Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 13
1.1. Краткая характеристика Staphylococcus aureus 13
1.2. Виды и формы специфического иммунитета 19
1.3. Типы и свойства антигенов и антител 21
1.4. Антигены стафилококков 25
1.5. Типы вакцин 28
1.6. Основные принципы конструирования липосом 30
1.7. Клиникодиагностическое значение ферментемий
1.7.1. Ферменты и биоэнергетика 33
1.7.2. Ферменты микроорганизмов 34
1.7.3. Адаптивная ферментемия 36
1.7.4. Ферментемия при инфекционном процессе
Собственные исследования и их обсуждение 45
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Объекты исследования 45
2.2. Методы исследования 45
2.2.1 Микробиологические методы исследования
2.2.2. Иммунологические методы исследования 47
2.2.3. Биохимические методы исследования 48
2.2.4. Биотехнологические методы 51
2.2.5. Методы работы с животными 51
2.2.6. Методы статистической обработки материала 52
Глава 3. Сравнительный анализ биологических свойств различных изолятов Staphylococcus aureus 53
3.1. Изучение тинкториальных, культуральных и биохимических свойств изолятов Staphylococcus aureus 1-20 53
3.2. Изучение вирулентности исследуемых изолятов стафилококка 56
3.3. Факторы инвазии и альтерации 56
Глава 4. Формирование иммунного ответа при иммунизации клетками сафилококков 59
4.1 Иммунизация различными изолятами Staphylococcus aureus 59
4.1.1. Способность изолятов стафилококка вызывать антителообразование 59
4.1.2. Бактериостатическая активность плазмы крови при иммунизации стафилококками 62
4.1.3. Изменение ферментативной активностью плазмы крови морских свинок при иммунизации клетками стафилококков 65
4.1.4. Связь иммуногенности стафилококков с их фагоцитируемостью 68
4.2. Влияние антибиотиков на постинфекционную
иммунизацию при стафилококковой инфекции животных 73
4.2.1. Влияние антибиотикотерапии на бактериостатические и ферментативные свойства плазмы крови при лечении стафилококковой инфекции 76
4.2.2. Влияние антибиотикотерапии на опсонизирующие свойства плазмы крови 81
4.2.3. Влияние антибиотикотерапии на метаболическую активность лейкоцитов 82
Глава 5. Иммунизация антигенами стафилококков 86
5.1. Иммунизация карбодиимидными коньюгатами 88
5.2. Иммунизация липосомами 96
5.2.1. Изменение ферментативной активности энзимов плазмы крови и метаболической активности лейкоцитов кроликов под влиянием липосом in vivo 98
5.2.2. Некоторые аспекты формирования гуморального и клеточного иммунитета при иммунизации липосомами 103
5.2.3. Иммунизация цыплят - бройлеров кросса «ROSS-308» 112
Глава 6. Влияние активности ключевых ферментов плазмы крови и низкомолекулярных метаболитов катализируемых ими реакций на рост Staphylococcus aureus и защитные механизмы макроорганизма 120
6.1. Влияние активности фементов плазмы крови на рост S. aureus 120
6.2. Влияние низкомолекулярных метаболитов на рост S. aureus in vitro 122
6.3. Влияние аланина и аспартата на защитные механизмы макроорганизма при стафилококковой инфекции 128
6.3.1. Влияние плазмы крови кроликов, получавших инъекции аланина и аспартата, на дыхательную активность макрофагов 128
6.3.2. Влияние L-аланина и L-аспартата на биохимические параметры плазмы крови белых мышей in vivo 131
6.3.3. Влияние аминокислот L-аланина и L-аспартата на фагоцитоз стафилококка 132
6.3.4. Влияние аланина и аспартата на повышение сопротивляемости макроорганизма стафилококковой инфекции в модели внутрибрюшинного заражении 133
Заключение 135
Практические предложения 140
Перспективы дальнейшей разработки темы 141
Выводы 141
Перечень сокращений 143
Список литературы
- Клиникодиагностическое значение ферментемий
- Биохимические методы исследования
- Изучение вирулентности исследуемых изолятов стафилококка
- Изменение ферментативной активности энзимов плазмы крови и метаболической активности лейкоцитов кроликов под влиянием липосом in vivo
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время разрабатывается и производится множество различных древесных композиционных материалов, обладающих хорошими эксплуатационными и потребительскими свойствами (Thoemen et al., 2010; Burton et al., 2011). Наиболее широкое применение в строительстве и мебельной промышленности нашли ДСП. Несмотря на высокие технические показатели и отсутствие необходимости в использовании высококачественной древесины, данные материалы имеют серьезные недостатки. Получение на основе фенолформальдегидных смол обуславливает выделение ими в процессе эксплуатации в воздушную среду фенола, формальдегида и ряда других токсичных веществ. Поэтому проблема снижения токсичности древесных плит весьма актуальна (Carll et al., 1986; Li et al., 2005; Carlborn et al., 2006). Для ее решения используют различные способы (Haag et al., 2004, Pan et al., 2006, Kadimaliev et al., 2012), но, к сожалению, существуют определенные проблемы. Поэтому ведется интенсивный поиск новых природных соединений, способных заменить смолы биологическим связующим.
