Введение к работе
Актуальність темы исследования. Успехи генной инженерии сделали возможным получение животных, содержащих в своем геноме чужеродную ДНК (чДНК), так называемых трансгенных животных. Большое значение имеет получение животных . с генетически запрограммированными свойствами: заданным потенциалом продуктивности и качеством продукции (Wart, Nancarrow, 1991). устойчивых к различным заболеваниям (MuHer, Вгет, 1991), а также использование трансгенных животных в качестве живых биореакторов, т. е. способных продуцировать биологически активные вещества (Clack. 1989).
Животные-биореакторы, полученные при помощи трансгенной технологии, могут стать новым источником производства рекомбинантных белков для медицины. Корректная посттрансляционная модификация белков в тканях трансгенных животных делает эту технологии} более предпочтительной по сравнению с микробиологическим синтезом (Meade, 1997).
Существующие в настоящее время методы переноса экзогенной ДНК в геном делятся на инструментальные (прямая микроинъекция клонированной ДНК в пронукпеус зигот), биологические (ретровирусная инфекция предимппантацмонных эмбрионов) и комплексные (трансформация эмбриональных стволовых клеток (ES-кпеток) и их перенос в бластоцисту, пересадка ядер из ES-клеток в энуклеированные зиготы). Данные методы, наряду с преимуществами, имеют ряд недостатков, связанных с трудоемкостью операций и сложностью применения их для крупных животных (Вгет, 1993).
В связи с этим, актуальной становится необходимость разработки простого. Эффективного и широко применяемого метода для встраивания чужеродных генов в геномы различных ендов млекопитающих, птиц и рыб.
Таем методом является процесс введения «тонированной ДНК в клетки разных видов животных с помощью сперматозоидов. В основе этою метода лежит способность спермиев потощать ДНК. Эта особенность, свойственная спермиям многих видов животных, была использована для введенії в мужкме гаметы чДНК к для переноса ее в яйцеклеток при оплодотворении. При такой процедуре сперматозоиды выпота имл , роль вектора для переноса чДНК. Эффективность перенося экзогенной ДНК с помощью этого метода составляет 30-60% (Gruenbaum
etat, 1991)против25%(Bnnsle««(dt. I^#(4^"**&* нъецирования
НАУЧМАГ! БИБЛИОТЕКА Косу.. . .л&ї ачадамии
Этот метод в перспективе может быть применен для введения нужных генов в геномы сельскохозяйственных животных для крупномасштабного производства белков. Переход на технологию получения трансгенных животных с помощью трансформированных сперматозоидов {возможно с использованием техники замораживания слермиев для создания криобанков семени) позволит значительно ускорить процедуру и Снизить стоимость работ по созданию трзнсгеиных животных, а тгкже снизигь цену получаемых при этом , биологически важных белков.
Цепь .настоящей работы - разработать технологические основы генетической трансформации животных с использованием сперматозоидов кролика в качестве модели вектора для экзогенной ДНК.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
разработать систему неинвазквной доставки экзогенной ДНК гетеро логичными спермиямн в ооциты золотистого хомячка;
- изучить векторные свойства спермиев кролика при помощи рекомбинантных
ДНК. '
оценить эффективность переноса чужеродной ДНК;
- исследовать интеграцию экзогенной ДНК в геном реципиенткых животных
при помощи Сауэерн-блотинга;
провести анализ зоотехнических преимуществ использования трансформированных сперматозоидов по сравнению с микроинъекцией для получения трансгенных животных.
Новизна работы заключается в том, что впервые рассматривается понятие состояния компетентности сперматозоидов к экзогенной ДНК. В связи с этим, определено влияние поповых режимов самцов кролика на связывание ДНК с кроличьими спермиями. Обнаружена разница начальных скоростей связывания ДНК спермиямк. обусловленная различными режимами полового использования доноров спермы Впервые выявлены 4 участка связывания меченой дигоксигенином ДНК С головкой сперматозоида кролика, в серии экспериментов обнаружено отсутствие корреляции между подвижностью мужских гамет и их способностью евязыаать ДНК.
Впервые показана возможность тестирования векторных . свойств сперматозоидов с помощью ооцмтре золотистого хомячка.
Проведен, анализ зоотехнических- преимуществ использования трансформированных слермиее для гюпучения траисгенных животных по сравнению с методом микроинъекции.
Практическая значимость работы состоит а том, что в результате проведенных исследований разработана система неинвазивной доставки экзогенной ДНК мужскими гаметами кролика в яйцеклетки золотистого хомячка.
Предложенная методика интродукции чДНК в ооциты с помощью трансформированных спермиев кролика может быть использована для получения трансгенных особей у других видов сельскохозяйственных животных, птиц и рыб Разработанный метод в будущем позволит специалистам сельского хозяйства получать млекопитающих, птиц и рыб с более продуктивными свойствами, для биотехнологов появится возможность создания нового поколения биопрепаратов для медицины и ветеринарии, используя трансгенных животных в качестве живых биореакторов.
Апробация работы! Результаты исследований были представлены иа научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЖа (Дубровицы, 1994 г,); на Международной научно-практической конференции "Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства" (Степногорск, 1995 г.); на Eurasian Symposium on Current Trends in Biotechnology: Gene Diagnostics, Gene Therapy and Informational Immunity. The Firsl Turkish - Russian Meeting (Ankara, 1995); на Международной конференции, посвященной памяти акад А.А. Баева (Москва. 1996 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложении результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 205 источников, и приложения. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 14 таблиц