Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Хитозан – уникальный полимер для биомедицины 9
1.2. Источники получения и основные физико-химические характеристики хитозана 10
1.2.1 Биодеградируемость 12
1.2.2.Биосовместимость 13
1.2.3 Токсичность 14
1.3. Влияние основных физико-химических характеристик хитозана (ММ, СД) на растворимость при рН 5.5-7.4. 16
1.3.1. Влияние СД на растворимость хитозана. 17
1.3.2 Влияние ММ хитозана на растворимость и способы её снижения
1.4 Водорастворимые производные хитозана, получение и применение в биомедицине 20
1.4.1.Карбоксиметилирование 21
1.4.2. Сукцинилирование 24
1.4.3. Сульфатирование 28
1.4.4. Гликозилирование 31
1.4.5. Тиолирование 33
1.4.6. Кватернизирование 35
ГЛАВА II. Экспериментальная часть 44
2.1 Реагенты и растворители 44
2.2 Лабораторное оборудование 45
2.3 Кислотный гидролиз хитозана 46
2.4 Синтез производных низкомолекулярного хитозана
2.4.1 Синтез ацилированных производных хитозана 46
2.4.2 Синтез алкилированных производных хитозана с различными степенями замещения 47 2.4.3 Синтез производных хитозана с двумя группами (алкилированные и
ацилированные) 47
2.5 Физико-химическая характеристика хитозана и его производных 48
2.5.1 Определение степени дезацетилирования и степени замещения НМХ и его производных методом протонного магнитного резонанса (1Н-ЯМР) 48
2.5.2 Определение молекулярной массы хитозана с помощью высокоэффективной гель-проникающей хроматографии 48
2.5.3 Определение степени замещения производных хитозана 49
2.5.4 ИК-спектроскопия 49
2.5.5 Определение растворимости хитозана и его алкилированных производных. 49
2.5.6 Установление зависимости растворимости производных хитозана от рН. 50
2.5.7 Измерение размера и -потенциала хитозана и его производных 50
2.5.8 Ферментативная деградация производного КвХ98 50
2.6 Формирование частиц и конъюгатов производных хитозана с пептидами
2.6.1Формирование частиц алкилированных производных 51
2.6.2 Формирование частиц N-сукцинил хитозана 51
2.6.2.1 Сорбция варнерина на частицы сукцинил хитозана 52
2.6.3 Синтез конъюгатов из алкилированных производных с варнерином и мелиттином 52
2.6.3.1 Очистка препарата трансглутаминазы 53
2.6.3.2 Определение структуры конъюгатов 53
2.6.3.3 Определение количества пептида в конъюгате. 53
2.6.4 Атомно-силовая микроскопия 53
2.7 Изучение биологических активностей хитозана, производных хитозана, коньюгатов 54
2.7.1 Изучение антибактериальной активности хитозана и его производных, конъюгатов и частиц производных хитозана 54
2.7.2 Изучение совместного действия алкилированных производных хитозана с лизостафином и варнерином на клетки стафилококков 2.7.3 Изучение антиоксидантной активности алкилированных производных 55
2.7.4 Изучение хелатирующей способности алкилированных производных 56
2.8 Изучение внутриклеточного транспорта алкилированных производных
2.8.1 Получение ФИТЦ-меченных производных хитозана 56
2.8.2 Цитотоксичность производных хитозана 56
2.8.3 Определение эффективности связывания и проникновения препаратов в клетку методом проточной цитометрии 57
2.8.4 Конфокальная микроскопия 58
2.9 Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации антикоагулянтной активности гепаринов в системах in vitro, in vivo 58
2.9.1 Подготовка крови и плазмы. 58
2.9.2 Гемолиз эритроцитов при действии алкилированных производных хитозана 59
2.9.3 Влияние алкилированных производных хитозана и СПТ на агрегацию тромбоцитов 59
2.9.4 Нейтрализация антитромбиновой активности НФГ алкилированными производными хитозана и СПТ 60
