Введение к работе
Актуальность темы. Гибридомная технология является одним ив важнейших и наиболее широко разработанных направлений современной иммунобиотехнологии. Метод получения лимфоцитарных гибридом, продуцирующих моноклонэльные антитела (МКА) веданной специфичности, был предложен в 1975-76 гг. Kohler G. , MUste-ln С. ив настоящее время применяется во всем мире для получения высокоспецифичных антител к самым равным антигенам, в том числе к гормонам. Высокая специфичность, чувствительность и активность МКА, а также возможность использования для первичной иммунизации животных слабо очищенного антигенного материала делают их удобным инструментом при работе с гормонами, так как позволяют решить проблемы, возникающие при получении анти-гормональных поликлональных сывороток. Поскольку получение полик-лональных сывороток к гормонам связано, прежде всего, с затратами больших количеств дорогостоящих высокоочищенных препаратов. Кроме того, очистка иммуноглобулинов поликлональных сывороток также крайне сложна и трудоемка (михеева Т. Г., Новохатский А. 0., и др. ,91). Особый интерес вызывает новое направление в исполь8ованиии МКА - их возможное применение в качестве терапевтических препаратов с целью воздействия на биологическую активность гормонов. Терапевтическое применение антигормональных поликлональных антисывороток затруднено из-за сложностей с их очисткой, недостаточно высокой специфичностью и наличия выраженных аллергических реакций.
В литературе отсутствуют какие-либо данные о влиянии мо-ноклональных антител на биологическую активность инсулина в организме животных и человека. В то же время получение антител к инсулину, обладающих протективным биологическим действием, позволило бы использовать их в качестве антидота при инсулиновой гипогликемической коме и широко применять в научно-исследовательских работах для изучения механизма дейсїеия инсулина, выявления структурко-функциощ тьных взаимосвязей в молекулу инсулина, а также для, создания на .их основе диагностических
тест-систем.
Первые сообщения о получении гибридом, продуцирующих МКА к инсулинам разной видовой специфичности, появляются в 1981 г. Schroer J. ,81, первая доложила о получении МКА к инсулину, с помощью которых она показала наличие эпитошв на молекуле инсулина. В дальнейшем ряд исследователей (Schroer J. ,83,85,Rathjen D., 1986, Shibier 0.,1988, Roth R. . 1982.85,88,92) также получили МКА к инсулину, которые использовали для изучения антигенной структуры инсулина, для разработки диагностических тест-сис тем (Holzapfel В., Wuttke W./89), и для создания иммунных сорбентов для очистки биологически активных веществ (Howang Y. Y., Healey М. С. ,88,). С'90 гг в печати появляются работы по использованию антиинсулиновых МКА для исследования биологической активности инсулина на различных клеточных моделях (Horejsi ч V., Hildert I., Kristofova Н., Satayalai 0.,89, Natae V., Monier S. ,92, Redmon В., Pyzdrowski K. L , 92). Однако, в доступной нам литературе не встречались работы,в которых исследовалось бы влияние МКА на биологическую активность инсулина in vivo. В 1960 гг опубликованы работы в этом-направлении с использованием поликлональной сыворотки к инсулину(Moloney P.J., Coval М.. 55, Armir J., Grant R. Т., Wright P. H., 60, Robinson D. Y. D., Wright P. H. ,61). Так, было показано, что введение по-ликлональных антител к инсулину нейтрализует его биологическую активность, но механизм, при помощи которого подиклональные антитела нейтрализовали биологическую активность инсулина, до сих пор неизвестен. Также было непонятно, как наблюдаекце различия в биологической активности поликлональных антиинсулино- . вых антител зависели от концентрации и аффинности этих антител.
Цель к задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась получение моноклональных антител к инсулину, обладающих протективной биологической активностью.
Для достижения указанной цели ставились следующие задачи:
- получить клоны гибридом, продуцирующие МКА к инсулинам
свиньи, крупного рогатого скота и человека;
-'получить клоны гибридом, продуцирующих МКА к С-пептидной части молекулы проинсулина;
провести иммуноферментиое тестирование специфической активности МКА;
определить видовую специфичность полученных МКА;
получить стабильные клоны и массовые культуры гибридом;
наработать асциткые препараты моноклональных антител;
методом ВЖХ получить очищенные препараты МКА и проанализировать их специфическую активность ;
отработать методы анализа антиинсулиновой активности МКА irv vivo;
изучить способность полученных клонов МКА воздействовать на гшюгликемическую активность инсулина in vivo..
