Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Общие сведения о вирусе АЧС 11
1.2 Строение и структура вириона вируса АЧС 14
1.3 Структурные белки вируса АЧС 17
1.4 Генетическая вариабельность 19
1.5 Механизмы репродукции вируса АЧС 20
1.5.1 Репликация в клетке 20
1.5.2 Механизм распространения вируса АЧС у свиней 22
1.5.3 Репликация вируса АЧС у клещей 1.6 Механизмы формирования иммунного ответа 24
1.7 Лабораторные методы диагностики АЧС 28
1.8 Методы и системы получения рекомбинантных белков 33
1.9 Заключение по обзору литературы 37
2 Собственные исследования 39
2.1 Материалы и оборудование 39
2.2 Методы исследований 44
3 Результаты собственных исследований 51
3.1 Биоинформатический анализ белков вируса АЧС 51
3.1.1 Анализ вариабельности белков вируса АЧС 51
3.1.2 Анализ гликозилирования белков вируса АЧС 55
3.1.3 Анализ гидрофильности белков вируса АЧС 57
3.2 Создание библиотеки генов вируса АЧС 60
3.2.1 Подбор праймеров 60
3.2.2 Оптимизация условий амплификации 62
3.2.3 Клонирование полноразмерных копий генов в клонировочный вектор 64
3.3 Клонирование полноразмерных копий генов в экспрессирующие вектора pGFP-N1 и pCMV-HA-С и экспрессия в эукариотических клетках 68
3.4 Оценка уровня экспрессии и локализации рекомбинантных белков р17GFP, р54GFP 71
3.5 Сравнение диагностической эффективности серологических тестов для диагностики АЧС 73
3.6 Получение культурального антигена 76
3.7 Использование рекомбинантных белков в иммунологических реакциях
3.7.1 Иммуноблотинг 77
3.7.2 Иммуноферментный анализ 79
3.7.3 Иммунопероксидазный тест для выявления рекомбинантных белков в трансфецированных эукариотических клетках 81
3.8 Получение рекомбинантного эпитопа белка р17С вируса АЧС в
Escherichia coli 82
3.8.1 Подбор специфических праймеров и условий амплификации фрагмента гена содержащего эпитоп р17С 83
3.8.2 Клонирование эпитопа белка р17С вируса АЧС в вектор рET-32a(+) 84
3.8.3 Экспрессия эпитопа белка р17 вируса АЧС в бактериальных клетках Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) pLysS рЕТ32а/ASFV/p17ep/2 85
3.8.4 Очистка рекомбинантного эпитопа белка р17С вируса АЧС
4 Обсуждение результатов исследований 88
5 Заключение 95
6 Практические предложения 98
7 Список сокращений 99
8 Список использованной литературы
- Генетическая вариабельность
- Методы исследований
- Анализ гидрофильности белков вируса АЧС
- Иммунопероксидазный тест для выявления рекомбинантных белков в трансфецированных эукариотических клетках
Введение к работе
Актуальность работы. Вирус африканской чумы свиней (АЧС) крупный (200 нм) икосаэдрический ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Asfarviridae, роду Asfivirus (L.K. Dixon, 2000).
Вирус АЧС является возбудителем одной из самых опасных болезней для
представителей домашних и диких свиней (семейство Suidae). Африканская чума
свиней характеризуется лихорадкой, кровоизлияниями во внутренних органах,
цианозом кожи ушных раковин, подгрудка, живота и конечностей.
Высоковирулентные штаммы вируса вызывают смертность, близкую к 100 % (В.Н. Сюрин, 1972; И.А. Бакулов, 1996; И. А. Болоцкий, 2009).
Средства специфической профилактики при АЧС не разработаны. Полевые
изоляты вируса АЧС являются поликлональными популяциями, различающимися по
вирулентности, гемадсорбирующим и антигенным свойствам, что свидетельствует о
его антигенной вариабельности (L.K. , 1993; А.S. Malogolovkin, 2015). Всё это
обусловливает трудность борьбы с АЧС и необходимость совершенствования противоэпизоотических мероприятий на основе новейших научных достижений (А.Л. Семенихин,1992).
