Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Перспективным направлением биотехнологии является получение биологически активных вешеств из культур клеток эукаоиог. Необкояииость использования сыворотки крупного рогатого скота при крупномасятабном культивировании этих клеток реэхо ограничивает возможности кетода и усложняет очистку препаратов вследствие нестабильности биологических свойств сыворотки, а также иэ-эа возможности попадания сывороточных белков в пояучаемье препараты. Наличие в сыворотке ингибиторов различных биологически активных вевеста не позволяет производить их эффективную наработку культурами клеток. Это определяет актуальность проблемы создания бессывороточных син-тетн еских сред (БСС) дія культивирования эухадоотических клеток.
В настоянеє время > отечественной биотехнологии использу
ется ряд эукариотическхх линия: rh-pa - продуцент урокинаэы,
сио - клетки, используемые при создании различных генно-киже-
керных продуцентов, линия Vero, применяемая при производстве
вакцин и другие. .
Ряд компонентов БСС являются обеими дяя культивирования эукариотических клеток, в то время как другие, и в первую оче<-редь. стимулируювие синтез необходимых биологически активных вешеств, - специфические для данной линии.
Наиболее распространенным компонентом БСС, разработанных за рубехом, являются факторы роста (ФР> - гормокоподобные по-дипептиды с низкими девствугаими концентрациями ио-гооо пкг / мл). Помимо использования их в бессьшороточном хультивкрова-нии, «акторы роста могут найти также вирохое применение в ме-кицинскоя практике при заживлении ран различной этиологии. ЗслелстЕме чего получение и выявление дополнительных дешевых
источников ФР. является актуальным. о
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоявец работы является исследование влияния эхэо- и эндогенных Факторов роста на про-лиферативную активность эукариотическкх клеток, в первую очередь линчи клеток (ui-t'A - продуцента урокинаэы, создание на основе ФР оессывороточнои ростовой среди, которая иояат быть использована в технологии получения этого тромболитика, а также при культивировании других важных для биотехнологии клеточных линии. При выполнении работы ставились следующие задачи;
-
Получение препаратов факторов роста фибробяастов (ФРФІ из мозга, гипофиза КРС и поиск альтернативных источников.
-
Исследование влияния ФР различной степени очистки на пролиферативную активность культуры клеток нн-ра и других культур.
-
Подбор компонентов бессывороточноя среды для культивирования клеток линии кн-і'А в бессывсроточнои среде в стационарных условиях и на микроносителе Cytode-.v-з и проведение 3Kq-периментов по длительному культивированию в этой среде.
4. Испытание БСС для культивирования других линия клеток.
6. Подбор компонентов БСС для повышения продукции уАП
клетками ЛИНИИ КН-РА. ' '
6. Получание препаратов ФРФ-подобньк факторов роста, из лиэата и- среды кондиционирования клеток линии нн-ра и изучение их Физико-химических и биологических свойств.
НАУЧНАЯ-НОВИЗНА РАБОТЫ. Для ряда клеточных линии в литературе списан состав бессьшорогочных' сред для культивирования эукариогическик клеток. В настоящей работе впервые в . навей crjaiie разработан постай Сессьвороточной синтетической среды с испольэсьанием факторов роста, обеспечивающий повышенную продукции гккши-ы - хорошо известного эффективного . троиболити-
ка. клетками линии rwi-гл'.и создавший возможность их длительного культивирования в стационарных условиях и на микроносителях. Показана эффективность использования разработанной БСС для длительного культивирования клеток других линий - сно, Vero, мн-зтз, СПЭВ, используемых в биотехнологии получения биологически активных веиеств и вапшн лля здравоохранения и ветеринарии. Выделены и охарактеризованы Физико-химические и биологнеские свойства кислого и основного ФРФ из различных источников животного происхождения и установлен ик стимулирую-вия зіфект на продукті» уАП. Обнаружены, выделены и охарактеризованы гепарин-связываемье оакторы роста из лизата и среды кондиционирования клеток линии rh-p\ - продуцента урокиназы. Показано, что по хроматографическому поведению, молекулярному весу « биологическим свойствам полученные Факторы илентичны основному и кислому ФРФ жив.'тного происхождения. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Практическая ценность заключается в повышении эффективности технологии получения тромболити-чесхого Фермента - урокиназы из культуры клеток rh-га. Разработанный в данной работе состав многокомпонентной БСС.и схема ее использования позволяет повысить содержание уАП 'в среде конлиционирования за счет ускорения выброса Фермента в среду и повышения суммарного уровня его активности. Сокращение стадии регенерации клеточного материала на среде, содержащей сыворотку, а также значительное снижение уровня вносимого белка позволяет получать въсокоочииенные препараты уАП не внося изменений в ранее разработанную схему очистки Фермента. Компоненты предложенной среды легкодоступны, дешевы. Показана также возможность их равноценной замены на препараты, полученные из отходов производств. Эффективность использования разработанной БСС для длительного культивирования ряда клеточных линий поэ-
волит упростить схему и снизить стоимость наработки биодоги-чески активных вевеств. продуцентами которых они являются.
Создан лабораторный регламент на производство факторов роста либробяастов из гипофиза крупного рогатого скота (утвержден на заседании Ученого Совета НИИ Биомедицкнскои технологии ИЗ СССР 16.11.88 г., протокол ь 18).
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы исследования были доложены на Все-сосэнои научной конференции "Новые направления биотехнологии" /Пувино, 1986/; на ш Всесоюзной научно-технической конференции "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтических препаратов" /Москва, 1987/; на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" Ленинград, 1987/; на Всесоюзной конференции " Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии" /Махачкала, 1988/; на ю-ой конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных соединения" /Рига, 1988/; на Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" /Ленинград, 1989/; на ш Всесоюзном совепа-иии " Культивирование клеток животных и человека " / Пуиино,
1990 /.
Основные материалы диссертации опубликованы в и печатных работах.
СТРУКТУРА И ОБЬЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов исследования, собственных экспериментальных данных и их обсуждения, основных выводов и списка литературы.
диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит п таблиц и зі рисунок. Список литературы включает 125 источников, из них 16 отечественных и 109 зарубежных.