Получение гиперицинов в клеточных культурах зверобоя продырявленного (HypericumperforatumL.) Чарчоглян, Армен Геворкович

Введение к работе

з

Актуальное» проблемы. Изучение способности растительных клеток к синтезу различных вторичных метаболитов in vitro является одной из актуальных проблем современной биотехнологии. Изучение вторичного метаболизма в культуре клеток может выявить ряд закономерностей, таких, как синтез практически всех классов соединений вторичного обмена, общие тенденции связи между сложностью структуры и специфическими этапами синтеза, вероятность биосинтеза этих соединений в культуре клеток и, наконец, обратную связь между синтезом вторичных соединений с клеточной пролиферацией (Носов, 1994). Выход различных веществ in vitro можно увеличить в 10 раз и больше, по сравнению с интактным растением, но для этого необходимо разработать новые стратегии скрининга, селекции, регуляции вторичного метаболизма на всех уровнях (гены, энзимы, продукты, транспорт и компартменты), а также сопоставления вторичного метаболизма in vivo и in vitro, особенно если искомый продукт образуется в малых количествах:

Hypericum perforatum L. является традиционным фитофармацевтическим растением, экстракты которого обладают выраженной антидепрессивной (Раук, 1994; Hubner et al., 1994), а также анттаковой и антивирусной активностью (Moraleda et al., 1993; Anker et al., 1995).

Учитывая высокую потребность в физиологически активных компонентах И. perforatum - гиперицине и псевдогиперицине, в настоящее время широко исследуются возможности их получения с использованием растительных клеточных культур (Zdunek , Allfermann, 1992; Kartnig et al., 1996; Cellarova 1995). Однако, удовлетворительная продуктивность гиперицинов in vitro пока не достигнута, что обусловлено лимитированностью наших представлений как о физиологических особенностях этих культур, так и путях биосинтезов диантронов и их производных. Высокая фармацевтическая эффективность Н. perforatum, как лечебного растения и ограниченность природных рессурсов приводит к необходимости изучения возможностей получения его вторичных метаболитов в in vitro условиях.

Цель исследования. Основной целью настоящей работы являлось исследование возможности индукции биосинтеза гиперицина и псевдогиперицина в клеточных культурах зверобоя продырявленного (Н. perforatum L)

Задачи иследовання. В соответствии с целью исследования в работе были поставлени следующие задачи:

1. Получение стабильных, длительно пассируемых каллусных и суспензионных клеточных культур зверобоя продырявленного {Н. perforatum ^-продуцентов гиперицина и псевдогиперицина, а также исследование их регенерационных способностей.

2. Индуцирование и стабилизация биосинтеза гиперицина и его производных in vitro.

3. Исследование связи вторичного метаболизма с образованием дифференцированных (морфогенных) структур, а также разработка методов получения высокопродуктивных множественных побеговых культур (multiple shoot) Н. perforatum.

4. Исследование возможности получения длительно пассируемых глобуляр-

4 ных структур в суспензионных клеточных культурах Н. perforatum, исследование их параметров и закономерностей роста и индукции в них вторичного метаболизма.

5. Определение возможности стимулирования продуктивности клеточных культур по отношению к гиперицину и псевдогиперицину элиситорами различной природы (дрожжевой экстракт, маннан, (3-1,3-глюкан и пектин).

Научная новизна. Впервые исследовано действие элиситоров различной природы, таких как дрожжевой экстракт, маннан, {3-1,3-глюкан и пектин на стимуляцию продукции псевдогиперицина и гиперицина.

Впервые показано, что продуктивность клеточных культур по отношению к гиперицину можно стимулировать различными элиситорами, в особенности маннаном.

Впервые установлено, что исследованные нами элиситоры действуют на разные этапы вторичного метаболизма И. perforatum, чем и обусловлен разнонаправленный эффект их действия на синтез гиперицина и псевдогиперицина.

Практическая ценность. В настоящей работе нами было разработано получение побеговых культур И. perforatum, которые являются стабилными продуцентами гиперицинов. Разработана система получения суспензионных культур Н. perforatum в форме глобул, которые являются хорошими продуцентами гиперицинов.

Полученные результаты позволяют расширить наши знания относительно возможности стимулирования биосинтеза гиперицинов, а исследованные элиситоры могут быть использованы для получения гиперицинов в условиях in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту:

5. Как каллусные, так и суспензионные культуры способны синтезировать гиперицин только в сложных многокомпонентных клеточных системах.

6. Наиболее перспективной по суммарному содержанию гиперицина и псевдогиперицина является суспензионнная культура с преобладанием клеточных агрегатов и глобулярных структур.

7. В исследованных системах стабилизация биосинтеза гиперицина и его производных и индуцирование вторичного метаболизма происходит при переходе культуры клеток к стадии дифференциации и при полном морфогенезе.

8. Регуляция вторичного метаболизма посредством оптимизации условий культивирования, соответствующих потребностям клеток, может приводить к повышению выхода целевого продукта как минимум на уровень, характерный для интактных растений.

9. Продуктивность клеточных культур по отношению к гиперицину можно стимулировать элиситорами, в особенности маннаном.

10. При определенных условиях культивирования и соотношении инокулюм/среда, каллусные культуры показывают способность к образованию специфических глобулярных структур.

Апробация работы Основные результаты и положения работы были представлены и обсуждены на заседании ученого совета Института микробиологии НАН РА (Ереван 9 сентября, 1999). Материалы диссертации были

доложены на международных и республиканских конференциях: 4^th Dutch-German Workshop on Regulation of Secondary Metabolism, (Bad Herrenalb, Germany 27-29 September, 1998); Symposium zum Gedenken an die 100. Wieder-keher der Begrundung der Gewebenkultur durch Gottlieb Habeflandt, (Wien, 8-9 October, 1998); International Symposium on Plant Biotechnology, (Kyiv, 4-8 October 1998); International Botanical Congress, (St-Louis, USA, 1-9 August 1999); 18^th International Symposium Plant Essential Oils & Extracts (Digne, France 20-22 October, 1999), XIII International Congress, III World Congress in Traditional Medicine, (Lima, Cusco, Ayacucho, Peru, South America October 26-31, 1999); на 3-ей международной конференции "Современные проблемы беспочвенного культивирования растений" (21-23 сентября, 1999 Ереван); на научной конференции посвященной 80-летию ЕГУ (22-26 сентября, 1999 Ереван).

Публикации, По теме диссертации опубликовано 10 научные работы.

Место выполнения работы Кафедра биофизики, биологического факультета Ереванского Государственого Университета.

Cryjoyp^JLafibeMjiHctEpiaiuui. Диссертация состоит из введения, обзора -литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 154 источников. Работа изложена на 119 страницах компьютерного набора, содержит 6 таблиц и 26 рисунков. Обзор литературы обобщает современные представления о зверобое и его фармацевтическом значении, особенностях культивирования И. perforatum в условиях in vitro, метаболические пути циклизации поликетидов и стратегические подходы получения и увеличения выхода вторичных метаболитов в суспензионных и клеточных культурах.