Степень разработанности проблемы. Значительный прогресс в области изучения антигенной вариабельности вируса АЧС был достигнут с использованием методов генной инженерии и молекулярной биологии (L.K. Dixon, 1988; А. Martins, 1994; F. Rodriguez, 1996; P. Gomez-Puertas, 1998; M.G. Barderas, 2000; R. Portugal, 2012; H. Akita, 2013; V. O’Donnell, 2015). Применение делеционных вариантов вируса с дефектными копиями отдельных генов позволило охарактеризовать функции этих генов. На основе технологий рекомбинантных ДНК разработаны различные системы экспрессии вирусных генов в клетках Е. сoli, растениях, дрожжах и клетках млекопитающих (В.О. Копытов, 2003; С. Gallardo, 2006; Н.Н. Власова, 2011; А.С. Казакова, 2013).
Получение рекомбинантных белков вируса АЧС исключает использование живого вируса и работу с инфицированными животными, что позволяет получить высокоочищенные вирусные белки в препаративных количествах.
В настоящее время известно о существовании более 150 белков вируса АЧС,
многие из которых играют важную роль в формировании иммунного ответа. Однако роль многих вирусных белков в патогенезе АЧС остается до конца не выясненной. Лимитирующим фактором в работе с рекомбинантными белками вируса АЧС полученных в гетерологичных системах экспрессии (бактерии, растения, дрожжи и др.) является несоответствие их пострансляционных модификаций модификациям вирусных белков в клетках хозяина, и как правило различное функциональное проявление. Получение и изучение биологических свойств аутентичных рекомбинантных вирусных белков позволит лучше раскрыть механизмы иммунного ответа и взаимодействия вируса с клеткой хозяина, а также разработать высокоспецифичные диагностические средства нового поколения, что определяет актуальность настоящей работы.
Цель и задачи исследования. Целью исследований являлось конструирование эукариотической системы экспрессии рекомбинантных белков вируса африканской чумы свиней на основе клеток млекопитающих и характеристика свойств полученных рекомбинантных белков.
Для выполнения поставленной цели нам необходимо было выполнить следующие задачи:
-
Провести биоинформатический анализ основных структурных белков р17, р54 и СD2v вируса АЧС.
-
Получить библиотеку полноразмерных генов 117L (р17), E183L (р54) и EP402 (С 2v) вируса африканской чумы свиней в клонировочном векторе pGEM-T-easy.
-
Получить рекомбинантные конструкции, экспрессирующие белки p17, р54 и CD2v в составе векторов под контролем цитомегаловирусного промотера.
-
Оценить клеточную локализацию и уровень экспрессии рекомбинантных белков p17, р54 и C 2v в трансфецированных линиях клеток COS-1 и HEK-293Т/17.
-
Оценить возможность использования полученных рекомбинантных белков в иммунологических реакциях.
-
Получить растворимый рекомбинантный эпитоп белка р17 в клетках E. сoli.
Научная новизна работы. Впервые в Российской Федерации подобраны праймеры для амплификации и клонирования полноразмерных генов, кодирующих иммунодоминантные белки р17, р54, СD2v.
Впервые получена библиотека генов вируса АЧС штамма «Волгоград-14с» (генотип II, сероиммунотип 8), представляющая собой рекомбинантные плазмиды, несущие нуклеотидные последовательности, кодирующие иммунодоминантные белки р17, р54, СD2v.
Впервые в Российской Федерации получены рекомбинантные плазмиды экспрессирующие рекомбинантные белки р17, р54 и СD2v в клетках COS-1 и НЕК-293T/17.
Получен прокариотический продуцент рекомбинантного эпитопа протеина р17 вируса АЧС.
Показана возможность использования рекомбинантных белков р17, р54 и СD2v в иммунологических реакциях.
Научная новизна подтверждена патентами № 2571855 от 20.12.2016 г. и № 2571858 от 20.12.2015 г.
Теоретическая и практическая значимость исследования:
1. В составе плазмид pUC19 Vect r (NEB, США) и pGEM-T-easy (Promega, USA) получена библиотека генов 117L (р17), E183L (р54) и EP402 (С 2v) вируса АЧС штамм «Волгоград-14с».В составе эукариотических экспрессирующих векторов В составе эукариотических экспрессирующих векторов pEGFP-N1 (Clontech, США) и pCMV-HA-C (Clontech, США) получены полноразмерные копии генов 117L (р17), E183L (р54) и EP402 (С 2v).