2.9.5 Нейтрализация активности НМГ клексана по отношению к фактору Ха алкилированными производными хитозана и СПТ 60
2.9.6 Влияние внутривенного введения производных хитозана на антикоагулянтную активность плазмы гепаринизированных морских свинок 61
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение 63
3.1 Получение низкомолекулярного хитозана 63
3.2 Синтез алкилированных и ацилированных производных НМХ 64
3.3 Физико-химическая характеристика хитозана и его производных 66
3.3.1.Спектральные характеристики хитозана и его производных 66
3.3.2 Растворимость и заряд алкилированных производных хитозана 67
3.3.3. Ферментативная деградация КвХ98 3.4 Формирование частиц и конъюгатов с производными хитозана 70
3.4.1 Получение частиц на основе алкилированных производных хитозана методом ионотропного гелеобразования 71
3.4.2 Получение частиц на основе сукцинил хитозана 73
3.4.3 Предварительная очистка варнерина и сорбция его на частицы сукцинил хитозана 74
3.4.4 Физико-химические характеристики загруженных частиц 75
3.4.5 Формирование конъюгатов алкилированных производных с варнерином и мелиттином 76
3.5 Исследование биологических свойств хитозана, производных хитозана и коньюгатов на их основе. 78
3.5.1 Антибактериальное действие хитозана и его производных 78
3.5.2 Антиоксидантная активность алкилированных производных 81
3.5.3 Хелатирующая способность алкилированных производных 82
3.5.4 Антибактериальное действие частиц и коньюгатов 84
3.5.4.1 Изучение антибактериального действия коньюгатов пептидов и кватернизированного производного хитозана с помощью атомно силовой микроскопии 84
3.5.5 Совместное действие алкилированных производных хитозана с лизостафином и варнерином на клетки стафилококков 89
3.6 Изучение взаимодействия алкилированных производных с клетками млекопитающих 92
3.6.1 Токсичность алкилированных производных 92
3.6.2 Исследование взаимодействия алкилированных производных с клеткой методом проточной цитометрии 94
3.6.3 Визуализация взаимодействия алкилированных производных с клеткой методом конфокальной микроскопии 96
3.7 Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации антикоагулянтной активности препаратов гепарина в системах in vitro, in vivo . 98
3.7.1 Гемолиз эритроцитов 98
3.7.2 Агрегация тромбоцитов 100
3.7.3 Оценка прокоагулянтного действия алкилированных производных и СПТ при нейтрализации активности НФГ и НМГ 101
3.7.4 Оценка нейтрализации алкилированными производными антикоагулянтной активности плазмы морских свинок в результате введения НФГ или НМГ 105
Выводы 110
Заключение 111
Список сокращений 112
Список работ, опубликованных по теме диссертации благодарности 117
Список литературы 118
- Биодеградируемость
- Синтез производных низкомолекулярного хитозана
- Нейтрализация антитромбиновой активности НФГ алкилированными производными хитозана и СПТ
- Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации антикоагулянтной активности препаратов гепарина в системах in vitro, in vivo
Введение к работе
Актуальность темы
Полимеры активно используются в области биотехнологии и медицины. Они находят свое применение в качестве инструментов для решения биомедицинских проблем, таких как системы доставки лекарств, конструирование биосенсоров, применение в тканевой инженерии, регенеративной медицине (Langer, Tirrell, 2004; Furth, Atala, Dyke Van, 2007; Priya James, John, Alex, 2014). Синтетические полимеры обладают тем преимуществом, что их состав и структуру легко контролировать, однако перспективными для использования в биомедицинской области являются природные полимеры, благодаря их биосовместимости и способности к биодеградации.
