Введение к работе
Актуальность. Проблемы, бискатализа и бистрансфСрмации органических зоедннений приобретают ведущее значение для современной биотехнологии и :межных отраслей науки (Березин, 1978; Березин и др., 1S87; Егоров и до., 1357; члессв. 1S8S). Успехи з этой области определили создание и развитие нч только ювых направлений науки, но также разработку и широкое практическое грименение высокоэффективных способов для получения знтибистикса, іимтаминов. аминокислот; гормонов, сахаристых и многих других прод'/ктез Васильев, 1988: В'/даорд, 1988: Yamamoto. 1983r Ducnene. 19SC).
Анализ технико-экономичеооес показателей-использоагаия биокатализа и іиотранофсрмации, осуществляемых в основном с использован нем іммсбилизованньїх клеток (ИК) и ферментов (ИФ) микроорганизмов, показьааат їх нерспаримыет преимущества как перед химическим катализам, так и микробиологическим синезоМ.
Эффективное применение биокатализа лежит в ochoss новых прогрессивных управлений биотехнологии, разработки непрерывных и безотходных произзедстз : наименьшими затратами сырьевых и энергетических ресурсез.
В этом отношении важное значение приобретает использование более гфсректизных и технологичных зкетремофильныхбиокатапизаторзз, особенно их іммобилизезанньіх форм, открытие и применение которых есстааили нозуо эсу ас многих отраслях науки и промышленности. Перспективы их научно-практического іспопьзоваиия определяются более экономичными показателями, для создания и Гнтенсификации непрерывных процессоа и фактически безотходных технологий. Зместе с тем, существующие методы иммобилизации клеток микробов не юзооляот получать биокаталйзаторы с высокой активностью и стабильностью. ITQ в значительней мере связано с тем, что они в большинстве случаев ссназзны іа применении так называемых банальных м'икроодганизмса. а иммобилизация леток и ферментов, как празило, ссуазсталяется с использованием неприродных убстратоа.
Настоящее исследование песеящено изучению, получению и испельзезанио 1.К и И ркстремофильных форм микроорганнзмба и изучению этих прсцессоз для ыработки различных физиологически активных соединений - L- и D--іспарагиновсЯ кислот. L-аланина, L-яблочной кислоты. L-теанина и разл'-ных 1инейных и циклических алигосахзридсв. В отих исследованиях глазной целевой станезкой явилась разработка на сенега природных субстратов нозых методических подходов по проблеме ."Иммобилизованные клетки и ферменты микроорганизмов" и изыскание путей стабилизации их специфической акт^с. :rr-i, частности, в экстремальных условия;; среды. Разработанные методы ткрызают новые перспектизы дт.я получения многих физиологически актиа«ых ездинений и продуктов с использозанием иммобилизованных б^скатализаторез.
Ряд разделов данной работы выполнялся в рамках целевых комплексных программ по получение белковых и сахаристых продуктов, б частности программе 'Топинамбур".
Состояние яопрпса. Становление научно-практической области применения иммобилизованных биокатализаторов обычно относят к 60-ым годам нашего столетия. Однако, в бродильной промышленности эмпирически давно практиковались приемы иммобилизации клеток дрожжей и уксуснокислых бактерий при выработке вин. уксуса и спирта. С 1969-70 гг., после известных работ по использовании микробных аминоацилаз для получения оптически активных аминокислот (Chibata et а!.. 1976). достигнуты большие успехи как по разработке новых методов, так и в области практического использования ИК и ИФ микзоорганизмов. Крупные успехи достигнуты в производстве аминокислот. антибиотиков, органических кислот, витаминов, гормонов и многих других биологически активных веществ (Клесов, 193S; Вудворд, 198В; Klein, Kressdorf, 1S85: Berset, 1988: Hartmeier. 1988; Apolinary, Rapak, 1988; Yamamoto, 198ft 1995; D'Souza, 198Э; Korpela et ai., 1989).
Клетки Є.со/івключенные в каррагинан, с успехом использованы для непрерывного синтеза L-аспарагиновой кислоты (Sato et al.,1979; Tosa et a!.,1979; Takamatsu et al.,! 984; Chibata et a!.,1956). Процесс полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Промышленным способом получает также L-аланин из L-аспарагиновой кислоты с помощью иммобилизованных в каррагинан клеток Pseudo/nonasdaom/7as(Yamama\o etal.,1980; Takamatsu et a!., 1981). Спомощьо ИК Brew'bacteritim fiavumи Brevibacterium аттоліадепес Фирма 'Танабэ Сейяку" получала ежегодно до 100 т L-яблочной кислоты (Yamamoto et al., 1976; Chibata et al.,19S4). Получение L-аспарагиновой и L-fl5noMHof кислот разрабатывалось также советскими исследователями (Березин и др.,1979 Зуева и др!,1984; 1935: Веревкин и др.. 1988-1990).