-
получены полноразмерные копии генов D117L (р17), E183L (р54) и EP402 (С 2v).
-
Получен прокариотический продуцент рекомбинантного эпитопа белка р17 вируса АЧС.
-
На заседании ученого совета 29.11.2016 года утвержден протокол комиссионных испытаний соответствия паспортным данным клона- продуцента рекомбинантного эпитопа белка р17 (E. coli Rosetta 2 (DE3) pLysS pET32a/ASFV/p17ep/2), который депонирован в музее бактериальных штаммов и микоплазм III-IV групп патогенности ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под инвентарным номером 740.
Методология и методы исследования. Методология проведенных
исследований включает стандартные процедуры с использованием различных
материалов. В работе использовали биоинформатические методы (анализ
вариабельности, определение уровня гликозилирования, анализ гидрофильности
(растворимости), анализ наличия трансмембранных доменов); молекулярно-
биологические (ПЦР, секвенирование, клонирование, экспрессия); вирусологические
(поддержание клеточных линий, вирусвыделение, культивирование вируса), физико-
химические (составление растворов заданной молярности и оценка концентрации
различных веществ), серологические (ИФА, РПИФ, ИПТ, ИБ МЭБ), а также
световую и флуоресцентную микроскопии.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Библиотека генов 117L (р17), E183L (р54) и EP402 (С 2v) вируса АЧС
штамм «Волгоград-14с» может использоваться в качестве источников нуклеотидных последовательностей генов вируса АЧС для генно-инженерных манипуляций, разработки диагностикумов и получения рекомбинантных белков вируса АЧС.
-
Рекомбинантные белки р17, р54 и С 2v экспрессируются в перевиваемых линиях клеток млекопитающих COS-1 и НЕК-293T/17.
-
Продуцент E. coli Rosetta 2 (DE3) pLysS pET32a/ASFV/p17ep/2, экспрессирующий рекомбинантный эпитоп белка р17, подходит для наработки антигена с целью использования в иммунологических реакциях.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором
самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам
лабораторий: Молекулярной вирусологии (к.б.н. И.А. Титов, к.б.н. Бурмакина Г.С.). Автор выражает признательность сотруднику ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» И.Р. Иматдинову и сотруднику ОАО МБЦ «Генериум» С.А. Каторкину. Исследования проведены в лаборатории Молекулярной вирусологии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.
Работа выполнена при поддержке:
Фонда губернатора Владимирской области в рамках проекта
«Конструирование эукариотической системы экспрессии генов вируса африканской
чумы свиней»; Фонда Содействия Предприятиям в научно-технической сфере
СТАРТ-2013 (Н5-Биотехнология) в рамках проекта 12075/22832, 2013-2014 гг;
Совета по грантам Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых и по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации в рамках проектов МК-1843.2013 (2013-2014 гг.) и МК-60875.2015 (2015-2016 гг.).
Степень достоверности и апробации результатов. Достоверность всех
экспериментальных показателей подтверждена статистическими критериями и
комиссионными испытаниями. Результаты исследований по теме диссертации
доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ
Россельхозакадемии (2012-2016 гг.), Молодежной научной конференции
«Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва 2014, 2016 гг.); IV Международной научно-практической конференции «» (г. Ульяновск, 2014), X Международном конгрессе «Ep z e» (г. Монпелье, Франция, 2015 г.).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 22 рисунками. Список литературы включает 267 источников, из которых 242 иностранные.
Генетическая вариабельность
Вирус африканской чумы свиней является крупным оболочечным вирусом икосаэдрической форм размером около 200 нм. Структура вириона образована различными концентрическими слоями: ядро, ядерная оболочка, внутренняя мембрана капсида и, у внеклеточных вирионов имеется внешняя оболочка [99, 137].
Вирионы имеют сложную многоуровневую структуру, состоящую из нуклеоида или ядра размером 30 нм (образует нуклеопротеидную систему, состоящую из вирусного генома и различных ферментов, необходимых для репликации), ядерной оболочки размером 80 нм, первого липидного слоя (внутренняя оболочка) размером 170-190 нм, который составляет икосаэдрический капсид. Внеклеточные вирионы получают наружную мембрану в процессе почкования через мембрану клеточной плазмы [55]. Геном вируса АЧС представлен двух цепочечной молекулой ДНК и варьирует по длине от 170 до 190 т.п.о., и содержит концевые тандемные повторы. Различия в длине генома между изолятами вируса, объясняются вставками или делециями последовательностей в левом и правом концах генома [62].
