбционных матриц; оценки антитоксической и общей сорбционной активности специфического энтеросорбента; методам получения стабильной лекарственной формы энтеросорбента и оценки качества конечного препарата. Основу данного исследования составляют комплексный
анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы. При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа. Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволил обеспечить объективность полученных выводов и результатов.
Работа выполнена в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках плановых научно-
исследовательских тем: 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации 0120.0853923) и 48-2-14 «Разработка и внедрение в производство МИБП новых решений, направленных на повышение качества препаратов и эффективности технологических процессов» (номер госрегистрации 01201457722).
Апробация работы. Материалы исследования были представлены на: научно-практической конференции Роспотребнадзора «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 2012); Х съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); Совещании проблемной комиссии 48.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2014); Проблемной комиссии (48.04) Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2012, 2013, 2015); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Новые достижения молодых ученых в эпидемиологии, клинике, диагностике, лечении и профилактике инфекционных болезней» (Москва, 2012); Всероссийской школе-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Химия биологически активных веществ» (Саратов, 2012); IX Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Саратов, 2012); ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2012, 2013, 2014, 2015).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 работ, из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах из списка ВАК.
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в проведении анализа научной литературы, планировании экспериментов, получении и обработке экспериментальных
данных. Лично автором выполнены исследования по получению антитоксических сывороток и выделению из них специфического иммуноглобулина; подбору сорбционных матриц-носителей; получению микрочастиц хитозана; конструированию противохолерного энтеросорбента; исследованию его функциональных свойств в опытах на животных и in vitro; изучению стабильности сконструированного лечебно-профилактического препарата и определению его срока годности в долгосрочных испытаниях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 260 источников, 46 из которых зарубежные. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает 21 таблицу, 12 рисунков.
Механизмы действия энтеросорбентов
Острые кишечные инфекции (ОКИ) являются одной из серьезных проблем в мировом и отечественном здравоохранении, занимая в структуре инфекционной заболеваемости населения второе место после острых респираторно-вирусных инфекций [113]. Уровень заболеваемости ОКИ остается достаточно высоким без тенденции к отчетливому снижению, более того, зарегистрировано появление но вых сероваров патогенных бактерий, таких как энтерогеморрагическая Escherichia coli О157, Shigella flexneri 2a, обусловливающих тяжелое течение болезней, вплоть до летальных исходов [161, 214]. Отмечено выделение нети пичных штаммов V.cholerae О1, обладающих высоким пандемическим потенциа лом, что обеспечивается высокой адаптацией к условиям внешней среды и повы шенной вирулентностью, которая выражается в более тяжелом течении заболева ния с высоким показателем летальности [7, 161, 195]. Вопросы этиопатогенетической терапии ОКИ сохраняют актуальность в связи с их повсеместным распространением [115, 212], утяжелением клинического течения отдельных нозологических форм, развитием резистентности возбудителей к традиционно применяемым этиотропным препаратам [173]. Широкое и бесконтрольное применение антибактериальных средств часто оказывается не только малоэффективным, но и сопровождается отрицательными побочными эффектами с неблагоприятными последствиями для организма больного [170].