Важное место среди природных полимеров занимает хитозан, получаемый реакцией дезацетилирования хитина. Хитозан имеет большой потенциал за счет своих полиэлектролитных свойств, а также высокой адсорбционной способности, биодеградации, биосовместимости, низкой токсичности (Aranaz et al., 2009). Наличие гидроксильных и аминогрупп позволяет модифицировать молекулу хитозана путем введения различных функциональных заместителей, с получением отличающихся по свойствам производных, что значительно расширяет области применения данного биополимера, благодаря возможности направленного изменения его свойств. Производные хитозана, растворимые в воде при значениях рН близких к нейтральному, обращают на себя повышенное внимание ввиду возможности их применения в разных областях химии и биологии (Lim, Hudson, 2004; Mourya, Inamdar, Tiwari, 2010; Zhang et al., 2003). Универсальность и широкие возможности применения водорастворимых производных хитозана делают их интересными и актуальными объектами исследования.
Целью исследования является получение алкилированных и ацилированных производных низкомолекулярного хитозана, изучение их свойств и возможности применения синтезированных производных в биомедицинской области.
Задачи исследования:
1. Синтез алкилированных и ацилированных производных
низкомолекулярного хитозана, определение их физико-химических характеристик;
2. Формирование частиц и конъюгатов с пептидами на основе
синтезированных производных хитозана и их характеристика;
-
Изучение антибактериальных свойств производных, частиц и конъюгатов на их основе;
-
Изучение взаимодействия алкилированных производных хитозана с эукариотическими клетками in vitro;
-
Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации активности гепаринов в системах in vitro, in vivo.
Научная новизна и практическая значимость работы:
В результате выполнения работ был получен низкомолекулярный хитозан (НМХ), на его основе синтезированы ацилированные и алкилированные (КвХ) производные хитозана с различной степенью замещения (СЗ). Безусловным преимуществом производных является их растворимость при нейтральном значении рН, что расширяет возможность их применения в биомедицинской области. Впервые получены композиты на основе алкилированных производных КвХ с пептидами - варнерином (Вар) и мелиттином (Мел), оптимизированы условия их получения. Изучена антибактериальная активность производных хитозана, а также впервые показано синергетическое действие полученных композитов против модельных микроорганизмов. Изучена токсичность ряда КвХ, она имеет дозозависимый характер и существенно зависит от СЗ производного. Впервые исследовано взаимодействие КвХ с различной СЗ с эукариотическими клетками, выявлено, что такие производные лучше интернализуются клеткой по сравнению с НМХ. Эффективность проникновения существенно возрастает с ростом СЗ, она составляет 20% и 55%, для КвХ9 и КвХ98, соответственно. Внутривенное введение КвХ с максимальной СЗ, приводило к снижению антикоагулянтной активности плазмы морских свинок, на фоне введения нефракционированного гепарина (НФГ) или низкомолекулярного (НМГ), при этом, антикоагулянтный эффект КвХ сравним с эффектом сульфата протамина (СПТ), используемого в клинической практике. Результаты, полученные в рамках диссертационной работы, показывают перспективность использования КвХ для разработки систем доставки лекарств, а также нейтрализации активности гепарина.
Связь работы с научными программами: Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проекты №№ 14-04-00687_а, 15-34-50158 молнр, 15-29-05858 офим)
Апробация работы и публикации: Результаты были представлены автором в виде устных докладов на конференциях: Международная научная
конференция «ЭкоБиотех-2013» (Уфа, 2013), XII Международная конференция "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" РосХит 2014 (Пермь, 2014), XX Conference New Aspects on Chemistry and Application of Chitin and its Derivatives (Poland, Lodz, 2014), XIV Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2015), X Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2015), XIII Международная конференция "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" РосХит 2016 (Уфа, 2016). Материалы диссертации были представлены и обсуждены на конференциях: XXVIII зимней научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2016), III Конгрессе гематологов России (Москва, 2016), 3rd International Conference on Bio-based Polymers and Composites (Hungary, Szeged, 2016).
По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, среди них 7 статей в журналах рецензируемых ВАК РФ, 2 статьи опубликованы в зарубежном рецензируемом журнале, 9 тезисов.
Структура и объем работы: Диссертационная работа состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы» - 195 источников. Работа содержит 134 страницы машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и 10 таблицами.