Вирус АЧС содержит от 160 до 175 открытых рамок считывания (ОРС), в зависимости от изолята. Из них 110 рамок считывания представлены одной копией у всех изолятов вируса. Другие ОРС принадлежат шести различным мультигенным семействам (MGF100, MGF110, MGF300, MGF360, MGF530 и Р22), расположенных в правом и левом концах генома [39].
Организация этих мультигенных семейств предполагает, что они эволюционировали путем процесса дупликации и расхождения последовательности. Существование нескольких копий генов MGF, может давать селективное преимущество вирусу, и представляет собой механизм уклонения вируса от иммунного ответа хозяина.
Из всех консервативных ОРС кодируемых геномом АЧС, известны функции 39 белков. Мотивы, гомологичные с другими белками содержат 42 вирусных белка, и 28 белков имеют неизвестные функции. До сих пор, 17 ОРС были идентифицированы как кодирующие структурные белки вируса АЧС.
Так как, вирус АЧС реплицируется в цитоплазме, гены ферментов и факторов, необходимых для транскрипции и репликации ДНК также включены в геном вируса. Установлен целый ряд вирусных белков, которые не являются необходимым для репликации вируса и участвуют в взаимодействиях с хозяином, и представляют важные факторы вирулентности и эвазии [31, 39, 49, 60, 218].
Внутреннее ядро вируса АЧС формируется нуклеоидом, и содержит вирусный геном и некоторые нуклеопротеиды: такие как ДНК-связывающий белок p10 [210, 231]. Также в этот слой интегрированы элементы, необходимые для начала синтеза матричной РНК (мРНК): белки, участвующие в транскрипции, поли (А)-полимеразы и ферменты упаковки [218]
Белковая ядерная оболочка представляет собой толстый слой, который окружает ядро и в основном состоит из полипротеинов PP220 и РР62. Оба полипротеина последовательно расщепляются вирусной протеазой (кодируется геном S273R) на белки p150, p37, p14, p34 и p35, p15 соответственно, которые вместе образуют 32 % от общей массы вириона (16, 60, 84, 215].
Внутренняя оболочка примыкает к ядерной оболочке и под электронной микроскопией выглядит как единый липидный слой [218]. Эта мембрана является производным от эндоплазматического ретикулума (ЭР) и вирусных белков p54, p17 и p12, которые являются составляющими структуры капсида [61, 66, 218].
Капсид является внешним слоем внутриклеточных вирионов, и состоит примерно из 2000 капсомеров гексагональной формы. Белок р72 является основным белком капсомеров и составляет одну треть от общей массы вириона [137, 153].
Внешняя мембрана или внешняя оболочка внеклеточных вирусных частиц аналогична клеточной плазматической мембране. Она приобретается в процессе выхода вируса АЧС из клетки [99, 137]. Дополнительно, оболочка вируса содержит вирусный белок p12, который был идентифицирован как фактор, необходимый для прикрепления вируса к клетке [41]. Другой белок внешней мембраны является вирусным гомологом клеточного белка CD2 (CD2v), который опосредует гемоадсорбцию инфицированных вирусом АЧС клеток [45, 67].
Методы исследований
Вирусы. В работе использованы следующие вирусы, полученные из Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии: штамм вируса АЧС Волгоград-14с (генотип II, сероиммунотип 8, инвертарный № 3001); штамм вируса АЧС КК-262 (генотип I, сероиммунотип 2, инвертарный № 1831); штамм вируса АЧС Ставрополь-01/08 (генотип II, сероиммунотип 8, инвертарный № 2783). Клеточные линии. Перевиваемые линии клеток COS-1, НЕК-293T/17, Vero, депонированные в музее клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии; первичные культуры клеток костного мозга и макрофагов свиней. Сыворотки и иммуноглобулины. Сыворотки крови от домашних свиней, зараженных вирусом АЧС 8, 2 сероиммунотипов; сыворотки крови от интактных домашних свиней; иммуноглобулины: Anti-His G-HRP Antibody (NEB, США), Goat anti-rabbit lgG-HRP (Santa Cruz Biotechnlogy, США); GFP (FL) rabbit polyclonal lgG (Santa Cruz Biotechnlogy, США); goat anti-mouse lgG-HRP (Santa Cruz Biotechnlogy, США); goat anti-swine lgG-HRP (Santa Cruz Biotechnlogy, США); HAag Rabbit mAb (Cell Signaling Technology, США).
