Содержание к диссертации
Введение
II. Литературный обзор 8
1. Введение 8
2. Обзор научно-технической литературы 9
2.1. Инсулин, строение и синтез в клетке. 9
2.1.1. Метаболизм глюкозы в организме человека 10
2.1.2. Роль инсулина в лечении сахарного диабета 11
2.2. Производство генно-инженерного инсулина человека на ОБП ИБХ РАН 14
2.2.1. Перечень основных технологических операций в производстве инсулина 14
2.2.1.1. Технологические операции, выполняемы в цехе промышленной ферментации 14
2.2.1.2. Технологические операции, выполняемые в цехе выделения и очистки 14
2.2.1.3 Технологические операции, выполняемые в цехе готовых лекарственных форм 15
2.2.2. Требования к контролю качества субстанции генно-инженерного инсулина человека 15
2.3. Белки гистоны, их строение и синтез в клетке. 20
2.3.1. Гистоны как основа терапевтических средств 23
2.4. Разработка биотехнологии получения активной фармацевтической субстанции – аналога
Ритуксимаба. 26
2.4.1. Перечень основных технологических операций в производстве субстанции гистона H1.3 26
2.4.1.1. Технологические операции, выполняемы в цехе промышленной ферментации 26
2.4.1.2. Технологические операции, выполняемые в цехе выделения и очистки 27
2.4.1.3. Контроль качества АФС, физико-химические свойства
2.5. Система управления рисками на производстве генно-инженерных белков 29
2.6. Общая политика валидации на фармацевтическом производстве
2.6.1. Необходимость валидации аналитических методик 31
2.6.2. Валидационные параметры. 32
2.6.3. Методы анализа, основанные на связывании лигандов
2.7. Методы определения остаточной ДНК и белков штамма-продуцента в активной фармацевтической субстанции 37
2.8. Метод полимеразной цепной реакции.
2.8.1. Основы метода ПЦР 41
2.8.2. Детекция проведения амплификации (электрофорез) 46
2.8.3. ПЦР в режиме реального времени.
2.8.3.1. Отличие анализа продуктов ПЦР «по конечной точке» и «в реальном времени». 50
2.8.3.2. ПЦР в режиме реального времени в качестве диагностического инструмента. 51
2.8.3.3. Типы ПЦР в режиме реального времени. 52
2.8.3.4. Оборудование для ПЦР в реальном времени. 59
2.9. Метод иммуноферментного анализа. 61
2.9.1. Основы метода ИФА. 61
2.9.2. Индикация комплекса антиген-антитело.
2.9.2.1. Ферменты в качестве меток в иммуноанализе. 64
2.9.2.2. Получение конъюгатов для иммуноферментного анализа.
2.9.3. Методы получения антител для ИФА. 67
2.9.4. Классификация методов иммуноферментного анализа. 68
2.9.4.1. Схемы методов твердофазного ИФА. 70
2.9.5. Интерпретация результатов ИФА 74
III. Экспериментальная часть 77
1. Объекты исследования 77
2. Методы исследования 78
2.1. Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС инсулина и гистона Н1.3 . 78
2.1.1. Наращивание биомассы 78
2.1.2. Выделение тотальной и плазмидной ДНК. 78
2.1.3. Обработка ДНК ультразвуком, ДНКазой 79
2.1.4. Пробоподготовка АФС. 79
2.1.5. Проведение ПЦР и рвПЦР на основе интеркалирующего красителя SYBR GREEN I и технологии TaqMan, основанной на введении в реакцию флуоресцентно-меченых зондов. 80
2.1.6. Подготовка образцов к секвенированию. 82
2.2. Определение содержания проинсулина в АФС инсулина методом ELISA. 83
2.2.1. Буфер для проб. 83
2.2.2. Пробоподготовка АФС инсулина 83
IV. Результаты и обсуждение 84
1. Разработка метода рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli,
на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулина человеческого и
генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого. 84
1.1. Создание рабочего стандартного образца на основе тотальной ДНК штамма-продуцента инсулина.