Личный вклад автора заключается в анализе литературных данных, непосредственном участии в постановке задач исследования, проведении экспериментальных работ, а также обсуждении и теоретическом осмыслении полученных результатов. Основные результаты работы в планировании и проведении экспериментов получены автором лично или при его участии. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Биодеградируемость
Из вышеперечисленного сырья хитин можно получать несколькими способами: химическим, биотехнологическим, физико-химическим и др. Основным способом является химический, который заключается в проведении стадий депротеинирования, деминерализации и депигментации с помощью химических реагентов – кислот, щелочей, перекисей. Широко используются биотехнологические методы, предусматривающие использование различных ферментных препаратов. Разрабатываются новые физико-химические методы, например электрохимический, сущность которого заключается в проведении стадий депротеинирования, деминерализации и обесцвечивания панцирьсодержащего сырья в виде водно-солевой суспензии в электролизерах под действием электромагнитного поля [28].
Широко изучаемым производным хитина является хитозан, благодаря лучшей расвторимости и различным биологическим активностям. Хитозан получают из хитина при помощи реакции отщепления от N-ацетил-D-глюкозамина ацетильной группы. Чаще используется процесс химического дезацетилирования раствором NaOH в диапазоне концентраций (от 35 до 50 %), температур (от 20 до 140 С), и времени обработки (от 0,5 ч до 10 сут).
Основными характеристиками, влияющими на физико-химические свойства хитозана являются степень дезацетилирования (СД) и молекулярная масса (ММ). Степень дезацетилирования - параметр, определяющий отношение 2-амино-2-дезокси-D-глюкопиранозы к общему числу звеньев в полимерной цепи. СД имеет большое влияние на растворимость хитина и свойства его растворов. Хитозан - это дезацетилированный хитин, который растворим в разбавленных уксусной, муравьиной кислотах. В структуре хитина обычно преобладают ацетилированные звенья (СД обычно 0,10), у хитозана типичная СД более 0,65 [29]. Для определения СД используется множество подходов, которые включают аналитические методы: кондуктометрическое титрование, нингидриновая реакция, элементный анализ; спектральные методы: 1Н-ЯМР спектроскопия, ИК-спектроскопия, УФ-спектрофотометрия; деструктивные методы: гель-проникающая хроматография [30]. Молекулярная масса является основной характеристикой любого химического соединения, а в случае высокомолекулярных соединений играет особую роль, так как она также служит мерой длины полимерной цепи. ММ хитозана определяется при помощи таких методов как, высокоэффективная жидкостная хроматография, динамическое и статическое светорассеяние, вискозиметрия и пр. [31,32].
Важным аспектом использования хитозана в биомедицине является его способность к биодеструкции в организме. При биодеградации происходит расщепление полимерной цепи до олигосахаридов различной длины, которые могут быть впоследствии включены в гликозаминогликановый и гликопротеиновый метаболические пути. Хитозан расщепляется под действием специфических карбогидраз [33–35] и неспецифического действия протеиназ [36], которые гидролизуют глюкозамин–глюкозамин, глюкозамин– N-ацетил-глюкозамин и N-ацетил-глюкозамина–N-ацетил-глюкозамин связи. Считается, что хитозан и его производные деградируют в организме позвоночных преимущественно при действии лизоцима и бактериальных ферментов в толстой кишке [33]. Лизоцим - гидролаза, присутствующая во всех тканях млекопитающих, она играет важную роль в деградации хитина и хитозана. Кинетика деградации, по-видимому, обратно пропорциональна степени кристалличности, которая в основном контролируется степенью дезацетилирования. Кроме того, распределение ацетильных групп также влияет на способность к биоразложению, отсутствие ацетильных групп или их равномерное распределение (случайное, а не блочное) приводит к низким показателям ферментативной деградации [4]. Молекулярная масса хитозана также влияет на скорость деградации. Zhang H. и др в своей работе сохранили СД неизменной, в результате было показано, что хитозан с более высокой ММ деградировал медленнее, чем хитозан, с меньшей ММ [34].