Однако, предложенные методы - наряду с положительными качествами -имеют и свои недостатки. Так, после иммобилизации клетки сохраняют в лучшем случае лишь 52% активности от исходной и требуют дополнительной активации до или после иммобилизации, что намного удлиняет и усложняет процесс. Кроме того, в конечном продукте обнаруживается побочные вещества, что понижает степень трансформации и требует дополнительных усилий для очистки целевого продукта. В ряде случаев стабильность биокатализаторов очень низкая, что делает неэкономичным их использование.
Следует также отметить, что определенные трудности создания высокозфэктивных биокатализаторав с инулиназной и цикломалотодекстрин глхжанотранареразной активностями препятствуют промышленному освоению методов получения глюкозо-фруктозного сиропа из инулина и циклодекстриноз и: крахмала в проточных услоаиях. Развитие работ в указанном направлении безусловно связано с наличием высокоэффективных штаммов-продуцентов ферментов, особенно экстремофилов, а также с разработкой новых методов
чмобилизации. позволяющих создавать биокатапизаторы с высокой сгивностью и стабильностью. В этой связи в наших исследованиях использован чд активных продуцентов ферментов из групп неспороносных и спорообразующих іктрий, а также дрожжей, что позволяет рекомендовать разработанные методы пя широкого круга микроорганизмов.
На основании анализа опубликованных работ по рассматриваемой проблеме учетом практических задач сформулированы и основные цели и задачи ^следования.
Цель и г.апачи работы. Основной целью настоящей работы была разработка ысскоактивных и стабильно функционирующих систем биокатализатсров для ыработки некоторых физиологически активных соединений методом «трансформации на основе экстремофильных форм микроорганизмов. Для остижения поставленной цели необходимо было разрешить ряд задач, тавными из которых являются следующие:
изыскание новых носителей из природных соединений, обеспечивающих =)сокую активность и стабильность иммобилизованных клеток и ферментов икроорганизмов:
разработка безносительных способов иммобилизации клеток, позволяющих эздавать мультиферментные системы, пригодные к использованию в проточных, частночти экстремальных условиях:
выделение, очистка и исследование некоторых физико-химических и «химических свойств фумарат-гидратазы. L-аспартат-аммиак-лиазы. L-гпартат-В-декарбоксилазы. инулиназы, цикломальтодекстрин -цоканотрансшеразы, гпутаминазы и (3-фруктсфуранозидазы:
изучение кинетики процессов получения L- и D-аспарагиновой кислот. L-панина, L-яблочной кислоты. L-теанина. различных фрукта- и ' іпахтоолигосахаридов, а также циклодекстринов с помощью иммобилизованных «катализаторов:
разработка одностадийного получения L-аланина из фумаровой кислоты іферментньїм биокатализатором:
разработка основ технологии получения вышеуказанных соединений с эмощью интактных и иммобилизованных ферментов и клеток микроорганизмов
Научная новизна ппботы Впервые показана возможность иммобилизации іеток'и Ферментов на полисахариде микробного происхождения - аубазидане. а зкже инулине. Выделены и изучены внеклеточные полисахарида Oyproccccus /юсу// и Cr./aurentii Показано, что они могут служить матрицами для -^мобилизации ферментов.
Выявлено, что добавление циклодекстринов к носителям природного зоисхождения намного увеличивает их связывающую способность и содействуе
более высокому проценту сохранения активности при иммобилизации ферментов методом ковалентного связывания.
Разработаны новые способы модифицирования силикагеля-методом хемоссрбции акоилокитрипа и получения безмосительных биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов с высокой активностью и стабильностью. Показано что данный биокатализатор может с успехом применяться для получения мультиферментных биокатализаторов, которые зполне пригодны для .использования в проточных условиях, включая процессы, где субстратом служит 'высокомолекулярное соединение.
Выявлены особенности и оптимизированы процессы термечтативно-мнкосбиологического получения L- и D-аспарагиновой кислот. L-апанина. L-яолочиой кислоты. L-теанина. р-циклодекстрина и глюкозо-фоу'ктоэного сиропа с .помощью поедварительно стабилизированных и иммобилизованных клеток и ферментов оригинальных культур микроорганизмов.
Впервые выявлены продуценты цикломапьтодекстрин глюканотранарераз сэеди гапофилоных баципл и термоактиномицетов.