Питательные среды и растворы для культивирования. Питательная среда для культур клеток ДМЕМ в комплекте с L-глутамином (производства ФГУП «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов» им. М.П. Чумакова); фетальная сыворотка крови телят (FBS, фирма «HyClone», США); питательная среда для культур клеток Advanced DMEM/F1(1x) (Gibco, США); питательная среда для культур клеток opti-MEM (1x) + GlutaMAX (Gibco, США); Sodium Pyruvate 100 mM (Gibco, США); незаменимые аминокислоты MEM NEAA (100x) (Gibco, США); 0,02% - ный раствор версена (pH 7,3-7,5); 0,25% раствор трипсина (pH 7,5-7,6); антибиотики: гентамицин, пенициллин, ампициллин, хлорамфеникол, мясопептонный агар, среда Китт-Тароцци, тиогликолевая среда, мясопептонный бульон, среда Сабуро. Плазмиды и бактериальные штаммы. Для клонирования использовали плазмидные вектора pGEM-easy (Promega, USA), pUC19 Vector (NEB, США) и экспрессирующие вектора pEGFP-Nl (Clontech, США), pCMV-HA-C (Clontech, США), pET32a (Novagen, США). В качестве компетентных клеток использовали клетки E.coli Dh5a (NEB, США) и Е. coli Rosetta (DE3) pLysS (Novagen, США).
Коммерческие наборы. Набор для очистки ДНК от агарозного геля QIAquick Gel Extraction (QIAGEN, Германия); набор для выделения плазмиды QIAGEN Plasmid Mani (Midi) Kit (QIAGEN, Germany); ИФА- набор для обнаружения антител к вирусу АЧС INGEZIM PPA COMPAC (Ingenaza, Испания); «Набор препаратов для дифференциальной иммунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней, классической чумы свиней и болезни Ауески» (ГНУ ВНИИВВиМ, Россия); набор лабораторных реагентов для выделения плазмидной и общей ДНК (QIAGEN, Германия); набор для очистки и концентрирования ДНК DNA Clean and concentrator ТМ-5 Kit (50) (Zymo Research, США); Набор для клонирования pGEM(R) Easy I.
Белки и ферменты. Бычий сывороточный альбумин кристаллический (AMRESCO, США), маркеры молекулярных масс для SDS-ПААГ - электрофореза Unstained Protein Ladder, Broad Range 10-250 kDa (NEB, США), Prestained Protein Marker, Broad Range 7-175 kDa (NEB, США), ДНК-лигаза фага T4 (NEB, США), ингибитор протеаз Protease Inhibitor (CALBIOHEM, США). Рестриктазы: EcoRI, Xhol, BamHI, Agel, Sad, Kpnl, Apal (NEB, США). Taq-ДНК-полимераза ( фермент, Россия), PfuURBO- полимераза (Thermo Scientific, США).
Кислоты и основания. Трис (Applihem, Германия), уксусная кислота ледяная, соляная кислота (ЗАО «Каустик», Россия), едкий натрий (Appliсhem, Германия), лимонная кислота безводная (Appliсhem, Германия).
Хромогены и красители. Кумасси голубой R 250 (Applihem, Германия); 0,5%-ный водный раствор трипанового синего; Clarity Western ECL Substrat («Bio-Rad», США) и DAB («Thermo Scientific», США); Pounceu S (Applihem, Германия).
