Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулину класса М рогатого скота Ездакова, Ирина Юрьевна

Введение к работе

Актуальность темы. Интенсивное развитие иммунохимии белков подтвердило важную роль иммуноглобулинов в защите организма от инфекционных и кеинфекционных болезней животных и человека. Иммуноглобулины класса М - первый и основной иммуноглобулин, синтезируемый в раннем первичном иммунном ответе. Идентификация и количественное его определение в отологических жидкостях организма животных является важным тестом для диагностики острых инфекций и оценки .иммунного статуса (Z.Trainin, H.Ungar-Waron, 1931; J.P.siegei, J.s.Remington, 1983; В.Ы.Чекишев, 1983; Ю.Н.Федоров, 1984; A.Tisoher, E.Gerllce, 19S6; J.D.Gail et al., 1986; F.bluller, 1986; P.Westenbrink,. Т.О.Кілиіап, 1987; G.Florent, A.Wiseman, 1990). Однако, выявление lgK-антител не нашло пока широкого практического применения, вследствие отсутствия' доступных высокоспецифических стандартных препаратов для их идентификации. Получение моноспецифических антисывороток к igM связано с определенными трудностями, так как выделение шмунохимически чистого IgM в нужной для иммунизации животных концентрации - процесс весьма трудоемкий. Антисыворотки к иммуноглобулинам класса М, получаемые на лабораторных животных, обладают существенными недостатками, такими как, низкая активность, гетерогенность, перекрестная реактивность с другими иммуноглобулинами.

Разработанная Келером и Мильштейном (1975) технология получения
гибридом, продуцирующих., моноклональные' антитела .заданной
специфичности, открыла новые пути в методах иммунологических
исследований. Клеточные гибриды на основе клеток миеломы и
антителопродуцируицих . лимфоцитов мышей BALB/o используются для
получения моиоклональных антител к различным антигенам, включая
антигены вирусов, бактерий, паразитов, клеток крови, а также к
иммуноглобулинам (М.Pindar et. al., 1980; S.Srikumaran et al.,1983;
P.S.Paul et al., 1935; K.J.Beh, 1988; R.A. Goldsby et al.,1987;
D.tf.Estes et al.,1990; D.J.L.Williams et al.,1990; О.А.ВерховскиЙ,
19ЭГ). . ..'.'.

Гибридомы являются стабильным продуцентом антител строго определенной спещфгшости, одного изотіша, напразлешшо к одному эштопу антигена. Моноклональные антитела можно получать в неограниченном количестве с минимальными затратами. Проблема'

получения гибридом - постоянного продуцента моноклональных антител заданной специфичности яеляєтся актуальной, что определило выбор теми и направление , исследований.

Целью настоящей работы было получение гибридом, продуцирующих моноклоналыше антитела к иммуноглобулину класса М рогатого скота, и их иммунохкмическая характеристика, а также разработка тест-системы для количественного определения уровня IgM в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец.

В работе были поставлены задачи:

1. Оптимизировать условия выделения и очистки иммуноглобулинов класса М из сыворотки крови крупного рогатого скота и овец.

2. Отработать технологию получения гибридом и получить штамм гибридных клеток, продуцирующих моноклоналыше антитела к IgM крупного рогатого скота и овец.

3. Отработать условия выделения и очистки моноклональных антител из культуральных и асцитичёских жидкостей.

4. Дать иммунохимичесную характеристику полученным мошклональным антителам к IgM.

5. Получить препараты моноклональных антител к IgM рогатого скота и на их основе создать диагностические тест-системы для индикации и количественного определения иммуноглобулинов этого изотипа Е биологических жидкостях.

Научная новизна. Получен штамм гибридных культивируемых клеток животных mus.MuscuIub - продуцент моноклональных антител и иммуноглобулинам класса М рогатого скота ( авторское свидетельство Ji 1560549 от 3.01.90 г.). Штамм депонирован в Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН, г. Санкт-Петербург.