Перспективными являются связующие, в состав которых входят полисахариды микробного происхождения (Smith and Callow, 2006; Ревин и Ведяшкина, 2009; Шутова и др., 2010; Ревин и др., 2010), к их числу относится экзополисахарид леван. Он обладает высокими адгезивными свойствами и уже был предложен для получения экологически чистого клея (Combie et al., 2004; Kang, 2009). По силе растяжения при склеивании алюминия и отличной прочности на сдвиг при связывании некоторых пластмасс леваны могут конкурировать со многими синтетическими клеями (Combie and Yavorsky, 2005).
Микроорганизм Azotobacter vinelandii Д-08 – это аэробный
грамотрицательный штамм бактерии, способный к азотфиксации. Он получен с
помощью мутагенеза при воздействии нингидрина и используется в
промышленных целях для продукции полисахарида левана. Данный
микроорганизм способен к росту на углеродсодержащих средах, в особенности
на сахарозе или мелассе (Лияськина и др., 2010; Петенко и др., 2011). Было
показано, что наилучшим источником углерода для производства
экзополисахаридов является сахароза и глюкоза (Четвериков и др., 2006).
Среди биоорганических отходов особый интерес представляют лигносульфонаты (ЛГС) – многотоннажные отходы целлюлозно-бумажной промышленности (Tretyakov et al., 2012). Молекулярная структура ЛГС представляет собой ароматические ядра, соединенные пропановыми остатками в длинные неполярные цепочки с включенными в них полимерными сульфогруппами, карбонильными, карбоксильными и гидроксильными группами (Семочкин и Пашков, 2002). Такое строение обусловливает проявление поверхностно-активных и адгезивных свойств. При высоких температурах ЛГС способны участвовать в реакциях поликонденсации (Brovko
et al., 2009; Dumitrescu et al. 2013; Акчурина, 2014) Эти свойства позволяют использовать их в качестве связующего при производстве различных материалов из растительных отходов (Laemsak et al., 2000; Privas and Navard, 2013; Yuan et al., 2014). Однако до сих пор не отработаны технологии получения ДСП с ЛГС, обладающих высокой прочностью и влагостойкостью. Для этого необходимо подобрать условия подготовки и обработки исходного сырья (древесных стружек) ЛГС, изготовления пресс-массы, режимы прессования – температуру, давление, длительность (Lambuth et al., 2003; Zhang et al., 2011).
На сегодняшний день сдерживающим фактором внедрения новых классов
соединений биологического происхождения в производство древесных
композиционных материалов является их себестоимость и несоответствие
полученных материалов по физико-механическим характеристикам
имеющимся стандартам.
Целью работы был поиск оптимальных условий культивирования Azotobacter vinelandii Д-08 на различных средах для увеличения синтеза левана и исследование возможности использования культуральной жидкости, содержащей леван, и лигносульфоната в качестве биосвязующего при изготовлении прессованных биокомпозиционных материалов из отходов древесины.
Исходя из поставленной цели, решали следующие задачи:
-
Оптимизировать условия синтеза полисахарида левана в средах с отходами перерабатывающей промышленности, таких как меласса, барда и молочная сыворотка.
-
Исследовать условия получения биокомпозиционных материалов с использованием в качестве связующего культуральной жидкости (КЖ), содержащей леван.
-
Исследовать условия получения биокомпозиционных материалов с использованием в качестве связующего лигносульфоната (ЛГС) и культуральной жидкости (КЖ), содержащей леван.
-
Изучить физико-механические свойства полученных материалов и провести анализ их структуры.