В настоящее время все больше внимания уделяется созданию средств, позволяющих отказаться в ряде случаев от традиционно применяемых в лечении антибактериальных препаратов за счет усиления патогенетической терапии, исходя из принципа минимального неблагоприятного воздействия на организм больного. С этой точки зрения несомненный интерес представляют энтеросорбенты, которые сегодня являются обязательным компонентом комплексной терапии различных патологических состояний, сопровождающихся эндо– и экзотоксикозами. В практике инфекциониста при ОКИ наиболее часто энтеросорбцию используют как этиопатогенетический способ терапии [14, 184]. Это основано на способности сорбентов поглощать из многокомпонентных растворов эндо- и экзотоксины макро- и мезопорами, а так же фиксировать на своей поверхности возбудителей бактериальной и вирусной природы, таким образом оказывая этиотропный эффект. Практически не изменяя состав нормальной кишечной микрофлоры, энтеросор-бенты связывают токсические продукты, образующиеся в кишечнике [13, 14, 166]. По мнению ряда исследователей [91, 92, 109, 213], в патогенетической терапии наиболее важен детоксикационный эффект энтеросорбции, связанный с поглощением токсических продуктов, не только образующихся в кишечнике, но и секре-тируемых в кишечник. Термин «энтеросорбция» был предложен В.Г. Николаевым (ИЭПОР) в 1983 г. для обозначения нового метода сорбционной терапии, состоявшего в ежедневном пероральном приеме значительных доз (20–50 г.) высокоактивных синтетических углей сферической грануляции, полученных путем пиролитической обработки различных полимерных смол [108, 243, 244]. При использовании именно этого высококачественного и довольно дорогостоящего сорбционного материала были получены все первоначальные клинические результаты. Этот препарат стал своего рода золотым стандартом для проведения дальнейших исследований в области энтеросорбции [243]. Ранее название «энте-росорбенты» применялось для обозначения строго определенной группы углеродных сорбентов со свойственными им механизмами лечебного действия и схемами применения, в дальнейшем оно стало использоваться в отношении большего числа препаратов и пищевых добавок, способных связывать в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) токсические вещества и метаболиты [108, 243].
Сегодня метод энтеросорбции в широком его понимании – это применение с лечебной или профилактической целью препаратов, способных связывать в пищеварительном тракте и выводить из организма различные экзогенные вещества, микроорганизмы и их токсины, антигены, эндогенные промежуточные и конечные продукты метаболизма, накапливающиеся или проникающие в полость ЖКТ в ходе течения патологического процесса, что позволяет использовать энтеросор-бенты как при острых, так и хронических заболеваниях, сопровождающихся интоксикацией, нарушением пищеварения, метаболическими расстройствами [116, 121, 183, 191, 208].
При острых кишечных инфекционных болезнях основные клинические проявления определяет синдром поражения ЖКТ [212]. Параллельно с ним могут наблюдаться разной степени выраженности интоксикации, являющейся реакцией макроорганизма на возбудителя инфекционного заболевания.
Для большинства ОКИ характерна диарея, тип которой определяют факторы патогенности и однотипный для групп возбудителей ОКИ пусковой механизм ее развития и инфекционного процесса в целом [260]. На этом основании выделяют четыре типа диарей: инвазивные, секреторные, осмотические и смешанного типа. Данная классификация, предложенная ВОЗ [258], имеет важное значение для проведения рациональной этиопатогенетически обоснованной терапии ОКИ еще до получения результатов лабораторных исследований [14, 210, 218].
Особенности клинического течения заболевания и тяжесть состояния пациентов с ОКИ в значительной степени обусловлены интоксикационным синдромом [212]. Спектр клинических проявлений интоксикации достаточно широк и зависит от причинного фактора, количества токсина, его вида, тропности токсического агента к определенным органам и тканям, состояния иммунной системы организма и специфики ответа [121, 160, 202]. Все это обусловливает нарушения функционально-адаптационных процессов во многих органах и системах, которые сопровождаются изменениями гемодинамики, гемостаза, ферментативным и гормональным сдвигом, гомеостатическим расстройством [64, 214]. В связи с этим применение энтеросорбентов при лечении ОКИ является необходимым [120, 202].