Оптимизированы условия выделения и получения иммунохимичесю чистого IgM крупного рогатого скота и овец, отработана технологии получения гибридом и моноклональных антител к IgM '< ..'схем* иммунизации, обеспечивающая высокую ^: эффективность полученш антителопродуцирувдих клонов гибридом, гибридизация иммунны: лимфоцитов селезенки' с клетками шеломы, тестирование продукщи гиоридомами специфических антител в культуральных /и асцитически; жидкостях методом РИД и ИФА).

Получены моноклоналыше антитела специфически взаимодействущи с иммуноглобулином класса М крупного рогатого скота, овец, коз : оленей.

: Определены ишунохимические . характеристики моноклоналышх антител к IgM рогатого скота, ігродунируемие клонами: В₃,С2,С₄,С₇,С_ІІ,о_д,Е₅, показана их активность и специфичность в РИД, ИФА и икмуноблоттинге.

Установлено, что для использования в тест-системах моиоклональных антител клонов С₂,С₄ и G₉, необходимо сочетание вариабельных и константных областей в молекуло IgM, так как полученные !ЖА являются ксяформационно-завясимымн.

Полученные клоны гибридом, ігоодуцирувдие моноклональше антитела к IgM рогатого скота, являются основой для создания высокоэффективных диагностических тест-систем по выявлению ранних форм инфекций и внутриутробного инфицирования плодов крупного рогатого скота и овец, оценки качества фатальных сывороток для биотехнологии.

Практическая ценность работы. Получена коллекция гибридом, секрэтирустшс монсклоналышэ антитела к иммуноглобулину класса' М рогатого скота, открывзпцая перспективу разработки диагностических препаратов на основе различных тест-систем.

На основе полученных }ЖА к IgM рогатого скота приготовлены реагенты для количественного определения уровня иммуноглобулинов класса М в биологических жидкостях организма гшвотных методом РИД и ША, а также выявления ранних l^l-антктел в сыворотке крови.

Материалы диссертации вошли в "Лабораторный регламент по изготовлению 'и контролю набора препаратов для количествеїшого определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма яивотвих катодом радиальной икмунодиффузии и в реакции лзтекс-агглатпнации'' (І99І-І992 гг.).

Разработана методика и получены аидкяэ а лиофилизированвые препараты іящоклоналіннх антител из асцитзческих жидкостей и конъкгата их с порокспдазоп хрона для использования в даапюстичосгапс тост-систэмах на основа РИД, РДП, ИФА, РЛА для качественной и количественной индикации иммуноглобулинов и 1и-антит9л. .

Апробация работы Оснопгаэ результаты работы дологэш на:

конференции молодых ученых ВИЭВ (1987 г.);

Всосовэной научно-технической конференции:

"Пргменвниэ биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и

ветеринарной медицине"» Ленинград (1988 г.);

- Всесоюзной научной конференции:

"Теоретические и практические вопроси ветеринарии", Тарту (1988 г.);

- Всесоюзной научной конференция:

"Интенсификация производства в отраслях АПК на основе использования методов биотехнологии", Минск (1989 г-);

Научной конференции ВНИИВВИМ, Покров (1992 г.);

меклабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (1994 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано девять научных работ"!

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты исследований по выделению, очистке иммуноглобулинов класса И крупного рогатого скота и овец.

2. Технология получения гибридных клеточных культур (гибридом), секретирующих моноклональные антитела к igM рогатого скота....

3. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgM рогатого скота, определение . их активности, специфичности и пригодности для выявления IgM в биологических жидкостях организма животных.

4. Получение реагентов и разработка диагностических тест-систем на основе РИД и ИФА.

Объем и структура диссертации. Диссертационная, работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предлокений и списка литературы.

Материалы диссертации иллюстрированы 9 рисунками и 6 таблицами. Список литературы включает 217 источников.