Биоразложение хитозана было исследовано в экспериментах in vivo с помощью разных подходов. Так как хитозан широко используется в качестве пищевой добавки, была изучена его биодеструкция после перорального введения. Исследования показали, что хитозан с относительно низкой СД ( 50%) хорошо деградировал и легко выводился с мочой, таким образом, указывая на отсутствие накопления полимера в организме [37]. Биодеструкция хитозана при пероральном введении также зависит и от молекулярной массы, так при уменьшении ММ, всасывание хитозана в кишечнике возрастало [38].
В исследованиях Yang Y.M и др. [39] было показано, что хитозан в виде волокнистого каркаса с различной СД, был имплантирован между двумя нервными стволами седалищного нерва крысы. Авторы продемонстрировали, что хитозан с СД 92,3 % был устойчив к биодеградации, в то время как хитин и хитозан с более низкой СД легко разлагались. Структурные параметры хитозана, такие как ММ, СД и кристалличность могут быть использованы по отдельности или в комбинации для подбора скорости деструкции, требуемой для конкретных применений.
Синтез производных низкомолекулярного хитозана
КвХ находят широкие возможности для применения в биомедицине. Повышенный интерес на сегодняшний день вызывает молекулярная диагностика. Использование высокозамещенных КвХ с ММ 50, 100, 250 кДа как вектора для трансфекции было исследовано Faizuloev и др. Авторы обнаружили, что КвХ с ММ 250 кДа показывал высокий уровень трансфекции плазмидной ДНК и был в 5 и 80 раз более активен, чем КвХ с ММ 100 и 50 кДа (соответственно), а также в 4 раза эффективнее, чем полиэтиленимин (ПЭИ) (25 кДа), использующийся в качестве контроля. Цитотоксичность кватернизированных хитозанов, как правило, повышается с увеличением ММ, однако образцы с наибольшей ММ, оказались менее токсичными для линии клеток почки африканской зеленой мартышки COS-1, чем ПЭИ с ММ 25 кДа. Исследование влияния молекулярной массы КвХ на токсичность и эффективность трансфекции позволит конструировать векторы на основе полисахаридов, с учетом этих характеристик [23].
Высокий положительный заряд КвХ и их длительное удержание на слизистых могут быть использован для создания мукозальных лекарственных форм. Ученые в работе [153] рассматривали модель для изучения проникания потенциальных лекарств в легкие. Для этого они использовали полностью замещенный (100%) ТМХ и N-пропил-, N-бутил-, N-гексил-N,N-диметил хитозан, со степень кватернизации 85-91%. Клетки VA10 (бронхиальная эпителиальная линия) обрабатывали производными, в результате показано что, полностью замещенный ТМХ, в концентрации от 0,25 мг/мл, снижал трансэпителиальную электрическую резистентность (ТЭР) обратимым образом и усиливал проникновение макромолекул флуоресцеин изотиоцианат–декстрана (FD4) в 2-5 раз. На основе полученных данных выяснили, что более липофильные производные показывали лучшее проникание, раскрывали плотные межклеточные контакты, и уменьшали жизнеспособность клеток в следующем порядке N-гексил N-бутил N-пропил N-метил. Кроме того, показали, что эффект проникновения опосредуется не только постоянным положительным зарядом, но и степенью N-алкилирования. Эти результаты относятся к оценке влияния структурных факторов, способствующих повышению проникновения производных хитозана на возможность их потенциального использования для доставки лекарств в легкие.