1.2. Оптимизация пробоподготовки АФС для определения остаточной ДНК штамма-продуцента методом рвПЦР. 86
1.3. Подбор компонентов и условий проведения реакций рвПЦР с использованием SYBR GREEN I и технологии TaqMan.
1.3.1. рвПЦР с использованием SYBR GREEN I 88
1.3.2. рвПЦР с использованием технологии TaqMan 1.4. Определение диапазона фрагментов остаточной ДНК в субстанции генно-инженерного инсулина человеческого при помощи фосфора Р32. 98
1.5. Оценка содержания остаточной ДНК в АФС генно-инженерного инсулина человеческого и генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого при помощи праймеров к ампликонам размером 100 п.о. и 198 п.о. 99
1.6. Исследование содержания остаточной ДНК штамма-продуцента гистона методом капельной цифровой ПЦР (кцПЦР) на основе TaqMan проб. Сравнение результатов реакции для разработанного и коммерческого TaqMan зондов
1 2. Оценка параметров метода рвПЦР при использовании SYBR GREEN I и технологии TaqMan. Выбор оптимальной методики для рутинного контроля содержания остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС . 106
3. Сопоставление показателей разработанной методики рвПЦР на основе SYBR GREEN I и параметров коммерческого набора фирмы Cygnus Technologies по определению остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС генно-инженерного инсулина человека и генно-инженерного гистона Н1.3 человека. 107
4. Сравнение валидационных характеристик метода ИФА для определения проинсулина в генно-инженерной субстанции инсулина на основе набора для плазмы крови, с соответствующими параметрами другого набора, предназначенного для оценки содержания проинсулина в субстанции инсулина. 109
V. Выводы 118
VI. Список опубликованных научных работ по теме диссертации.
119
VII. Благодарности. 120
VIII. Список литературы. 121
- Производство генно-инженерного инсулина человека на ОБП ИБХ РАН
- Методы определения остаточной ДНК и белков штамма-продуцента в активной фармацевтической субстанции
- Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС инсулина и гистона Н1.3
- Оценка параметров метода рвПЦР при использовании SYBR GREEN I и технологии TaqMan. Выбор оптимальной методики для рутинного контроля содержания остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС
Производство генно-инженерного инсулина человека на ОБП ИБХ РАН
Фармацевтические препараты, получаемые с помощью технологий с рекомбинантными ДНК, в последнее время становятся все более актуальными. При этом к качеству активных фармацевтических субстанций (АФС), используемых для производства лекарственных препаратов, должны предъявляться особые требования [1, 2]. Для определения минимальных количеств чужеродных для организма человека примесей в генно-инженерных АФС необходимы современные высокочувствительные методы анализа.
Особенно это актуально для препаратов пожизненной терапии, в частности инсулина. По данным Международной федерации диабета в конце 2015 г. в мире насчитывалось 462 миллиона больных, а к 2040 г. прогнозируется увеличение количества диабетиков до 592 миллионов человек.
Во многих странах мира рак занимает второе место после сердечно-сосудистых заболеваний в перечне причин смерти. Для химиотерапевтического лечения неходжкинских лимфом (НХЛ), было предложено использовать препараты на основе производных гистонов класса Н1, что является перспективным направлением в противоопухолевой терапии. Действие основано на способности этих небольших высококонсервативных белков проявлять антираковый эффект, внеклеточно и селективно связываясь с фосфолипидами мембран лимфоидных клеток. Противораковые препараты вводят в больших дозах больным с ослабленным иммунитетом, поэтому отсутствие иммуногенности является наиболее актуальным при разработке более совершенных и безопасных лекарственных форм.