Соли. Додецил сульфат натрия (Applihem, Германия), хлорид калия (Applihem, Германия), EDTA (Хеликон, Россия), калия фосфат однозамещенный (Хеликон, Россия), натрия фосфат двузамещенный (Хеликон, Россия), натрий хлористый (Хеликон, Россия), натрия гидрокарбонат (Хеликон, Россия), магний сернокислый (Хеликон, Россия), натрия ацетат безводный (Хеликон, Россия), натрия пируват (Хеликон, Россия), хлорид магния 6-водный (Диаэм, Россия), имидозол (Applihem, Германия), мочевина (Applihem, Германия), хлорид рубидия (Applihem, Германия), гуанидин тиоционат (Диаэм, Россия), глицин (Applihem, Германия), хлорид кальция (Applihem, Германия), магний хлористый 2-водный (Диаэм, Россия), гуанидин хлорид (Диаэм, Россия)и другие.
Реактивы. 5х реакционный буфер Амплисенс Blue (Интерлабсервис, г. Москва), 5х реакционный ПЦР буфер (Fermentas, Латвия), смесь нуклеозидтрифосфатов dNTP mix 25 mM (Fermentas, Латвия), специфические олигонуклеотиды и флуоресцентные зонды (Литех, Москва; Евроген, Москва), Вig dye v.3.1. terminator (Applied Biosystems, CША), полимер POP 7 (Applied Biosystems, CША), акриламид 40% Acrylamide/Bis Solution (BioRad, США); готовый реактив для измерения концентрации белков по методу Бредфорда Quick Start Bradford 1x Dye Reagent (BioRad, США); N,N,N,N, тетраметилэтилендиамин (TЕMED; TD) (Panreac, Испания), диметилсульфоксид (DМSО) (Applihem, Германия), -меркаптоэтанол (Applihem, Германия), IPTG (Fermentas, США), ацетат натрия (Applihem, Германия), персульфат аммония (Applihem, Германия), молоко обезжиренное (Applihem, Германия), Твин-20 (Applihem, Германия), тритон Х-100 (Applihem, Германия), парафармальдегид (Applihem, Германия) и др.
Буферы. 50-кратный электрофорезный буфер ТАЕ; бромистый этидий (3,8-Диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид); буфер для проведения SDS-PAGE электрофореза 10х Tris/Glycine/SDS Buffer (BioRad, США); цитратный буфер (Applihem, Германия); забуференный физиологический раствор; буфер для переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану Trans-Blot Turbo 5x Transfer Buffer.
Анализ гидрофильности белков вируса АЧС
Следующим этапом нашей работы стало реклонирование полноразмерных копий генов из клонировочного вектора в экспрессирующий. Для этого были наработаны препаративные количества рекомбинантных плазмид, кодирующих полноразмерные гены D117L, E183L и EP402. Далее плазмиды подвергались растрикции по специфическим сайтами эндонуклеаз рестрикции представленными для каждого гена в таблице 1. После рестрикции смесь подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле. В результате были получены фрагменты, соответствующие размерам вставок. Фрагменты необходимой длины вырезали из агарозного геля и очищали с применением коммерческого набора. Акцепторные вектора, так же обрабатывались специфическими для каждого гена эндонуклеазами рестрикции, с целью получения липких концов и увеличения эффективности лигирования. Так же, данный подход позволил попасть в одну рамку считывания с промотором, закодированным в акцепторных векторах. Проведенное лигирование обработанных векторов и очищенных вставок генов позволило получить экспрессирующие конструкции р17pGFP-N1, р54pGFP-N1, CD2vpCMV-HA-C представленных на рисунке 12.
Рекомбинантные плазмиды: pGFP-N1 со встроенным по сайтам рестрикции AgeI и BamHI, геном D117L (p17); pGFP-N1 со встроенным по сайтам рестрикции SacI и EcoRI геном E183L (p54) и pCMV-HA-C со встроенным по сайтам рестрикции EcoRI и BglII геном EP402 (CD2v). Где: Kan/neoR- ген устойчивости к антибиотикам; SV40 early promotor- ранний цитомегаловирусный промотор; SV40 ORI- ген инициации репликации. Конструкции с остальными генами получали аналогичными методами. Скрининг полученных клонов проводился реакцией ПЦР и рестрикционным анализом. На рисунке 13 представлены результаты скрининга клонов р54pGFP-N1 и CD2vpCMV-HA-С. Правильность ориентации вставленных генов и рамку считывания проверяли секвенированием. В результате анализа, были отобраны следующие клоны: 3р17pGFP-N1, 5р54pGFP-N1, 7р54pGFP-N1, 3CD2vpCMV-HA-С. Остальные клоны имели нуклеотидные замены, приводящие к неправильной открытой рамке считывания белков.