Выявлены характерные особенности цикломальтодекстрин глюканэтванарерзз различных групп микроорганизмов и предложена модель механизма действия цикломальтодекстрин глюкамотрансфераз. обнаружены и охарактеризованы изофевменты цикломальтодекстрин глоконотрансфераз.
Впервые выявлены особенности получения а-цикподекстрина в условиях ультоаоильтоаиионных мембран и.обнаружены специфические комплексообразователи для у-циклодекстрина.
Разработаны научно-методические подходы ферментативной перзрабст ки
молочной сыворотки с целью получения галактоалигосахаоияного подсластител!
и фрухтозо-концевых глаканов и фруктоолигосзхзридов с использованием
цикломальтодекстрин глюканотрзнсфоразы и (і-фруктозофуранозидазьі.
соответственно.
Изучен пооиесс синтеза лактосахарозы с помощью (i-фруктофуранозиаазы и инзертнзы.Впервые получены некоторые производные циклодекстринов и их попимео^ых Форм и использованы в условиях 7СХ. ГЖХ и БЭЖХ в качестве энантисселекторов.
роак~і--"ескяя і'єчнчтгі? работы:.На основе природных носителей оазоаботаны новые методы иммобилизации клеток и ферментов микооорганизмоз. которые обеспечивают высокую активность и стабильность биокатализатороз.
С помощью оригинального метода иммобилизации клеток микроорганизме в присутствии периодата натрия и N.N'-m-фЄниленяиаспаримида получен
-(ферментный биокатализатор, на основе которого разработан процесс цноэтапного получения L-аланина из фумарата аммония. Указанный метод гкрывает широкие перспективы получения и применения ИК микроорганизмов в сстремальных условиях среды со стабилизацией ферментативной активности.
Разработаны технологические регламенты на производство L-аспарагиновой зелоты. L-аланина. L-яблочной кислоты, глюкозо-фруктозного сирспа. а также 1ытно-прсмышленные регламенты на производство Р-циклодекстрина и жтозного подсластителя. Разработанная документация передана организациям эсагропрома Армении, Минхимпрома и Минмедпрома бывшего СССР для зактической реализации.
Получено разоешение Фармкомитета на использование р-циклодекстрина пя стабилизации лекарственных форм. На его основе выпущена опытно-гамышленная партия пектусина.
Апвоб-зиия. Результаты работы докладывались на V Международном інерапьном симпозиуме по дрожжам (Канада. 7-Ю сентября.1930). I ззтислааском симпозиуме по сахаридам (Чехословакия. 18-23 мая,19Э1). VII вждународном специализированном симпозиуме по дрожжам (Испания. 11-15 ,тября.1981). Всесоюзной научной конференции "Исследования по изысканию :крственных средств природного происхождения" (Ленинград. 17-18 сентября. 81), Международном совещании "Биотехнология утилизации вторичных :сурсов" (Абовян. 6-11 сентября.19S8). ill Респ. конф. "Достижения физико-мическсй биологии и биотехнологии и пути их внедрения" (Ереван. 16-17. тября, 1989). Всес. н/п конф. "Состояние и перспективы создания новых карственных средств и фитохимических препаратов" (Харьков, 3-5 октября. 90). II Бсес. н/п конф. "Топинамбур и топинсолнечник - проблемы возделывания и пользования" (Иркутск. 6-Ю августа. 1990), III Всес. н/п конф. "Топинамбур и' тмнеслночник - проблемы возделызания и использования" (Одесса. 7-11 тября,1991). н/п конф. "Перспективы создания и производства лекарственных едстз в Украине" (Одесса, 4-8 октября, 1993), ежегодном собрании льскохозяй'ствснного и биохимического общества Японии (Кобе. Япония. 5 ікабря, 1992) и в Бсро отделении биологических наук НАН Армении и іезидиуме НАН Армении (10 мая, 19Є9).
Материалы работ по расшифровке структур полисахаридов Cryptococcus едены в учебные пособия для высших учебных заведений по микробиологии пиноз Н.П. "Химия микробных полисахаридов, 1SS4.-256c; Блинов Н.П. ямическая микробиология, 1989,-44бс).
Дубли,*лиил, Результаты научных исследований опубликованы в 95 работах, в м числа одкой монографии и15 авторских свидетельствах.
Меда'даазааэния работы, Оснозная часть саботы выполнялась в Институте 'кробиологии НАН Армении и была частью плановой тематики Института, следования микробных полисахаридов проводились в Ленинградском (С-
Петербург) Химико-фармацевтическом- института, а.идучение мсхаііизма-.дой-тлу ЦГТаз и процессов получения^ L-теанина - на база Центральной исследовательской лаборатории фирмы Taiyo Kagaku Co., Ltd (Япония). Ряд разделов работ выполнен совмзстно с сотрудниками Института микробиологии НАН Армении и других организаций, которым автор выражает глубокую признательность.