Научная новизна. Разработана эффективная схема массового получения и отбора клонов гибридных клеток, продуцирующих МКА к инсулинам, а также селекции гибридом, секретирующих МКА заданной специфичности к инсулинам и проинсулинам крупного рогатого скота и свиньи. Отработаны методы препаративного получения и очистки с помощью ВЖХ моноклональных иммуноглобулинов к инсулину, пригодных для изготовления диагностикумов и биологически активных препаратов.
Экспериментально обоснована концепция получения монокло-йальных иммуноглобулинов, проявляющих антигипогликемическую активность в отношении инсулинов человека, свиньи и крупного рогатого скота.
Впервые получены моноклональные антитела к инсулину, инги-бирующие биологическую активность инсулина in vivo. Выявлены 4 гибридомы (ИН-2, ИН-3, МИК-1, МИК-7), продуцирующие МКА, которые обладают протективной антигипогликемической активностью in vivo, зависящей от дозы и времени введения МКА.
Разработаны методы анализа влияния МКА на биологическую
активность инсулина in vivo. Обоснована возможность применения МКА, подавляющих биологическую активность инсулина в качестве терапевтического агента при гипогликемической коме.
Получены ЫКА, избирательно взаимодействующие с О-пептидной частью молекулы проинсулина крупного рогатого скота и не имеющие перекрестной специфичности к инсулину.
Практическая ценность работы. Получены 5 гибридом серии ИН, 7 гибридом серии МИК, 6 гибридом серии ПИК и 5 гибридом серии ПИ, которые секретируют МКА, обладающие специфической активностью в отношении инсулина свиньи, крупного рогатого скота и человека. Получена 1 гибридома ПИК-3, МКА которой специфг іески взаимодействовали с проинсулииом крупного рогатого скота и не взаимодействовали с инсулинами свиньи, крупного рогатого скота и человека.
Стабильные и высокоактивные штаммы-продуценты моноклональ-ных антител к инсулину мЖ-1(К-1) (депонент N ВСКК/П/545Д от 21.03.9ІГ) и МИК -4(К-4) (депонент N ВСКК/П/546 от 21.03. 91 г), а также к проинсулину крупного рогатого скота ПИК-3 (депонент N ВСКК/П/531 от 16. 01.91г) депонированы во Всероссийской коллекции клеточных культур в Институте цитологии РАН, г. Санкт-Петербург.
Препараты МКА, взаимодействовавшие с инсулинами крупного рогатого скота, свиньи и человека серии МИК и ПИК. испольвовали в научно-исследовательских разработках ь Институте иммунологии РАМН и в ГИКиЖ Кл«н ПИК-3, продуцирующий моноклональные анти-, тела к проинсулину крупного рогатого скота успешно прошел испытания в НПО "Фермент", г.Вильнюс, Литва.
Отработана быстрая и требующая малых доа антигена методика иммунизации мышей инсулином и проинсулииом с целью получения высокопродуктивных клонов гибридом.
Отработаны методики тестирования специфичности и активности МКА к кнсулину методом иммуноферментного анализа с -использованием культуральной жидкости и самих клеток-продуцентов.
Отработана методика очистки МКА из культуралілой жидкости гибридом методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии, позволяющая полностью сохранить специфическую активность МКА.
Данная работа выполнена при участии с. н. с., к. б. н. Т. Г. Ми-
- 5 -хеевой, с.п. с. (Институт иммунологии РАМН), к.б. н. Г. О. Гудимой (Институт иммунологии РАМН), н.с., к.х.н. О. А. Юриным (Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов Нин-здравмедпрома РФ).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
Международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунизация, спид" в июне 19Є1 г. в г. Санкт-Петербурге;
Международной конференции Updating Course on Pancreatlo Diseases" в апреле 1992 г. в Г.Генуя;
Конференции "Культуры клеток в биотехнологии и ветеринарии" во Всеросийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеренарии им. Я. Р. Коваленко в те 1993 г. в г. Москве;
Четвертом Путинском Совещании "Культивирование клеток животных и человека" в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН в апреле 1994 г. в г. Пушино.
Ученом Совете ГИКиШ 28.09.89 г.
Шжлабораторном сове(Еании сотрудников ГИКиШ Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 3 работах. Подучено 3 свидетельства о депонировании.
Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных(исследований, обсуждения, выводов. Работа иллюстрирована 9 таблица л и 14 рисунками. Список литературы включает 205 источников из них 2? отечественных и 178 зарубежных авторов.
(
- б -