Введение к работе
Актуальность проблемы. Описторхоз - широко распространенное природно-очаговое заболевание. На территории России из печеночных паразитических трематод наибольшее распространение имеет Opistorchis felineus. Этим паразитом в Европейской части России инфицировано приблизительно 0,02-0,1% всего населения. Данные эпидемиологических исследований показывают, что на территории высокоэндемичных районов Сибири поражено до 85-90% всего взрослого населения. Количество страдающих от этой инвазии людей только в этих районах может быть оценено в пределах 2-Ю миллионов человек.
Описторхоз - тяжелое паразитарное заболевание человека и животных. Основными патогенетическими механизмами являются токсическо-аллергическое воздействие гельминтов и их яиц на организм человека, а также механическое повреждение тканей печени с последующим развитием симптомокомплекса, связанного с поражением печени, желчевыводящих протоков, желчного пузыря и поджелудочной железы. Инвазия способствует проникновению вирусных и бактериальных инфекций в биллиарную систему, возникновению хронического восходящего гепатита, камней в желчевыводящих протоках и протоках поджелудочной железы. Прогноз развития заболевания усугубляется возможным развитием холаягиокарцином и изменением нейроэндокринной регуляции. Поэтому своевременная диагностика и лечение описторхоза, а также надежный эпидемиологический контроль над возбудителем этого заболевания, несомненно, являются актуальной проблемой, в том числе и в неэндемичных районах, поскольку описторхоз является типичной вновь возникающей инвазией во многих странах мира.
В настоящее время иммунодиагностика описторхоза, вызываемого Opistkorchis felineus, страдает низкой чувствительностью и специфичностью из-за недостаточной изученности свойств этого паразита. Диагностические наборы для выявления специфических при описторхозе антител содержат в качестве антигена соматические фракции гельминта, имеющие невысокую удельную концентрацию специфических антигенов паразита, вследствие чего обладают низкой диагностической ценностью. Поэтому главной задачей разработчиков иммунодиагностикумов является отладка принципиального звена системы - этапа связывания антиген-антитело. Кроме того, несомненно, перспективным направлением в совершенствовании диагностики
описторхоза является выявление маркерных антигенов паразита в физиологических жидкостях и выделениях.
Цель работы и задачи исследования. Основной целью исследования явились поиск и изучение иммунологических маркеров половозрелой трематоды O.felineus, а также создание иммунодиагностических систем для определения специфических антигенов и антител в клиническом материале.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
изучение специфических свойств половозрелой печеночной трематоды O.felineus и ее основных антигенных фракций;
определение иммунологических маркеров половозрелого паразита O.felineus и изучение их свойств;
получение моноклональных антител к маркерным антигенам O.felineus и изучение их свойств;
исследование перекрестной активности антигенов O.felineus и ряда гельминтов -паразитов человека с использованием гомологичных и гетерологичных поликлональных антисывороток и моноклональных антител;
оптимизирование стандартной системы непрямого-ИФА для выявления специфических антител при описторхозе, вызываемом O.felineus, с использованием МКА;
разработка альтернативной системы для диагностирования маркерных антигенов O.felineus в физиологических жидкостях и выделениях.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной научной работы:
получены и охарактеризованы антигены половозрелой печеночной трематоды O.felineus;
впервые определены для человека белки-маркеры при описторхозе, вызываемом O.felineus: р105 и р74, р70, рбб;
впервые создана и охарактеризована панель мышиных гибридом-продуцентов МКА к основным антигенам O.felineus, среди которых основную долю составляют МКА к основному иммуногену р105 кДа экскреторно-секреторного антигена печеночной трематоды O.felineus;
с использованием МКА и иммунных человеческих сывороток на ультраструктурном уровне изучены гистоиммунохимические свойства
половозрелых марит O.felineus, в результате чего определены места локализации основных иммуногенов паразита;
исследованы перекрестные реакции антигенов O.felineus с другими гельминтами-паразитами человека, показана выраженная перекрестная активность антигенов O.felineus с антигенами O.viverrini, C.sinensis и умеренная с N.salmincolica. Выявлены белки, ответственные за перекрестную активность;
на основе МКА к белку 105 кДа экскреторно-секреторного антигена O.felineus модифицирована стандартная система непрямого-ИФА для выявления специфических антител, что привело к увеличению чувствительности, специфичности, а также повысило достоверность иммунологического анализа;
на основе модифицированной МКА системы ИФА впервые разработан иммунодиагностический метод для выявления растворимого антигена печеночной трематоды O.felineus в желчи и кале. Метод позволяет проводить исследование по одному или нескольким доступным физиологическим образцам: желчь, кал, и требует минимальных объемов исследуемых материалов, отбор которых безболезнен и потенциально не опасен. Анализ с использованием МКА-ИФА позволяет обнаруживать незначительные количества маркеров паразитов в физиологических жидкостях и выделениях.
В результате проделанной работы получены весьма обнадеживающие результаты, показывающие перспективность разработанных иммунодиагностических методов для использования в клинических и эпидемиологических исследованиях людей с целью ранней диагностики острого и хронического описторхоза, а также для оценки эффективности лечебно-профилактических мероприятий. Дальнейшее расширение арсенала иммунодиагностических тестов на описторхоз является не только важным диагностическим направлением работы, но и одним из звеньев расширения эпидемиологического надзора, позволяющего контролировать ситуацию по паразитозам на качественно новом уровне.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлены на международном симпозиуме 'Тяжелые инфекционные заболевания: эпидемиология, экспресс-диагностика и предупреждение" (Киров, 1997), научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 1998) и семинаре перспективных исследований "Оценка спонсируемых биологических исследований в России для нового тысячелетия"
(Новосибирск, 1999). По материалам диссертации опубликовано 5 работ в отечественной печати и тезисы 3 докладов. Получено авторское свидетельство на МКА к р105 экскреторно-секреторному антигену Opistorchis felineus.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков и 22 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (89 наименований).
Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом, под руководством и в соавторстве с Локтевым В. Б.