Для экспрессии рекомбинантных белков были выбраны перевиваемые линии клеток COS-1 и HEK-293Т/17. Выбор культуры клеток COS-1 обусловлен тем, что многие штаммы вируса АЧС способны реплицироваться в данной культуре клеток. Культура HEK-293Т/17 выбрана в связи с тем, что она широко используется для получения рекомбинантных белков. Клетки культивировались в среде ДМЕМ с добавлением 5 % фетальной сыворотки до достижения 70-80 % монослоя. Перед проведением трансфекции среду меняли на бессывороточную Opti-MEM.
Трансфекцию культуры клеток COS-I и НЕК-293T/17 рекомбинантными плазмидами (2,5 мкг/лунку) проводили в 6-ти луночных планшетах при помощи липофектамина (Invitrogene, USA) согласно инструкции производителя. 3.4 Оценка уровня экспрессии и локализации рекомбинантных белков р17GFP, р54GFP
При помощи флуоресцентной микроскопии был проведен анализ экспрессии рекомбинантных белков и определена их внутриклеточная локализация в трансфецированных клетках COS-1 и HEK-293Т/17. Репортерную флуоресценцию р54EGFP наблюдали в цитоплазме трансфецированных клеток СOS-1 на протяжении 96 ч. Наиболее сильный сигнал отмечали между 24 и 48 ч после трансфекции, далее (в период с 72 до 96 ч) он снижался.
Так как белки р17GFP и р54GFP имеют разные уровни экспрессии в разное время после трансфекции, это может повлиять на их распределение в клетках. Локализация и экспрессия белков динамически наблюдалась на 6, 12, 24, 48, 72 и 96 час после трансфекции. Результаты показали, что экспрессия белка р54GFP появляется на 5-6 час после трансфекции. Экспрессия белка р17GFP начинается несколько позже, чем экспрессия белка р54GFP (6-7 час после трансфекции). Однако, к 24 часам после трансфекции экспрессия обоих рекомбинантных белков постепенно увеличивается, достигает своего максимума на 48 час и далее ее уровень не изменяется. В течение всего времени экспрессии локализация белков р17GFP и р54GFP в клетке не менялась, изменялась только интенсивность флюоресценции данных белков.
Белок р17GFP наблюдался в цитоплазме трансфецированных клеток COS-1 и HEK-293Т/17 в виде клеточных включений, который неравномерно распределен по всей цитоплазме.
Белок р54GFP так же был локализован в цитоплазме, но в отличие от р17GFP, он был равномерно распределен по всей цитоплазме клеток.
Результаты исследований рекомбинантного белка CD2v в культуре клеток COS-1 и НЕК-293Т/17 показали, что он является исключительно компонентом мембраны клеток. Экспрессию белка выявляли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием коммерческих иммуноглобулинов к НА-участку (HAag Rabbit mAb (Cell Signaling Technology, США). Было показано, что белок CD2v интегрирован в клеточную мембрану трансфецированных клеток. В качестве контроля экспрессии, мы использовали экспрессию репортерного белка GFP. Данный белок был показан как рассеянный сигнал в цитоплазме и ядрах клеток на 6-96 час после трансфекции, кроме того, его локализация в клетке не менялась в зависимости от уровня экспрессии.
Иммунопероксидазный тест для выявления рекомбинантных белков в трансфецированных эукариотических клетках
В ходе биоинформатического анализа было определено, что белки p17, р54 и CD2v имеют трансмембранные домены, внеклеточные и внутриклеточные участки. Структурные белки р54 и СD2v вируса АЧС являются основными вариабельными компонентами вируса и обладают высокой степенью гликозилирования, что указывает на место их пострансляционных модификаций. Причем для белка р54 преобладает О- гликозилирование, а для белка CD2v более выражено N- гликозилирование. В то время как белок p17 является консервативным и не претерпевает пострансляционных модификаций. Это является следствием того, что он выполняет функцию молекулярного шаперона и поэтому остается стабильным.
Проанализированный профиль гидрофильности показал, что белки р17 и р54 сложно растворимы, но при этом имеют растворимые иммуногенные эпитопы. Белок CD2v является растворимым, но при получении его в прокариотах, он не сможет выполнять свои функции потому, что для этого ему необходимо пройти процесс гликозилирования.