Разработка эффективного и специфичного метода позволяет с высокой степенью точности оценить качество продукции. Наряду с этим, позволяет создать стандартную методику, для последующего внедрения более совершенных методов контроля качества продукции в определенное производство генно-инженерных белков, с целью минимизации рисков для населения при применении выпускаемых лекарственных препаратов. 2. Обзор научно-технической литературы. .
Инсулин (от лат. insula — остров) — гормон пептидной природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Оказывает многогранное влияние на обмен практически во всех тканях. Основное действие инсулина заключается в снижении концентрации глюкозы в крови. Инсулин увеличивает проницаемость плазматических мембран для глюкозы, активирует ключевые ферменты гликолиза, стимулирует образование в печени и мышцах из глюкозы гликогена, усиливает синтез жиров и белков. Кроме того, инсулин подавляет активность ферментов, расщепляющих гликоген и жиры [3].
Молекула инсулина образована двумя полипептидными цепями, связанными ковалентно дисульфидными мостиками и содержащими 51 аминокислотный остаток: A-цепь состоит из 21 аминокислотного остатка, B-цепь образована 30 аминокислотными остатками. Полипептидные цепи соединяются двумя дисульфидными мостиками через остатки цистеина, третья дисульфидная связь расположена в A-цепи.
Первичная структура инсулина человека. Первоначально он образуется в форме прегормона – одноцепочечного белка, состоящего из 109 аминокислотных остатков. При отщеплении 23-членного сигнального пептида получается проинсулин, состоящий из 84 остатков аминокислот. Проинсулин быстро расщепляется специфическими ферментами, протеазами, в результате чего образуется молекула инсулина. Молекула инсулина состоит из двух цепей, связанных ковалентно дисульфидными мостиками, образованными остатками цистеина В7, А7 и В19, А20, соответственно (рисунок 1). Еще одна внутримолекулярная дисульфидная связь соединяет остатки цистеина в положениях А6 и А11. А-цепь инсулина состоит из 21 аминокислотного остатка, В-цепь – из 30.
Первичная структура инсулина у разных биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. В настоящее время определена первичная структура инсулина более чем у 25 видов животных. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении B-цепи свиного инсулина расположен аланин, а в инсулине человека — треонин; бычий инсулин отличается тремя аминокислотными остатками [3].
Биосинтез инсулина и его секреция регулируется содержанием глюкозы в плазме крови. Для здоровых взрослых людей концентрация глюкозы в плазме составляет от 3 до 8 мМ, в то время как при сахарном диабете нарушение углеводного обмена приводит к гипергликемии с увеличением концентрации глюкозы до 25 мМ [4].
Основную роль в регуляции углеводного обмена организма играет инсулин. Он стимулирует переработку глюкозы клетками. Почти все ткани и органы (например, печень, мышцы, жировая ткань) способны перерабатывать глюкозу только в его присутствии. Эти ткани и органы называются инсулинзависимыми. Другие ткани и органы, как например мозг, не нуждаются в инсулине для того, чтобы перерабатывать глюкозу, и потому называются инсулиннезависимыми.
Непереработанная глюкоза запасается в печени и мышцах в виде полисахарида гликогена, который в дальнейшем может быть снова превращён в глюкозу. Но для того, чтобы превратить глюкозу в гликоген, нужен опять-таки инсулин.
При недостаточности инсулина (сахарный диабет 1-го типа) или нарушении механизма взаимодействия инсулина с клетками организма (сахарный диабет 2-го типа) глюкоза накапливается в крови в больших количествах (гипергликемия), а клетки организма (за исключением инсулиннезависимых) лишаются основного источника энергии [5].
Методы определения остаточной ДНК и белков штамма-продуцента в активной фармацевтической субстанции
Макромолекулы неоднородны, а их активность и иммунореактивность может претерпевать изменения. Референтный материал следует должным образом охарактеризовать и задокументировать (например, сертификат анализа и происхождения). Следует использовать самый чистый стандартный образец, имеющийся в наличии.