В последнее время, большое внимание уделяется в фармацевтической сфере разработкам систем доставки лекарств, например через ротовую полость. Трансбуккальный прием препаратов (размещение лекарственного средства между верхней губой и десной или в полости рта до полного рассасывания) - достойная альтернатива с рядом преимуществ. Авторы в работе [154] оценивали влияние степени кватернизации на мукоадгезию и улучшение проникновения ТМХ через слизистую оболочку щеки. FD4 использовали в качестве модельной молекулы. ТМХ, полученные из хитозана разных ММ (1460 и 580 кДа), гидратировали в воде и в фосфатном буфере рН 6,4 (имитирующий буккальную жидкость). Затем измеряли мукоадгезию растворов ТМХ относительно дисперсии говяжьего подчелюстного муцина и слизистой оболочки свиных щек. ТМХ сохраняли и улучшали мукоадгезивные свойства исходных хитозанов в зависимости от степени кватернизации. В частности, мукоадгезивные свойства увеличивались при повышении степени кватернизации. Наиболее перспективные ТМХ, полученные из низкомолекулярного хитозана, с высокой степенью кватернизации. Эти образцы показывали лучшие мукоадгезивные свойства и способствовали проникновению. Возможность применения КвХ в стоматологии исследовали Ji Q. и др., они использовали КвХ со СЗ 74,5 %, полученный из хитозана с ММ 1080 кДа, СД 86%. Было выявлено, что образец обладал антибактериальной активностью против патогенов полости рта (МИК 0,25 – 2,5 мг/мл), однако он был крайне цитотоксичен для клеточной линии периодонтальной связки человека HPdLF [155].
Интересно и актуально направление про использование КвХ в качестве антидота для препаратов гепарина. Для этой цели группа польских ученых исследовали КвХ со СЗ 63,6 % и 90,5 %, полученный из низкомолекулярного хитозана [156]. Авторы показали, что КвХ эффективно связывался с гепаринами. Интересно, что при исследовании образуемых комплексов при помощи динамического светорассеяния, гепарин-протаминовые комплексы были крупнее и полидисперснее, чем комплексы гепарина с КвХ.
Однако основным свойством КвХ производных считается их высокая антибактериальная активность. Например, в эксперименте на E. coli и S. aureus авторы анализировали влияние степени N-замещения на антибактериальную активность N-[(2-гидрокси-3-триметиламмоний)пропил] хитозан хлорида. Результаты показали, что при СЗ более чем 20 %, значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) выше и она составляла от 8 до 64 мкг/мл для S. aureus и от 16 до 64 мкг/мл для E. coli [157]. Производные с различной СЗ четвертичными аммониевыми группами, проявляют различную антибактериальную активность. Производное N,N,N триметил-О-(2-гидрокси-3-триметиламмоний пропил) хитозан (TMГTMAПХ) с различной степенью О-замещения синтезированы путем взаимодействия N,N,N-триметил хитозана (ТМХ) с 3-хлоро-2-гидрокси пропил триметиламмоний хлоридом (ХГПTMAХ). TMГTMAПХ проявлял большую антимикробную активность по сравнению с ТМХ, его активность повышалась с увеличением степени замещения [158].
Нейтрализация антитромбиновой активности НФГ алкилированными производными хитозана и СПТ
Одним из требований, предъявляемых к полимерам, при использовании их в фармацевтической, медицинской, пищевой промышленности является биодеградируемость. Обычно хитозан применяется в виде растворов. Определяющим фактором их использования являются вязкостные характеристики. В рамках данного исследования методом вискозиметрии была проведена оценка деградации кватернизированного производного НМХ, который обладал лучшей растворимостью в физиологическом растворе. Анализ проводили под действием фермента лизоцима (КФ 3.2.1.17), входящего в состав различных жидкостей организма (крови, слюны и т.д.). Наибольшее изменение относительной вязкости наблюдалось в первые сутки, затем происходило постепенное уменьшение скорости деградации (Рисунок 11). Динамика снижения вязкости раствора указывала на возможность деградации КвХ98 в организме под действием лизоцима.
Получение частиц и конъюгатов хитозана с биологически активными соединениями, является важной задачей. Белки и пептиды широко используются как терапевтические агенты для лечения ряда заболеваний. Тем не менее, их использование in vivo может быть сопряжено с частичной или полной потерей биологической активности. Инкапсуляция или коньюгация таких соединений с биополимерными носителями может сохранить и пролонгировать биологическую активность, а также повысить эффективность их доставки in vivo [179]. В качестве активного компонента могут быть использованы биологически активные пептиды и терапевтические белки, которые демонстрируют положительные результаты в борьбе против целого ряда заболеваний. При использовании в качестве носителя хитозана, обладающего собственными биологическими активностями, можно достичь синергетического эффекта [180].