На основе результатов биоинформатического анализа были выбраны гены и участки для конструирования рекомбинатных ДНК.
Для дальнейшей работы с генами, кодирующими белки вируса АЧС получена библиотека полноразмерных генов р17, р54 и СD2v вирулентного штамма (Волгоград-14с) вируса африканской чумы свиней в составе клонировичного вектора pGEM-easy.
Далее библиотека генов вируса АЧС использовалась для получения рекомбинантных конструкций под контролем цитомегаловируса, экспрессирующие белки p17, р54 и CD2v в составе векторов р17pGFP-N1 для белков p17, р54 и CD2vpCMV-HA-C для белка CD2v в перевиваемых линиях клеток млекопитающих COS-1 и НЕК-293Т/17.
Нам удалось впервые в нашей стране получить систему экспрессии, которая экспрессирует рекомбинантные белки вируса АЧС в перевиваемых линиях клеток млекопитающих. Использование таких экспрессирующих систем позволяет получать сложно растворимые белки в растворимой форме. Данный подход позволяет изучать функции вирусных белков, в условиях приближенных к естественным, так как вирус АЧС может адаптироваться к используемым линиям клеток. В нашем случае были использованы перевиваемые линии клеток COS-1 и НЕК-293Т/17. Их выбор для исследований был обусловлен тем, что данные линии повсеместно используются для получения рекомбинантных белков. Еще одним критерием была возможность прохождения рекомбинантными белками полноценного процессинга, к тому же в нашем институте был получен адаптированный к линии клеток COS-1штамм вируса АЧС (патент № 2575079, бюл. № 4 от 10.02.2016 г.).
Экспрессиия рекомбинантных белков показала, что характер распределения экспрессированных рекомбинантных белков р17, р54 вируса АЧС в цитоплазме трансфецированных клеток различный.
В трансфецированных клетках белок р17 расположен рядом с энодплазматическим ретикулом. Возможность этого белка связываться с компонентами клеточной мембраны объясняет его неравномерное распределение в трансфецированных клетках.
Белок р54 равномерно расположен в клетке и локализуется в непосредственной близости с клеточным ядром, там же в свою очередь, располагаются вирусные фабрики вируса АЧС.
При анализе белка CD2v, его флуоресценция накапливалась по периферии трансфецированных клеток, поэтому можно сделать заключение, что он интегрирован в клеточную мембрану клеток.
Различными методами показана возможность использования полученных рекомбинантных белков в иммунологических реакциях. Иммуноферментный анализ позволяет выявлять полученные рекомбинантные белки в лизате клеток, трансфецированных плазмидами р17pGFP-N1, р54pGFP-N1, в разведении 1:64. Метод иммуноблотинга показал, что рекомбинантные белки р17, р54, CD2v специфически взаимодействуют с гипериммунными сыворотками от зараженных вирусом АЧС свиней (штамм Волгоград-10/19с, генотип II, сероиммунотип 8). При этом, белок р17 образует специфические полосы с молекулярной массой, не соответствующей расчётной.
Для получения растворимого рекомбинантного эпитопа белка р17 в клетках E. сoli Rosetta 2, нуклеотидные последовательности, которые кодируют растворимую часть белка, были клонированы в прокариотический вектор рЕТ32а(+). Отработаны условия индукции рекомбинантного эпитопа белка р17 в клетках E. сoli Rosetta 2 и его очистки путем аффинной хроматографии на Ni-Sepharose 6 Fast Flow (Sigma, США). В результате очистки из 50 мл культуральной жидкости бактериальных клеток E. coli Rosetta 2 удалось получить 200 мкг белка, который также может использоваться в качестве антигена вируса АЧС в серологических реакциях.
В заключении стоит отметить, что высоковариабельные и гликозилированные белки вируса АЧС (p54 и CD2v) могут быть успешно получены в клетках мелекопитающих. Рекомбинантные вирусные белки выделенные из эукариотической системы остаются функциональными и являются аутентичными исходным вирусным белкам. Результаты исселдований демонстрируют возможность применения рекомбинантных белков вируса АЧС в иммунологических реакциях, а также для изучения патогенеза болезни и механизмов формирования иммуной защиты.