Специфичность связывающего (их) реагента (ов) определяется способностью связываться исключительно с анализируемым веществом. Специфичность основана на концепции перекрестной реакции. В идеале связывающий реагент должен быть настолько специфичным, чтобы отсутствовала перекрестная реакция с «сопутствующими соединениями» по структуре (напр., эндогенные соединения, изоформы, варианты форм аналита или физико-химические подобные соединения), или с предполагаемым одновременно используемым другим лекарственным средством. Во время разработки и валидации метода эти «родственные молекулы» часто недоступны. Оценку специфичности можно проводить после завершения первоначальной валидации, когда становятся доступными дополнительные данные о свойствах аналита. Специфичность следует оценивать, используя контрольные образцы, добавляя по нарастающей концентрации имеющихся «родственных молекул» или лекарственных веществ, которые, как ожидается, будут вводиться одновременно, в матрицу образца (предполагается, что матрица образца никогда ранее не подвергалась воздействию аналита), а также посредством измерения достоверности исследуемой макромолекулы при LLOQ и ULOQ. Критерии приемлемости анализа контрольных образцов должны быть не более 25% от номинальных значений.
Селективностью метода, основанного на связывании лигандов, является способность измерять анализируемое вещество в присутствии не сопутствующих соединений в матрице. Обычно какая-либо экстракция отсутствует, что обусловлено присущими макромолекуле свойствами. К тому же не сопутствующие соединения, представленные в матрице, напр., фрагменты ферментов, гетерофильные антитела или ревматоидный фактор, могут создавать помехи интересующему аналиту при использовании метода, основанного на связывании лигандов. Селективность тестируется добавлением аналита к матрице, полученной, как минимум, от 10 источников, в концентрации, равной или близкой к LLOQ. Эти источники должны включать липидемические или гемолизированные образцы. Также требуется включать источники от популяций с соответствующими заболеваниями. Селективность следует оценивать на нижнем пределе количественного определения метода, когда в большинстве случаев возникают проблемы. Также возможна оценка селективности при более высоких концентрациях аналита. В случаях, когда интерференция зависит от концентрации, важно установить минимальный порог концентрации, когда интерференция обнаруживается. До валидации метода лиганд-связывания может понадобиться корректировка нижнего предела количественного определения в связи с уменьшением минимального порога. Правильность должна находиться в пределах 20% (при LLOQ - 25%) от номинальной концентрации, по крайней мере, в 80% оцененных матрицах.
Если используются автоматизированные системы обработки жидкости, потенциал для переноса следует изучить путем анализа образцов «бланк матрицы» после образцов с высокой концентрацией аналита или калибровочного стандарта на верхнем пределе количественного определения.
Измерение некоторых макромолекул может быть невозможно в сложных матрицах без экстракции ввиду высоких интерференций (больших помех) с высокими уровнями структурно связанных эндогенных соединений. Хотя применение экстракционной матрицы (например, древесного угля, иммунной аффинности) или альтернативной матрицы (например, протеиновых буферов, диализированной сыворотки) не рекомендуется, использование таких матриц может понадобиться, когда нет альтернативы имеющейся стратегии количественного определения исследуемого аналита. Кривую калибровочного стандарта можно приготовить с использованием этих суррогатных матриц. Контрольные образцы следует готовить с использованием матриц реальных образцов; правильность рассчитывают, демонстрируя отсутствие матричного эффекта.
Некоторые матрицы могут проявлять высокий фоновый сигнал. Для устранения этого эффекта может понадобиться измерение минимально требуемого разведения. Минимально требуемое разведение - это наименьшее разведение, до которого необходимо развести образец в буфере, чтобы оптимизировать правильность и прецизионность в серии анализа путем снижения соотношения сигнал/шум. Образцы с внесенным количеством аналита следует готовить в той же матрице, что и исследуемые образцы для определения минимально необходимого разведения.
