Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время во всем мире заболевания щитовидной железы являются наиболее распространенной эндокринной патологией после сахарного диабета. В связи с этим методы их диагностики вызывают особый интерес. В случае одной из наиболее тяжелых патологий новорожденных, первичного гипотиреоза, своевременно поставленный диагноз является первоочередным условием эффективности лечения. Во всех развитых странах в качестве первичного или скринирущего теста при оценке тироидного статуса используют измерение уровня тиреотропиого гормона гипофиза (ТТГ). Обнаружение повышенных или пониженных концентраций тиреотропина свидетельствует о вероятности гипо- и гипертиреоза соответственно и является основанием для более углубленного обследования функции щитовидной железы пациента. Из-за отсутствия отечественных диагностикумов, у нас применяют дорогостоящие радиоиммунологические, иммуноферментные и иммунофлюоресцеитные наборы зарубежных фирм Pharmacia, LKB-Wallac, Hoffman la Roche. В результате обследование сосредоточено в единичных центрах, кото-, рые не могут обеспечить существующие потребности, составляющие около 5 млн анализов ежегодно. Исходя из этого, разработка высокочувствительных диагностикумов для определения уровня тиреотропина с целью их внедрения в практику отечественного здравоохранения очень актуальна.
Наиболее эффективной основой создания таких тест-систем являются высокоаффинкые моноклональные антитела (МкАТ). Высокая специфичность МкАТ делает их идеальным инструментом для дальнейшего изучения иммунохимии тиреотропиого гормона человеїса в норме и при патологии, использования при приготовлении иммуносорбен-тов. Еще одним перспективным направлением применения антител к тиротропину является получение антиидиотипических антител, с помощью которых проводится изучение строения рецептора ТТГ на клетках щитовидной железы.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы является получение .моноклонапьных антител к тиреотропному гормону человека и конструирование на их основе высокочувствительного метода иммунофер-ментного анализа (ИФА) для количественного определения тиреотропина. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
-
Создание гибридом, продуцирующих, высокоаффинные „моноклональные антитела к тиреотропному гормону человека.
-
Характеристика полученных моноклональных антител -(специ-
- 2 -фичносгь, константа аффинности, изотип).
-
Выбор пары МкАТ различной эпигопной специфичности, перспективной для использования в диагностической иммуноферментной системе.
-
Разработка иммуноферментного метода для количественного определения ТТГ с чувствительностью не более 0,1 мМЕ/л.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Были разработаны оригинальные способы иммунивации мышей тиреотропином и тестирования первичных кланов гибридом, продуцирующих ыоноклональные антитела к ТТГ.
Впервые в отечественной пракгике получена и охарактеризована панель высокоаффинных ыоноклональных антител к тиреотропному гормону человека, не дающих перекрестной реакции с родственными гликопротеидными гормонами гипофиза (лютеинизирующнм, ЛТ, и фол-ликулостимулируюацш, ФСГ) .
На основе выбранной пары МкАТ различной специфичности разработаны два иммунсферментных метода для измерения концентрации ТТГ в диапазоне 0,02-6,00 мМЕ/л и 0,2-40,0 мМЕ/л. Подобраны оптимальные условия иммунохимической реакции и синтеза,проявляющих конъюгатов антител с пероксидазой хрена и биотином. Изучены линейность, воспроизводимость, специфичность определения тиреотро-пина с помощью двух вариантов ИФА.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Метод одностадийного ИФА для определения ГТГ в диапазоне 0,2-40,0 мМЕ/л по своим техническим параметрам пригоден для широкого клинического применения и в настоящее время подготавливается к прохождению межведомственных испытаний в учреждениях Ш России.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1. Разработка схемы иммунизации мышей препаратами ТТГ человека и способов тестирования первичных клонов гибридом. 2. Получение гибридом, стабильно продуцирующих высокоаффинные моноклональные антитела к ТТГ. 3. Характеристика антител и подбор пары МкАТ, перспективной для использования в иммуноферментной тест-системе для определения ТТГ. 4. Разработка на основе выбранной пары МкАТ методов ИФА для количественного определения тиреотропина с чувствительностью не более чем 0,1 мМЕ/л.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация апробирована 16 декабря 1992 г на заседании секции молекулярной и клеточной биотехнологии ученого совета НПО "Биотехнология". Материалы диссертации были представлены на Международной конференции "Медицинская биотехно-
логия, иммунизация» СПИД" (Санкт-Петербург,12-18 июня 1992 г.), II Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва,1990), I Съезде иммунологов России (Новосибирск, июль 1992 г.).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, 3 тезисов.
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы из 120 работ. Работа изложена на 103 страницах, содержит 10 рисунков и 5 таблиц.