Обязательным условием терапевтической эффективности энтеросорбентов является их назначение как можно в более ранние сроки болезни [38, 63, 93, 209]. Применение их с первого дня болезни значительно улучшает исход заболевания, особенно у детей раннего возраста [80, 184]. Предполагают, что использование энтеросорбентов в терапии ОКИ в ранние сроки за счет сорбции экзотоксинов патогенных бактерий, например, некротоксина клостридий, шига-токсина энтероге-моррагических эшерихий и др. может предупредить развитие тяжелых осложнений язвенно-некротического характера в кишечнике или гемолитико-уремического синдрома [137, 211]. Кроме того, по мнению А.А. Новокшонова с соавт. [110], монотерапия энтеросорбентом Фильтрум-СТИ является более эффективной, чем классическое лечение антибиотическими препаратами. Авторы отмечают, что «высокая антибактериальная активность энтеросорбента не только способствует санации желудочно-кишечного тракта, но и может оказывать опосредованное иммуномодулирующее действие за счет детоксикации и предупреждения антигенной перегрузки иммунной системы...». Таким образом, при совместном использовании энтеросорбентов и этиотропных препаратов в комбинированной терапии среднетяжелых форм ОКИ можно существенно повысить лечебный эффект [58, 137, 185].
Матрицы-носители в сорбционных системах
Энтеросорбенты, как и многие другие вещества, обладающие терапевтической эффективностью, претерпевают определенную эволюцию. Тенденции в развитии производства препаратов для энтеросорбции зависят от технологических возможностей двух конкурирующих направлений: методов детоксикации и метаболической коррекции [81].
Современная биотехнология предусматривает разработку сорбционных материалов с целью дальнейшего их использования при конструировании высокоэффективных препаратов для гемо- и энтеросорбции, препаратов иммобилизованных ферментов, тест-систем для иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализа [23, 53, 57, 106]. Для медицинской биотехнологии актуальной является разработка сорбционных материалов с заданными свойствами и дальнейшее их применение в качестве специфических материалов для энтеросорбции [186].
Применяемые приемы и методы, используемые при конструировании селективных энтеросорбентов, достаточно разнообразны. Н.Т. Картель [72, 73] предложил способ создания селективных сорбционных материалов с помощью регулирования размеров пор (молекулярная сорбция на основе ситового принципа), то есть поры сорбентов должны быть сопоставимы с размерами извлекаемых молекул из жидкой фазы, и чем меньше будут размеры первичных «строительных» блоков-наночастиц, тем эффективнее будет «работать» сорбционный материал [13, 175].
Учитывая химическую природу поверхности сорбентов, в 90-х годах прошлого века специалистами ГНЦ ВБ «Вектор» при проведении высокотемпературного пиролиза углеводородов на механически прочной минеральной наномат-рице оксида алюминия с заданной мезо- и макропористой структурой был полу 26 чен препарат СУМС-1 [139, 140, 141]. Созданный энтеро- и гемосорбент позволяет осуществлять процессы сорбции как гидрофильных и гидрофобных веществ, так целых клеток с гидрофильно-гидрофобной природой.
Известны способы модифицирования сорбентов медицинского назначения путем введения в углеродную матрицу азота, серы и других гетероатомов [102, 151] для усиления ионообменных и окислительно-восстановительных свойств углей и создания на их поверхности различных кислородсодержащих групп [163]. Данные материалы востребованы в одном из наиболее эффективных способов сорбционной детоксикации – гемосорбции, для применения которой необходимо располагать широким ассортиментом адсорбентов, обладающих высокой удельной поверхностью, нетоксичностью и биосовместимостью.
В настоящее время для получения селективных (специфических) энтеро-сорбционных препаратов в основном применяется технология, заимствованная из прикладной энзимологии – технология физической иммобилизации, которая является наиболее доступным из существующих способов модификации [181]. Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Э. Гриффин провели успешную иммобилизацию инвертазы путем адсорбции на активированном угле и геле гидроксида алюминия, о чем есть упоминание в работе Т.А. Егоровой с соавт. [50].
Иммобилизация – это закрепление вещества на поверхности матрицы (носителя). Физическая иммобилизация представляет собой включение вещества в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объёма. При физической иммобилизации вещество не связано с носителем ковалентными связями. Существует 4 типа связывания: адсорбция на нерастворимых носителях; включение в поры геля; пространственное отделение вещества от остального объёма реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны); включение в двухфазную среду, где вещество растворимо и может находиться только в одной из фаз.