В данной части работы наночастицы на основе производных хитозана получали, преследуя несколько целей. Во-первых, для того чтобы оценить антибактериальное действие алкилированных производных в зависимости от физического состояния твёрдое/жидкое [160]. Во-вторых, для исследования влияния иммобилизации пептидов на наночастицах и их конъюгации с синтезированными производными хитозана, на сохранение их биологической активности. Для реализации этих целей были получены частицы на основе производных хитозана, на которые в дальнейшем путем сорбции за счёт электростатического взаимодействия иммобилизовали катионные пептиды. Второй подход заключался вполучении конъюгатов производных хитозана с пептидами с использованием трансглутаминазы в качестве сшивающего реагента. В качестве модельных пептидов были выбраны: варнерин и мелиттин. Варнерин является уникальным низкомолекулярным катионным пептидом, впервые выделенным из среды культивирования Staphylococcus warneri IEGM KL-1. Пептид имеет в своем составе тиоэфирные связи, которые придают молекулам повышенную устойчивость к действию различных ферментов, а также к физико-химическим факторам среды. Бактерицидное действие пептида на клетки S. epidermidis проявляется в широком диапазоне рН [169]. Данный пептид был любезно предоставлен сотрудником лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН В.П. Коробовым. Мелиттин – пептид пчелиного яда, который обладает антибактериальными, противовоспалительными свойствами [181–183]. Он проявляет сильную литическую активность в отношении бактериальных клеток, а также эритроцитов человека. Эта функция ограничивает использование мелиттина для прямого терапевтического использования, он является отличной моделью низкомолекулярного катионного пептида для исследований.
Наночастицы алкилированных производных формировали методом ионотропного гелеобразования с использованием TПФ. Преимуществом данного метода является то, что получение частиц протекает в одну стадию в результате взаимодействия положительно заряженных четвертичных аммониевых групп с отрицательно заряженными фосфатными группами ТПФ. При конструировании наночастиц использовали ПЭГ, с целью поддержания гидрофобно-гидрофильного баланса среды, стабилизации суспензии получаемых частиц и предотвращения их агрегации. Процесс формирования частиц контролировали спектрофотометрически путем фиксации оптической плотности суспензии частиц при длине волны 600 нм. Варьируя концентрации КвХ98 и ТПФ определили оптимум, приводящий к образованию устойчивой суспензии частиц, концентрация раствора КвХ98 составляла 1,41 мг/мл, а весовое соотношение КвХ98 : ТПФ было равным 4,8 : 1,0 (Рисунок 12), при этом выход частиц составлял около 20 %
Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации антикоагулянтной активности препаратов гепарина в системах in vitro, in vivo
Для более полного описания структурных особенностей поверхности клеток, обработанных Вар, и неповрежденных клеток E. coli использовали такие показатели, как величина силы адгезии, среднеквадратичная шероховатость, а также жесткость (модуль Юнга). Они могут служить показателями влияния антимикробного агента на изменение клеточных мембран и позволяют количественно сравнить механические характеристики неразрушенных клеток. Однако, они неприменимы для изучения полностью разрушенных клеток. Полученные данные представлены в Таблице 9. Шероховатость необработанных и обработанных клеток практически не менялась, модуль Юнга незначительно уменьшался, а величина силы адгезии различалась в 2,3 раза. Таким образом, несмотря на то, что данное количество Вар ( 1000 мкг/мл) не вызывало видимых разрушений клеточных мембран, оно все же оказывало влияние на структуру клеточной стенки, которая становилась менее жесткой. Обработанные клетки лучше адгезировали на поверхности подложки.
Физические характеристики обработанных и не обработанных Вар клеток E. coli Вариант Среднеквадратичная шероховатось, нм Сила адгезии, нН Модуль Юнга, МПа E. сoli (контроль) 12,88±3,02 3,28±1,36 0,89±0,09 E. сoli + Вар 13,14±0,96 7,60±1,98 0,74±0,05 Кроме того, было изучено суммарное влияние на клетки E. coli Вар и КвХ40 (Рисунок 19 е). Видно, что КвХ40 усиливал антимикробное действие Вар и эффективно разрушал клеточную стенку бактерий. Разрушенные клетки сферической формы с вогнутой серединой, имели высоту менее 400 нм, диаметр 0,5-3 мкм. На поверхности подложки также присутствовали частицы пептида и внутриклеточного содержимого размером 40-50 нм, и полимерная пленка.