-
Для Эффективной иммобилизации клеток микроорганизмов мзтояом вклпчения. при выборе геля-носителя необходима учитывать особенности строения клеточной стенки, которая содержит в сасем составе полисахариды различного сложного строения. Каждый внешный полисахарид, обладающий только ему'присущей структурой, оказывает сугубо специфическое действие на Функциональную деятельность микробных клеток. При зтом. чем ближе ота структура к строенио собственных полисахаридов микроорганизмов, тем мягче его действие и меньше нарушение жизненных функции включаемых клеток, что .приводит к повышенно выхода активности после иммобилизации.
-
Обработка микробных клеток периодатом натрмя приводит к образование на поверхности клеточной стенки альдегидных групп, сшивкой которых жесткими диаминами могут быть получены стабилизированные мультиоерментные иммобилизованные клетки, без применений каких-либо, носителей.
-
Различие между адсорбционными способностями носителей на сскоас полисахаридов связано с различием их строения и молекулярными массами. Более разветвленные полисахариды дагзт болез стабильные результаты, поскольку на них можно создавать большее колмчзство-активних групп, из-за большей поверхности полученной, матрицы.
-
Признака мономера при модификации сияикзгеяя хечеезрецизй акрилонитрила протекает за счет напряженных SK^Si групп по ионному или радикальному механизму б зависимости от текстуры поверхности носителя. При этом, на поверхности сохраняется гидрсксильний покров, придавший коситело большую гидрсфильность и создает благоприятные услозия для иммз^ниц-шчу, фзрментоз методом козалантксго связывания.
-
Аспартсопая реакция, г.зтализирусмал иммобилизованными кг,?.Т{.^<'.. протекает аналогично реакции един субстрат - одни продукт. Пра;црсс голуби; *: L-асларагиновсй кислоты из рукарозой необходимо ссушоствить в ccsuhpssom биорзакторо с периодической переменой каст езкции. так как стабильность биокаталюатсра в пгрвых секциях сушгстегню зышо, чем в последа;-::-:. Пйрад иммобилизацией клгток зкл;очзкисм, необходимо ю; прздварителъко стабилизировать паг.ерочноГі оиивкоЛ.
-
Синтез L-глгмина можно осуществить едкрэтапио из фумграта гимскил с помощь» совместно сшитых и иммебіизиаезаннух клеток и ферментов с аспартазной и Ьгспартст-р-дсічЕрбохги^анрй активностями.
-
Иммобилизацию клеток с L-аспартат-р^декарбоксилгзной гктизностьо для одновременного получения L- аланина и D-аспарагиновой кислоты из D.L-аспарагинсвой кислоты можно осуществить в 5%-ксм гвле агара.
-
Синтез L-теанина можно осушествить из глутЕмина и этиламина лсд действием интактной или иммобилизованной глутаминазы.
-
Успех получения L-яблочнсй кислоты из фумэрозой с помощьо иммобилизованных клеток с срумаразной актизнсстыо в значительной степени зазисит от способа иммобилизации, а биокатапизатор может актизизиросатся в течение процесса.
-
Иммобилизацию клеток с инулиназной активностью для получения глокого-оруктсзнсго сиропа из инулинсодержащего сырья можно осушествить безкосительным спссобом. при котором не существуют диффузионных ограничений. При этом, целзсообразно использовать инулиназы сзкзо-типсм действия, которые имеют подцентровую структуру активного центра, а каталитическое расщепление субстратов протекает между подцентрамм 1 и 2.
-
Активный центр циклсмальтодекстрин гпюканотрансоераз состоит из двух отдльных частей - донорнсй и акцептоонсй. Первая из них строго слециаичена к а-1,4-сзязгняым мэльтсопигссахаридам, а вторая - может взаимодействовать с другими моно- и олигссахаридами. Циклизация требует сзязызание субстрата с обоими центрами одновременно, в поотивном случае в начальный период оегкции протекает только межмслекулярное тргнсгликозилирозание. Наиболеа низксмолекулпрным и специфическим субстратом для циклизации является мальтсоктасза. Специфическая часть активного центра состоит из семи подцентроч, а акцепторный участох имеет только лрадварительно-связызпящуо функция, поиводящую к изменениям кенформации везго активного цзнтра и апи.ентируяшуя связывание донора в положении, необходимом для тсансгликозипносзания.