В целях получения селективных энтеросорбентов в основном используется адсорбционная иммобилизация. Удерживание адсорбированной молекулы на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических вандерваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами вещества [37]. Вклад каждого из типов связывания зависит от природы носителя и функциональных групп на поверхности [126]. Взаимодействия с носителем могут быть настолько сильными, что адсорбция может сопровождаться разрушением структуры [50]. Одним из преимуществ адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в качестве носителей [150].
Адсорбционная иммобилизация активного компонента на поверхности сорб-ционной матрицы должна осуществляться только при условии его обратимой сорбции в определенных условиях [133]. По этому принципу сконструированы многие препараты, используемые в медицинской практике. Например, литийсо-держащий энтеросорбент Ноолит [129], в котором соединение лития закреплено путем физической адсорбции на поверхности оксида алюминия с определенной заданной пористой структурой и «замуровано» в порах матрицы пленкой крем-нийорганического полимера. Такой технологический прием способствует сохранению высокой биологической активности закрепленного соединения лития в течение продолжительного времени, создавая местное «депо» лекарственного препарата лития в терапевтической зоне за счет его постепенной частичной (дозированной) десорбции с поверхности. Таким образом, энтеросорбент по мере продвижения по ЖКТ выполняет свое детоксицирующие назначение, обеспечивая пролонгированный выход лекарственного препарата лития со своей поверхности, при этом исключается опасность передозировки лекарственного препарата [142].
Модификация поверхности минералуглеродных и кремниевых сорбционных матриц СУМС-1 и СИАЛ-С комплексом серебра (нанокластерами) придает им бактерицидные свойства, что приводит к увеличению терапевтической эффективности сорбционных материалов в комплексной терапии ряда заболеваний, в частности, в терапии хронических гастритов, в том числе ассоциированных с Helico-bacter pylori [27]. Под влиянием энтеросорбции серебросодержащими сорбентами значительно снижается активность церулоплазмина как белка острой фазы, что выражается в противовоспалительном эффекте энтеросорбентов [77, 88].
Сыворотки и иммуноглобулины
Изучение сорбции белка в зависимости от времени контакта матрицы с активным компонентов показало, что в случае иммобилизации белка на матрице Полисорб-МП в первый час от момента контакта с раствором иммуноглобулина происходит резкое увеличение концентрации белка в фазе сорбента – до 81,2±1,3%. В следующие 2 ч белок сорбируется постепенно, достигая максимума в структуре матрицы через 4 ч экспозиции (Таблица 7). В дальнейшие 3 ч контакта значительных изменений концентрации иммуноглобулинов в фазе матрицы не наблюдали.
При сорбции иммуноглобулина на хитозане наблюдали динамику постепенного увеличения концентрации белка в фазе сорбента. Первые 2 ч иммобилизации характеризовались частичной (18,4±0,5%) сорбцией общей концентрации белка. Через 5 ч инкубации реакционных смесей было зарегистрировано резкое увеличение концентрации белка в фазе сорбента на 64,0±2,6% от всего загружаемого белка. Следующие 2 ч характеризовались постепенной сорбцией части белка в растворе, достигая максимума к 6 ч времени экспозиции (Таблица 7). Следующий час контакта не привел к значительному изменению концентрации иммуноглобулинов в фазе сорбента.
При исследовании количественной зависимости иммобилизованного белка от времени взаимодействия сорбционной матрицы с раствором сорбата определено, что оптимальное время проведения иммобилизации белка составляет для Поли-сорба-МП 4–5 ч, для хитозана – 6–7 ч. Уменьшение времени контакта приводит к неполной сорбции активного компонента, увеличение времени контакта не дает существенного положительного эффекта. Таблица 7 – Эффективность иммобилизации иммуноглобулинов на матрицах в зависимости от времени контакта сорбента с раствором белка
В системе сорбент - активный компонент в зависимости от условий могут происходить процессы адсорбции или десорбции активного компонента с поверхности матрицы. В связи с этим, следующий этап работы был посвящен изучению десорбции иммуноглобулинов в динамическом режиме.