Функция отклика калибровочной кривой измеряется опосредованно. Обычно она не показывает линейности и часто сигмоидальна. Для описания аналитического отклика необходимо использовать как минимум 6 калибровочных стандартов дважды. Концентрацию аналита в калибровочных стандартах устанавливают таким образом, чтобы равномерно распределить их на логарифмической шкале в границах предполагаемого диапазона. Для более точного описания зависимости аналитического отклика от концентрации аналита возможно использование «опорных калибраторов», концентрация которых выходит за пределы диапазона количественного определения. При валидации следует оценивать минимум 6 независимых циклов. Результаты должны быть представлены в таблице для представления общей робастности регрессионной модели калибровочной кривой. Калибровочный стандарт может быть исключен из данных по причине установленной технической ошибки (напр., ошибка при отмеривании пипеткой). Обратно рассчитанные (back-пересчитанные) концентрации калибровочных стандартов должны быть в диапазоне ±20% от номинального значения (±25% при LLOQ и ULOQ), по крайней мере, для 75% калибровочных стандартов. Для «опорных калибраторов» не требуются критерии приемлемости, поскольку они находятся за пределами количественно оцениваемого диапазона калибровочной кривой.
Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС инсулина и гистона Н1.3
Современные компьютерные программы в комбинации с применением флоуресцентно-меченных гибридизационных олигонуклеотидных проб для визуализации результатов ПЦР (методы FLASH или ПЦР в «реальном времени») позволяет практически полностью исключить неверную трактовку результатов. Автоматизированная система фиксирования данных с детектирующего амплификатора или специализированного флоуриметра в памяти персонально компьютера позволяет вести эффективную документацию и хранение информации с возможностью выведения отчета о проведенном анализе в стандартном виде [66].
Новым подходом на даный момент времени является добавление в реакционную смесь масел, с целью последующего получения эмульсии и проведения отдельно ПЦР реакции в каждой капле. Капельный цифровой ПЦР (Droplet Digital PCR- ddPCR) – усовершенствованный количественный метод полимеразной цепной реакции (кцПЦР), при котором реакционная смесь после добавления ДНК распыляется на множество мельчайших капель. Размер одной капли порядка 100 мкм. В реакционной смеси 20 мкл содержится 20000 капель [90]. При этом возможна визуализация результата реакции в каждой капле. При использовании специального чипа по завершению реакции его можно использовать для проведения секвенирования с каждой капли. Какими же преимуществами обладает данный метод? Если рассматривать анализ ДНК, то в клетке могут встречаться редкие мутации, например лишь в одной из нескольких сотен клеточных митохондриальных ДНК. В общей смеси при обычном ПЦР при таком сильном разведении эти мутации невозможно обнаружить. Похожая картина нередко наблюдается в отношении минорных опухолевых мутациях. При капельном же ПЦР исследователь становится независимым от сильного «разведения мутации», поскольку в одной из многих тысяч капель реакционной смеси концентрация мутации резко возрастает по отношению к нормальным молекулам ДНК и далее её концентрация в процессе амплификации растет еще больше [91, 92]. Рисунок 24. Прибор для капельной цифровой ПЦР или кцПЦР (droplet digital PCR - ddPCR QX100, BIO-RAD). Процесс осщуествляется в три этапа: 1 – получение эмульсии в генераторе капель; 2 – проведение ПЦР в амплификаторе; 3 – регистрация сигнала при помощи ридера капель и анализ результатов.
Рассмотренный подход имеет массу преимуществ, в сравнении с рвПЦР, и подходит для определения остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС на фоне большого количества белка. Что на этапе пробоподготовки позволяет исключить стадию выделения ДНК из субстанции. Минусом является тот факт, что пробы после анализа в ридере капель не сохраняются, а перемещаются в общий слив. То есть для проведения электрофоретического разделения продуктов кцПЦР необходимы дополнительные повторы. Кроме того, положительный момент в том, что результаты измерений представлены в виде численного значения копий в мкл. Что также позволяет вводить в реакцию помимо испытуемой пробы лишь положительный и отрицательный контроли, не применяя калибровочные растворы.
Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность иммунохимического анализа сочетается с высокой
чувствительностью детекции ферментативной метки (вплоть до 10-21 молей в образце). Высокие результаты достигаются благодаря использованию ферментов-биокатализаторов, которые позволяют создавать каскадные системы усиления различных химических сигналов.
Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации и многие другие достоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, сельское хозяйство, биологическую промышленность, охрану окружающей среды, а также в научные исследования. Применение ИФА в различных областях научной и практической деятельности ставит перед исследователем задачу: освоить основные приемы, необходимые для самостоятельной разработки метода и его эффективного использования.
Теоретические основы ИФА опираются на современную иммунохимию и химическую энзимологию, знание физико-химических закономерностей реакции антиген - антитело, а также на основные принципы аналитической химии. Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количества вариантов этого метода, в результате чего становится все труднее и труднее ориентироваться в потоке информации и данном методе.
Основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды.
Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой: [AT]+[АГ][АТАГ] Иммунохимическая реакция в растворе между антителами и антигенами протекает в несколько стадий, первой из которых является обратимое образование комплекса состава 1:1. Образование специфического комплекса антиген - антитело обеспечивается гидрофобными, ионными и вандер-ваальсовыми взаимодействиями, а также водородными связями. Вследствие наличия в молекуле антител более одного центра связывания для поливалентных антигенов возможно дальнейшее многостадийное образование сложных комплексов с различным соотношением в нем компонентов [93]. pi
Индикация образовавшегося комплекса антиген - антитело может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались ферментные, флуоресцентные, изотопные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов во множество раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.
Для осуществления высокой специфичности, чувствительности, воспроизводимости анализа необходимо провести эффективное разделение комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген—антитело прочно иммобилизовать (связать) на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся иммунных комплексов от свободных компонентов. Метод ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) это твердофазный иимуноферментный анализ, использующий меченный ферментом иммунореактант, а также иммуносорбент, связанный с твердым носителем [94]. Возможность прочного связывания на носителе антител или антигенов с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов и разработка на этом принципе твердофазных методов дали мощный импульс для развития новых подходов в иммунохимических методах анализа.
Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа [95,96].
Оценка параметров метода рвПЦР при использовании SYBR GREEN I и технологии TaqMan. Выбор оптимальной методики для рутинного контроля содержания остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС
Определение остаточной ДНК в АФС инсулина при помощи метода ПЦР по конечной точке не требует устранения белка из реакционной смеси. Для рвПЦР белок устраняют из реакции, при помощи коммерческого набора DNA Extraction and Amplification Kit for the Measurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, Cygnus Technologies, США). Буфер для проб АФС инсулина (Отрицательный контроль). В микропробирку вносили 5мл 0,01М HCl и 0,375мл 3М Трис с 2M NaCl (5мл0,075=0,375мл), использовали свежеприготовленный буфер. Пробоподготовка АФС инсулина Навеску АФС инсулина 7 мг растворяли в 700 мкл 0,01 М HCl, затем приливали 52,5 мкл буфера 3М Трис с 2M NaCl. Полученный раствор инсулина разводили буфером для проб до концентрации 2 мкг/мкл.