-
Полимеры.циклодекстринсз и их производные могут связывать цнкломальтсдекстрин глоканотрансферазу нз тог.ыо с еысокой азфиннсстья, не и с тонкой специфичностью, что позволяет обнаружить присутствие; изоферментое.
-
Процесс получения а-циклодекстрина межно осуществить а условиях ультрафигьтрационных мембран, (3-циклодекстрина - иммобилизезанным фзрментом, а v-фсрмы - о присутстзии специфических макроциклических комплексасбразезателей.
' 4. Ил высоких концентраций субстратов р-фруктсфуранозидзза P. paJifans v р-ґзлектозидаза способны образовывать фрукто- и галактсолигесахариды ссотзйтстзенно.
В качестве объектов исследований использованы штаммы микроорганизмов следующих групп и видов : из группы аэробных спорообразующих бактрий - Вааїїиі suhtiiis, B.iichen/formJs, B.stearothsnnoph/lus, B.alkalopMus. B.hafophiius и ряд новых разновидностей; из неспороносных бактрий - Alca/igenes faecal/s. Erwinfa arotdea, BreWbactenum, Pseudomonas nitroreducens, из дрожжей - Kluyseramyces тапаапив (fragi/is), Cryptocc/ccus еіїпощ Cr./aurentn из грибов - P. ра/іїал
Большинство изученных штаммов являлись оригинальными культурами, в основном экстремосрильными формами микроорганизмов, выделенными и хорошо идентифицированными в Институте микробиологии НАН Армении (ИНМИА).
Культивирование микроорганизмов осуществляли методами глубинной ферментации в колбах и ферментерах. Аспартазную активность определяли по списанному методу [15]; Ьаспартат-р-декарбокошазную активность - по [16]; срумаразную - по Goodman, 1957; инулиназную - по Guiraud et al.,1981; цикломальтодекстрин глюканотрансферазную (ЦГТазная) - по [21]; теанинсинтетазную - по [26]; Р-галактозидазную - по Honda etal.,1931; р-Фруктофуранозидазнуо - по Зинчекко и др.,1995.
Иммобилизацию клеток и ферментов проводили различными методами: включение в полиакриламидный гель (ПААГ) - по Yamamoto etal. ,1976, в собственной модификации; включение в мембраны из поливинилового спирта (ПВО) - по Fukui etal., 1980, в Са-альгинат - по Ohisonetal., 1979; вкаррагинан-по Tosaet al., 1979; в триацетатцеллюлозу (TAU) - по Marconi, 1978; в агаровый гель - по Cannon, 1986; ковапентное связывание на силохроме - по Ананичеву и др., 1978: методом адсорбции - no Guiraud. 1981, в собственной модификации.
Исследование полисахаридов криптококков проводили по описанным методам [3,4].
Белок определяли по Лоури (Lowry ет al.. 1951); редуцирующие вещества - по Шомоди-Нельсону (Somogyi, 1952; Nelson, 1S44); азот - методом Кьельдаля (Bradstreet. 1955).
Фруктозу и глюкозу определяли по Bergmeyer, 1974, а также методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе растворителей н.пропанол-этилацетат-вода = 7-1-2. '
Гомогенность' очищенных ферментов определяли Na-DS-гель-электрофорезом в 7,5% ПААГ па Девису (Davis. 1S54).
ИК-спектры снимали на приборе UR-20.
Величины оптического вращения определяли на автоматическом поляриметре Perkin-Elmer-24!.
Аминокислотный состав очищенных ферментов определяли на аминокислотном анализаторе ААА-339 фирмы Microiekhna (Чехословакия) после гидролиза препаратов 6н. НСі в течение 24 часов при 105.
Циклодекстрины и слигосахариды определяли методом ВЭЖХ т -приборе НРР 4001 (Чехословакия) в качестве детектора, используя дифференциальный
ефрактометр на колонке SEPARON SGX-NH2 (150 х 3,3 мм), а системе цетснитрил-вода = 70/30.
Кофеинсодержашие растворы анализировали методом ВЭЖХ на приборе litachi 655А-11 (Япония) на колонке Deveiosil ODS (Ncmora Chemical Co.. Япония) I50 x 3,3 мм), в качества подвижной фазы используя смесь уксусной кислоты, цетонитрила, диметилформзмида и воды в соотношении 3:1:15:81 (скорость 0.5 іл/мин ) и детектор UV=2B0 нМ.
Теанин определяли на колонке Shiseido Capcell Рак CiaAG (4.6 х 250 мм) при
емпературе 25 и 214 нМ со скоростью воды (рН 3,5) 0,5 мл/мин в качестве
одеижней фазы. ' - , '