Для эксперимента использовали 0,01 М раствор фосфатного буфера рН 7,3±1,0, соответствующий значению рН среды нижних отделов тонкого кишечника человека. В химическую посуду с раствором указанного буфера добавляли 1 г сорбента с сорбированными иммуноглобулинами в максимальной концентрации по степени извлечения белка. Образцы инкубировали в течение 24 ч при температуре 37±1 С. Пробы отбирали через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 16 и 24 ч и определяли количество десорбированного белка спектрофотометрически при двух длинах волн 260 и 280 нм по формуле (1) (п. 3.2, п.п 3.2.5).
На матрице Полисорб-МП через 2 ч экспозиции наблюдали незначительную десорбцию иммуноглобулинов, концентрация белка составляла 5,1 – 8,5 мг на 1 г сорбента. В дальнейшем концентрация иммуноглобулинов в растворе практически не изменялось (Рисунок 2).
В опыте с матрицей хитозан установлено, что за первые 1–2 ч с сорбента высвобождалось 36,24 – 45,2 мг белка с 1 г сорбента, что, вероятно, обусловлено непрочными ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями и водородными связями, легко разрушаемыми изменением рН и повышением температуры среды. Максимальная десорбция достигалась в следующие 2 ч (4 ч от начала эксперимента) и составляла 48,96 мг белка на 1 г сорбента. Дальнейшее увеличение времени экспозиции не приводило к существенным изменениям концентрации иммуноглобулинов в растворе (Рисунок 2).
Иммобилизацию специфического белка на хитозановой матрице проводили в мягких условиях, позволяющих максимально сохранить активность иммуноглобулина при высокой сорбционной способности матрицы. Таким условиям соответствовали: значение рН 5,3±1,0 и температура в диапазоне от 25 до 37 С. Отклонение рН на 1-2 единицы от изоэлектрической точки иммуноглобулина и небольшой нагрев реакционной смеси приводят к обратимым изменениям третичной структуры белковой глобулы, повышению ее гидрофобности, в результате чего происходит более прочное связывание белка с сорбционной матрицей.
Адсорбцию проводили следующим образом. В химическую посуду к 1 г сорбента добавляли раствор иммуноглобулина с содержанием белка, соответствующим максимальной степени его извлечения сорбентом. В данном случае эта величина соответствовала 80,3±3,6 мг/г, как указано в п. 4.3, Таблице 7. Полученный объем системы доводили до 5 мл 0,01 М раствором ФСБ рН 7,3±0,1, значение рН смеси соответствовало 5,3±1,0.
Смесь помещали на магнитную мешалку с подогревом при 150 об/мин на 6 ч при температуре 35±2 С. После взаимодействия твердую фазу отделяли центрифугированием при 14 тыс. об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок представлял собой специфический энтеросорбент. Контроль эффективности иммобилизации проводили путем определения концентрации остаточного белка в супер-натанте спектрофотометрически по формуле (1) (п.3.2., п.п. 3.2.5). Установлено, что потери белка при иммобилизации составляли не более 7,45±0,12% от начальной концентрации загруженного белка в систему матрица-белок (Таблица 8).
Обоснование выбора адъюванта для получения высокоактивных антитоксических сывороток
С целью принятия решения о виде готовой лекарственной формы энтеро-собента было необходимо изучить технологические характеристики лиофилизи-рованной субстанции: форму и размер частиц, распределение частиц по размеру, насыпную плотность, сыпучесть (текучесть), угол естественного откоса, потерю в массе при высушивании.