С целью разрушения комплекса ДНК с гистоном проводили гидролиз АФС гистона Н1.3 трипсином, Sigma, США (термостат Heraeus, Германия). Комплекс разрушали при помощи гидролиза АФС трипсином, при различном соотношении фермент:белок (1:10; 1:100; 1:1000). Оптимальное соотношение фермент:белок 1:100. Инкубацию с ферментом проводили в течение 1, 2 и 4 часов при температуре 37 С. Результаты триптического гидролиза анализировали при помощи вертикального электрофореза в ПААГ по Лэммли в присутствии додецилсульфата натрия и -меркаптоэтанола (система Mini-PROTEAN Tetra System, BIO-RAD, США). Были выбраны маркеры молекулярных весов: окрашенный PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, а также неокрашенный более узкого диапазона Unstained Protein MW Marker (Thermo Scientific, США). На следующем этапе остаточную ДНК из субстанции выделяли при помощи коммерческого набора DNA Extraction and Amplification Kit for the Measurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, Cygnus Technologies, США).
Температуру отжига праймеров к фрагменту гена 16S RNA E.coli для ампликонов разного размера подбирали на ПЦР амплификаторе Thermal Cycler T100 (BIO-RAD, США). Использовали стерильную воду для ПЦР, Евроген. В реакционную смесь объемом 25 мкл входили: ПЦР-буфер (70 мM Трис-HCl, pH 8,6 / 25 C, 16,6 мM (NH4)2SO4, 2,0 мM MgCl2), 2,0 мМ dNTPs, праймеры 0,2 мкМ, 0,2 ед. в реакции HS Taq-полимеразы 5 ед./мкл). Условия амплификации, программа 1: 95С 5 мин; 35 циклов: 95С 30 сек, 50С-70С 30 сек; 72С 20 сек. Затем 72С 3 мин. Результаты оценивали при помощи горизонтального агарозного электрофореза и визуализации в УФ диапазоне. рвПЦР в присутствии (SYBR Green I) с разработанными праймерами к 16S RNA E.coli проводили на приборе «DT96» («ДНК-технологии», Россия). В реакционную смесь объемом 25 мкл входили: ПЦР смесь Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)(Thermo Scientific, США), праймеры 5 пмоль в реакции (0,2 мкМ). Для ампификации использовали следующие программы. Программа 2: 95С 5 мин; 45 циклов: 95С 30 сек, 60С 60 сек. Программа 3: 95С 5 мин; 45 циклов: 95С 30 сек, 58С 40 сек. Результаты оценивали при помощи программы Real_Time PCR v7.5, а также горизонтального агарозного электрофореза и визуализации в УФ диапазоне. рвПЦР в присутствии (SYBR Green I) с праймерами из набора DNA Extraction and Amplification Kit for the Measurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, Cygnus Technologies, США) проводили на приборе «DT96» («ДНК-технологии», Россия). В реакционную смесь объемом 25 мкл входили: ПЦР смесь Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)(Thermo Scientific, США), праймеры 5 пмоль в реакции (0,2 мкМ). Условия амплификации, согласно руководству к набору. 95С 10 мин; 45 циклов: 95С 15 сек, 55С 60 сек. Результаты оценивали при помощи программы Real_Time PCR v7.5, а также горизонтального агарозного электрофореза и визуализации в УФ диапазоне.
TaqMan рвПЦР с разработанными праймерами к геномной и плазмидной ДНК E.coli проводили на приборе «DT96» («ДНК-технологии», Россия). Использовали стерильную воду для ПЦР, Евроген. В реакционную смесь объемом 25 мкл входили: ПЦР-буфер (70 мM Трис-HCl, pH 8,6 / 25 C, 16,6 мM (NH4)2SO4, 2,0 мM MgCl2), 2,0 мМ dNTPs, праймеры 10 пмоль в реакции (0,4 мкМ), концентрация разработанного TaqMan зонда 3,75 пмоль в реакции (0,15 мкМ), 0,2 ед. в реакции HS Taq-полимеразы 5 ед./мкл). Для ампификации использовали следующие программы. Программа 2: 95С 5 мин; 45 циклов: 95С 30 сек, 60С 60 сек. Программа 3: 95С 5 мин; 45 циклов: 95С 30 сек, 58С 40 сек. Результаты оценивали при помощи программы Real_Time PCR v7.5, а также горизонтального агарозного электрофореза и визуализации в УФ диапазоне.
