Особенности метаболизма стероидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной как основа биотехнологии получения фуростаноловых гликозидов Носов, Александр Михайлович

Введение к работе

.. Актуальность работы.'- Культура клеток высших растений приобретает все большее значение как для фундаментальных исследований, так и для практического применения в биотехнологии. Особый интерес культивируемые клетки представляют как источник абсолютно экологически чистых продуктов вторичного метаболизма растений, широко применяемых в медицине, парфюмерии, пищевой промышленности. В качестве примера можно привести производство биомассы женьшеня в СНГ, используемой как адаптогенное и стимулирующее средство; производство нафтахинона шиконина в Японии (фирма Toshiba) - красящего соединения, обладающего асептическими свойствами.

Однако список культур, выращивание которых имеет коммерческий успех, невелик. К 1992 году это уже упоминавшиеся Ралах ginseng С.А.Меу и Lithospermum erythrorhizon Seib et Zucc; Rauwolfia serpentina Benth. - продуцент антиаритмического алкалоида аймалина (СНГ); Coptis japonica - продуцент алкалоида берберина (Япония) CKreis et al. 1989] и, возможно, Echinacea purpurea - источник им-муномодулирующих полисахаридов (Германия) [Rittershaus et al. 19901. Это обусловлено рядом причин: отсутствием теоретических знаний о закономерностях вторичного метаболизма в клетках in vitro; сложностью технологического оформления крупномасштабного выращивания культуры клеток растений; высокой себестоимостью этого процесса. Лишь комплексное исследование, включающее в себя многие аспекты - от выбора и характеристики штамма-продуцента до получения целевого продукта - может стать основой современной биотехнологии. К настоящему времени такого многопланового исследования практически ни для одной из культур клеток растений не проведено.

Объектом нашего исследования явилась культура клеток тропической лианы диоскореи дельтовидной Dioscorea deltoidea Wall. Эта культура привлекает внимание исследователей уже более тридцати лет как потенциальный источник диосгенина - лучшего сырья для получения стероидных гормональных препаратов. Однако, не меньший интерес культура клеток диоскореи дельтовидной представляет как источник стероидных гликозидов с агликоном диосгенином. Эти соединения являются действующим началом в препаратах диоспонин и полиспонин, выпускаемых в России для лечения атеросклероза. В Болгарии на основе стероидных гликозидов из Tribulus terrestris вырабатываются используемые в ветеринарии препараты витатон и трибестан. Однако, производство указанных препаратов к настоящему времени практически

I

прекращено из-за отсутствия сырья. Таким образом, поиск альтернативного надежного источника стероидных гликозидов, которым может стать культура растительных клеток, весьма актуален.

Цель работы. Изучение закономерностей метаболизма стероидов в исходном и мутантных штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной и разработка научных основ биотехнологии получения препарата фуростаноловых гликозидов из штамма-сверхпродуцента. Разработка концепции о закономерностях синтеза вторичных соединений в клетках in vitro на примере культуры клеток диоскореи дельтовидной.

Задачи исследования.

1. Изучение физиологических характеристик исходного и трех мутантных штаммов культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall.

Z. Изучение закономерностей синтеза стероидных соединений в этих штаммах.

1. Получение препарата стероидных гликозидов (сапонинов) из продуктивного штамма.

2. Изучение биологической активности препарата стероидных сапонинов из клеток продуктивного штамма.

3. Разработка научных основ биотехнологии получения препарата стероидных гликозидов из культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall.

4. Анализ закономерностей синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток Dioscorea deltoidea и разработка ряда теоретических положений о синтезе вторичных соединений в культуре клеток высших растений.

Научная новизна работы. Впервые проведено сопоставление характеристик роста и синтеза вторичных метаболитов в исходном и мутантных штаммах культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall. Показаны различия в синтезе этих соединений и эффективность использования индуцированного мутагенеза для получения штаммов-сверхпродуцентов культивируемых клеток высших растений. Впервые показано, что во всех штаммах культуры клеток диоскореи дельтовидной синтезируются в основном фуростаноловые сапонины. Определен качественный и количественный состав стероидных сапонинов во всех штаммах. При этом синтез гликозидов в фуростаноловой форме происходит независимо от активности эндогенной олигофуростанозид-специфичной в-глюкозидазы. Показано, что состав стероидных гликозидов в клетках in vitro уникален и отличен от состава сапонинов интактного растения. Впервые в культуре клеток диоскореи дельтовидной найдены сапонины с 25S-конфигурацией агликона (ямогенин), не характерные для интакт-

ного растения. Охарактеризован мутантный штамм ИФР-ДМ-0,5 превосходящий по продуктивности исходный штамм в 5 * 6 раз и по содержанию стероидных гликозидов интактное растение в 1,5 * 2 раза.

Совместно с Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН впервые из штамма ДМ-0,5 получен и охарактеризован препарат фуростаноловых сапонинов. Совместно с медицинскими учреждениями проведено изучение биологической активности препарата и показаны его уникальные свойства. Он может быть использован как иммуномодулятор, а также как стимулятор овуляции и сперматогенеза у животных.

Выдвинута гипотеза об общих закономерностях синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток высших растений.

Практическое значение работы. Охарактеризован штамм-сверхпродуцент фуростаноловых гликозидов ИФР-ДМ-0,5, превосходящий по содержанию этих соединений интактное растение в2Ч раза. Изучены различные варианты выращивания этого штамма в периодическом и проточном режимах в биореакторах разного объема и конструкции. Определены физиологические условия культивирования штамма, позволяющие получить высокую продуктивность клеток по фуростаноловым гликози-дам - более 0.1 г. с литра среды за сутки. Разработан способ получения препарата фуростаноловых гликозидов из клеточной биомассы. Препарат получен в достаточном количестве для проведения испытаний его биологической активности и доклинических токсикологических исследований. Таким образом, созданы научные основы биотехнологии получения препарата фуростаноловых гликозидов из культуры клеток диоскореи дельтовидной.

Штамм передан для внедрения на Покровский завод биопрепаратов. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на IY Всесоюзной конференции по культуре клеток и биотехнологии (Кишинев, 1983), на Первой республиканской конференции по медицинской ботанике (Киев, 1984), на Всесоюзной конф."Новые направления биотехнологии" (Пущине, 1984), на Международном симпозиуме по исследованию лекарственных препаратов (Берлин, 198R), на 6 Международном конгрессе по культуре клеток и тканей (Монтана, 1986); на V Всесоюзной (I Международн.) конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология", (Новосибирск, 1988), на Втором съезде Всесо-юзн. общества физиологов растений (Минск, 1990), на 1 Всесоюзн. конф. "Генная и клеточная инженерия" (Пущино 1990).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы -опубликованы в 30 печатных работах, в том числе получено три авторских

свидетельства и положительное решение по заявке на авторское свидетельство.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семи глав, выводов и списка используемой литературы.