Ситовой анализ – это определение фракционного состава или распределения по размерам частиц порошков и гранул просеиванием через сита. Ситовой анализ порошков проводили с использованием автоматического процесса просеивания образца сыпучего материала через набор сит с отверстиями различного размера с использованием анализатора BA 200N: 2500, 1000, 500, 112, дно. Просеивание проводили в течение 5 мин при амплитуде, равной 1,5. В результате проведенных исследований выявлено, что распределение частиц по размеру в лиофилизате энтрособента, определенное ситовым методом (п. 3.2.13), составляло следующие величины: пыль – 38; 112-500 мкм – 40 %; 500 мкм-1,0 мм – 12 %; 1,0-2,5 мм – 5%; 2,5 мм – 5%.
Степень сыпучести лекарственных порошков характеризуется следующими критериями: сыпучесть (скорость протекания порошка через отверстие); насыпной объем (плотность); угол естественного откоса. Для определения сыпучести в сухую воронку, выходное отверстие которой закрыто заслонкой, помещали без уплотнения навеску испытуемого вещества массой 50 г, взвешенную с точностью до 0,01 г. Включали виброустройство и через 20 с открывали заслонку. Определяли время, необходимое для полного истечения испытуемого вещества из воронки. Сыпучесть рассчитывали по формуле, приведенной в п. 3.2.12. Выявлено значение сыпучести (текучести), равное 0.
Для определения насыпной плотности порошков навеску образца с заранее измеренной массой помещали в градуированный цилиндр вместимостью 100 мл. Отношение массы навески к заполненному объему (V0) цилиндра являлось насыпной плотностью до утряски. После проведения утряски на приборе SVM-10 при количестве встряхиваний последовательно 500, 750 и 1250 измеряли заполненный объем цилиндра (Vк) и определяли насыпную плотность после утряски. Насыпная плотность (до/после утряски) составила 0,04/0,05 г/см3.
Угол естественного откоса , образующийся при насыпании материала горкой в виде конуса, определяли с использованием прибора, конструкция которого на рисунке 9. Рисунок 9 – Прибор для определения угла естественного откоса: 1 – сборник; 2 – пластина; 3 – шкала; 4 – исследуемый материал; 5 – визирная линейка Выявленная величина угла естественного откоса, равная 65, и значение сыпучести, равное 0, свидетельствовали о крайне низкой сыпучести лофилизированного материала [193]. Потеря в массе при высушивании составила 1,1±0,3%. На основании изучения технологических характеристик порошка лиофилизата можно сделать вывод, что данная субстанция является крайне неод 93 нородной по фракционному составу, при этом очень большое количество лиофи-лизата находится в виде пыли. Неудовлетворительные показатели сыпучести, насыпной плотности и угла естественного откоса обусловливают непригодность такой субстанции для получения готовой лекарственной формы, в связи с чем, необходимо было получить субстанцию в виде гранулята.
Анализ данных литературы показал на достаточное широкое применение в технологиях гранулирования таких вспомогательных веществ, как целлюлоза микрокристаллическая и лактозы моногидрат, а в качестве связующего вещества – водных растворов полливинилпиролидона. Мы остановили свой выбор на следующей рецептуре, рекомендованной рядом исследователей: по 50 массовых % микрокристаллической целлюлозы и лактозы [41, 111, 246], а в качестве связующего - 10% раствор поливинпирролидона (Plasdone K90) [41, 111].
Гранулирование специфического энтеросорбента проводили на аппарате GPCG 2 LabSystem, реализующем гранулирование материалов методом псевдо-ожиженного слоя с подачей связующего вещества сверху. Использовали технологические режимы, обоснованные Комиссаровым А.В. с соавт. при проведении исследований холерной химической вакцины [41, 111].
После гранулирования энтеросорбента (Рисунок 10) проводили изучение технологических характеристик гранулята аналогично п. 6.1 настоящего исследования: форма и размер частиц, распределение частиц по размеру, насыпная плотность, сыпучесть, угол естественного откоса, потеря в массе при высушивании.