Было определено влияние физического состояния КвХ98 обладающего наименьшим значением МИК на антибактериальную активность. Для этого изучали активность суспензии наночастиц КвХ98 и раствора КвХ98 (Таблица 10). Наши исследования, показали что, наночастицы КвХ98 на порядок уступали в антибактериальной активности раствору КвХ98. Однако в литературе имееются сведения об увеличении активности хитозана в твердой форме [190]. Возможно полученный нами результат, связан с механизмом действия производных хитозана, которые в виде раствора покрывают клетки плотным полимерным слоем, затрудняя обмен веществ, благодаря чему клетка погибает.
Также была изучена антибактериальная активность СХ частиц загруженных Вар, получение которых описано в п 2.6.2. Полученные результаты подтвердили целесообразность сорбции Вар для сохранения пептидом активности, однако усиления их действия, не было обнаружено.
В литературе имеются сведения, что при совместном использовании различных антимикробных препаратов с антибиотиками, обнаруживается синергетический эффект [191]. В данной работе в качестве антимикробных препаратов для двух видов бактерий были выбраны лизостафин и варнерин. Лизостафин (КФ 3.4.24.75) - внеклеточная цинк-содержащая глицил-глициновая эндопептидаза, выделяемая из Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. Исследование синергетического эффекта проводили по уровню антибактериальной активности лизостафина и варнерина в присутствии модифицированных четвертичными аммониевыми группами образцов хитозана.
Механизм антибактериального действия используемого фермента лизостафина, заключается в расщеплении пептидных связей глицил-глицин в клеточной стенке микроорганизмов рода Staphylococcus. Полученные нами данные по антибактериальной активности подтверждают, что в присутствии кватернизированных производных хитозана лизостафин демонстрирует синергетический эффект на клетки золотистого стафилококка. Была определена концентрационная зависимость вносимых в лунку производных хитозана на снижение оптической плотности бактериальной суспензии при постоянной концентрации лизостафина. В присутствии 25 мкг/мл производных хитозана КвХ9, КвХ40, КвХ58 лизис клеток усиливался, достигая максимума при их концентрации 3 мкг/мл (Рисунок 20). Выявлено, что СЗ четвертичными аммониевыми группами в молекуле хитозана со СЗ 9, 40, 58 % влияет на их совместное действие с лизостафином. Для производного со СЗ 98 %, аналогичного эффекта не наблюдали. Предположительно из-за большой плотности положительного заряда, которая препятствует работе фермента, ввиду электростатического отталкивания, либо стерических затруднений.
Влияние кватернизированных производных хитозана на лизис клеток S. aureus в присутствии лизостафина. Верхняя пунктирная линия – ОП бактериальной суспензии до добавления лизостафина, нижняя линия после инкубации с лизостафином. Время инкубации 15 мин.
Оценку антибактериальной активности варнерина и влияние на этот процесс КвХ98 проводили аналогичным методом, используя суспензию клеток S. epidermidis. Существенная роль в механизме действия варнерина принадлежит мембранному потенциалу, который способствует быстрому перемещению молекул пептида к цитоплазматической мембране и изменению ее физико-химических характеристик, что приводит к нарушениям ее структурной целостности[169]. В отличие от лизостафина, варнерин действует медленнее. При концентрации Вар 6,25 мкг/мл значение оптической плотности суспензии стафилококков составляло 0,2 о.е. (время инкубации 210 мин) (Рисунок 21). Синергетический эффект относительно эпидермального стафилококка для производного КвХ98 и варнерина наблюдался при 60 мин инкубирования, в диапазоне концентраций от 6 до 1,56 мкг/мл.