TaqMan кцПЦР с праймерами и TaqMan зондом к геномной ДНК E.coli из коммерческого набора One-Step RT-ddPCR Kit for Probes (#1863021, BIO-RAD, США) проводили на приборе Droplet Digital PCR system QX100 (BIO-RAD, США). В реакционную смесь объемом 20 мкл входили: ddPCR Supermix for Residual DNA Quantification (2X) (#1864037, BIO-RAD, США), 1 мкл праймеров и TaqMan зондов коммерческого набора One-Step RT-ddPCR Kit for Probes (#1863021, BIO-RAD, США). При этом концентрация праймеров составила 18 пмоль в реакции (0,9 мкМ), TaqMan зонда 5 пмоль в реакции (0,25 мкМ). В лунки картриджа вносили образец объемом 20 мкл, затем в параллельные лунки вносили по 70 мкл масла для создания эмульсии из набора Droplet Digital PCR Oils (BIO-RAD, США), затем картридж помещали в генератор капель и получали эмульсию. После чего 32 мкл эмульсии переносили в лунки 96 луночной плашки, которую накрывали фольгой и прочно ее запаивали. Для ампификации использовали прибор Thermal Cycler T100 (BIO-RAD, США). Реакцию вели по программе 4, рекомендованной производителем набора: 95 С 10 мин, 95 С 15 сек, 54 С 1 мин, 40 циклов, финальная стадия 98 С 10 мин. После чего плашку помещали в ридер капель и проводили измерения. Анализ результатов осуществляли при помощи программы QantaSoft 1.7.1 (BIO-RAD, США).
TaqMan кцПЦР с разработанными праймерами и TaqMan зондом к геномной ДНК с разработанными праймерами к 16S RNA E.coli проводили на приборе Droplet Digital PCR system QX100 (BIO-RAD, США). В реакционную смесь объемом 20 мкл входили: ddPCR Supermix for Residual DNA Quantification (2X) (#1864037, BIO-RAD, США), 1 мкл разработанных праймеров и TaqMan зондов При этом концентрация праймеров составила 0,9 мкМ, TaqMan зонда 0,25 мкМ. В лунки картриджа вносили образец объемом 20 мкл, затем в параллельные лунки вносили по 70 мкл масла для создания эмульсии из набора Droplet Digital PCR Oils (BIO-RAD, США), затем картридж помещали в генератор капель и получали эмульсию. После чего 32 мкл эмульсии переносили в лунки 96-луночной плашки, которую накрывали фольгой и прочно ее запаивали. Для ампификации использовали прибор Thermal Cycler T100 (BIO-RAD, США). Реакцию вели по программе 4, рекомендованной производителем набора, с учетом температур отжига разработанных праймеров и TaqMan зонда: 95 С 10 мин, 95 С 15 сек, 54 С 1 мин, 40 циклов, финальная стадия 98 С 10 мин. После чего плашку помещали в ридер капель и проводили измерения. Анализ результатов осуществляли при помощи программы QantaSoft 1.7.1 (BIO-RAD, США).
Необходимое количество продукта было накоплено при помоща ПЦР в объеме 50 мкл (Thermal Cycler T100, BIO-RAD). В реакции использовали праймеры к фрагменту гена 16S RNA E.coli , размер ампликона 425 п.о., высокоточную Iproof полимеразу, которая работает в 52 раза точнее Taq полимеразы (Iproof High-Fidelity DNA Polymerase, BIO-RAD). Продукты реакции подвергли горизонтальному электрофорезу в 1,5% агарозном геле. Провели очистку смеси от полимеразы и компонентов реакционной смеси, выделив ДНК при помощи коммерческого набора DNA Extraction and Amplification Kit for the Measurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, Cygnus Technologies, США). После чего полученные растворы передали ДНК на секвенирование в ЗАО «Евроген».