Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение фенотипической изменчивости как
генетического феномена, лежащего в основе таких явлений и процессов как
изменение скорости микробных синтезов и трансформаций, вирулентность и
персистенция патогенных и условно-патогенных бактерий, результативность
симбиозов и замещение продуктивных вариантов промышленных штаммов,
является одной из наиболее актуальных проблем современной микробиологии.
Понимание механизмов внутрипопуляционной изменчивости микроорганизмов и
возможность их контроля позволят значительно повысить эффективность
существующих микробиологических производств. Известно, что популяция
микроорганизмов гетерогенна и характеризуется наличием внутри популяции
(одного штамма) клеток, различающихся по ряду колониально-морфологических и
физиолого-биохимических свойств и способных к диссоциативным переходам с
высокой частотой (10" -10" на одно клеточное деление) [Милъко, Егоров, 1991;
Головлев, 1998]. Согласно современным представлениям популяционная
вариабельность бактерий обусловлена процессами внутригеномной рекомбинации
генетического материала клетки, которые можно отнести к специфическому типу
мутаций [Прозоров, 2001]. В появившихся в последние десятилетия
экспериментальных работах отмечается повышение фенотипической гетерогенности
популяции в стационарной фазе роста, в стареющих и длительно хранящихся
микробных культурах [Милъко, Егоров, 1991, Kelly et.al., 2001]. Согласно ряду
гипотез это связано с состоянием пролиферативного покоя клеток, с включением
общего регулона стационарной фазы и действием сигнальных молекул,
контролирующих экспрессию генов этой фазы и переход клеток к состоянию покоя
[Yildiz&Schoolnik, 1998; Suh et.al, 1999; Andersson et.al, 1999]. Среди внеклеточных
ауторегуляторов микроорганизмов такими функциями обладают
видонеспецифичные ауторегуляторы: аутоиндукторы анабиоза - факторы di (производные алкилоксибензолов - АОБ), выделенные и описанные для широкого круга микроорганизмов [Элъ-Регистан, 1988; Батраков с соавт., 1993; Мулюкин с соавт., 1996; Бухарин с соавт., 2005]. Возможность использования этих ауторегуляторов для направленной регуляции популяционной вариабельности и стабилизации диссоциантов бактерий представляет интерес для микробиологии, медицины и биотехнологии.
з Цель работы: изучить закономерности саморегуляции популяционной
вариабельности спорообразующих и неспорообразующих бактерий, разработать
приемы направленного контроля диссоциативных переходов.
Задачи исследования:
Изучить популяционную вариабельность бактерий Bacillus licheniformis, B.subtilis, Pseudomonas aeruginosa, P.aurantiaca, реализующуюся при прорастании покоящихся форм различных морфотипов.
Охарактеризовать выделенные диссоцианты бактерий по их колониально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.
Разработать приемы регуляции популяционной вариабельности бактерий с помощью химических аналогов факторов di - алкилоксибензолов (С7-АОБ и С\2-АОБ).
Изучить возможный механизм действия АОБ в процессах диссоциативных переходов бактерий в тесте возврата к прототрофности клеток ауксотрофного штамма B.subtilis В1733.
Научная новизна.
1. Впервые изучена фенотипическая диссоциация В.licheniformis шт. 103, B.subtilis ШТ.В1733, P.aeruginosa шт.К2, P.aurantiaca шт.В1558, выделены и описаны колониально-морфологические варианты этих бактерий. 2. Показана зависимость между типом покоящихся форм (ПФ) бактерий и степенью вариабельности микробной популяции при их прорастании: у всех изученных бактерий наибольшей нестабильностью генотипа обладали цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК). 3. Впервые разработаны приемы регуляции популяционной изменчивости промышленного штамма В. licheniformis 103 при воздействии ауторегуляторных факторов на эндоспоры. Приемы предусматривают как индукцию выщепления минорных вариантов, так и селективное развитие определенного варианта при обработке эндоспор как инокулируемого материала определенными концентрациями АОБ. 4. Изучены возможные механизмы воздействия АОБ в процессах популяционной вариабельности бактерий. В тесте возврата к прототрофности клеток ауксотрофного штамма B.subtilis В1733 показано, что Сп-АОБ обладает слабой мутагенной активностью. Обнаружена корреляция между
мутагенной активностью Сі2-АОБ и интенсивностью диссоциативных переходов, которые индуцируются определенными концентрациями АОБов.
Практическая ценность работы. Разработаны приемы расширения диссоциативного спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий для отбора биотехнологически перспективных вариантов. Приемы включают образование ЦПК, имеющих нестабильный генотип, их рассев на плотные среды и выделение выросших диссоциантов в отдельные клоны, различающиеся свойствами. На примере конкретного исследования показано, что отдельные диссоцианты псевдомонад, отличающиеся стрессоустойчивостью, могут быть использованы в биотехнологических целях, в частности, при конструировании биосенсоров. Разработаны приемы направленной регуляции популяционной изменчивости спорообразующих бактерий путем воздействия на вегетативный или споровый инокулят алкилоксибензолами - химическими аналогами микробных ауторегуляторных факторов di. Установлены концентрационные диапазоны АОБ, предусматривающие как расширение диссоциативного спектра и индукцию выщепления минорных вариантов, так и сужение спектра и селективное развитие определенных из них. Полученные в работе результаты могут быть использованы для: 1) быстрого получения широкого спектра внутрипопуляционных диссоциантов грамположительных и грамотрицательных бактерий; 2) направленного контроля развития необходимого варианта; 3) совершенствования методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на II Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003). По материалам диссертации опубликовано 5 работ: из них 3 статьи и 2 тезиса.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 148 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 253 публикации отечественных и зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 24 таблицами и 30 рисунками. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