Научная новизна работы. Впервые проведено культивирование Azotobacter vinelandii Д-08 на средах, содержащих органические отходы, в значительной мере способствующие образованию полисахарида левана. Показано, что максимальное содержание левана получается при использовании мелассы, барды и молочной сыворотки в соотношении 5:2:3. С помощью прессования получен биокомпозиционный материал на основе лигноцеллюлозного сырья и культуральной жидкости, содержащей полисахарид леван. Показано, что по своим физико-механическим свойствам и структуре материал соответствует выпускаемым промышленностью. Совместное использование лигносульфоната и культуральной жидкости, содержащей леван, повышает влагостойкость биокомпозиционных материалов с сохранением их прочности.
Практическая значимость работы. Полученные результаты открывают новые направления утилизации промышленных отходов. Это связано с решением двух крупных проблем. Во-первых, это снижение токсичных свойств ДСП, производимых по традиционной технологии. Во-вторых – это утилизация лигноцеллюлозных отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности, а также пищевой и спиртовой промышленности (послеспиртовой барды, мелассы, молочной сыворотки), которые применяются для культивирования штамма бактерий. Полученные результаты могут использоваться в качестве основы для создания технологий получения биокомпозитов из вышеуказанных отходов на фоне снижения себестоимости готового продукта. На предлагаемую разработку получен патент на изобретение РФ «Способ получения экзополисахарида левана» (ФИПС № 2574211, заявка № 2014147768/10, приоритет изобретения от 26 ноября 2014г., авторы Ревин В.В., Новокупцев Н.В.) и подана заявка на патент РФ «Способ получения биокомпозиционного материала» (ФИПС № 2015122863, авторы Ревин В.В., Новокупцев Н.В.)
Связь работы с научными программами. Представленные результаты
были получены в ходе исследований, проведенных в рамках государственного
контракта от 15 декабря 2013 г. №14-ГК/2013 (открытый конкурс №48-13/НИР,
протокол №2 от 25 ноября 2013 г.). НИР «Получение экологически безопасного
биологического связующего, используемого для изготовления
биокомпозиционных материалов», поддержана проектом частью
государственного задания [15.684.2014К] от 17.07.2014.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы
были представлены для обсуждения на Огаревских чтениях в Мордовском
государственном университете им. Н.П. Огарева (Саранск, 2011-2014); на
научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского
государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2011-2015);
Международной научно-технической конференции «Новейшие достижения в
области импортозамещения в химической промышленности и производстве
строительных материалов» (Минск, Республика Беларусь, 2012);
Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития
биотехнологии» (Саранск, 2012); Международном конгрессе «Биотехнология:
состояние и перспективы развития» (Москва, 2013); Всероссийской научной
конференции «Химия и технология растительных веществ» (Калининград,
2013); Международной научной интеренет-конференции «Актуальные
проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2013); Научно-
практической конференции «Биотехнология: наука и практика» (Воронеж,
2014); Международной научно-практической конференции «Информационные
технологии естественных и математических наук» (Ростов-на-Дону, 2014);
Всероссийской научной конференции с международным участием
«Перспективы развития химических и биологических технологий в XXI веке» (Саранск, 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в числе которых 1 статья в российском научном журнале, рекомендованном ВАК, 1 статья в научном журнале, который входит в реферативные базы данных и системы цитирования Web of Science, Scopus.
Положения, выносимые на защиту.
1. При культивировании Azotobacter vinelandii Д-08 в средах с мелассой,
бардой и молочной сывороткой образуется полисахарид леван, обладающий
связующими свойствами.
2. Получен новый перспективный экологически безопасный
композиционный материал, где в качестве связующего используется
культуральная жидкость, содержащая микробный полисахарид леван.
3. Прессованные биокомпозиционные материалы из древесных опилок с
основным связующими в виде культуральной жидкости, содержащей леван, и
техническим лигносульфонатом по параметрам прочности и влагостойкости не
уступают материалам на основе фенолформальдегидных смол.
4. При горячем прессовании происходит образование связей между
компонентами культуральной жидкости, лигносульфонатом и древесными
опилками, которые будут способствовать формированию структуры, физико-
механические параметры которой соответствуют требованиям, предъявляемым
к древесно-стружечным материалам.
Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 141 странице текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 18 рисунков и 19 таблиц. Список цитируемой литературы включает 206 источников, в том числе 109 на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и практическая ценность полученных результатов.
Благодарность. Выражаю особую благодарность и признательность
научному руководителю доктору биологических наук Ревину Виктору
Васильевичу за внимание и помощь в подготовке диссертации и всему
коллективу кафедры биотехнологии, биоинженерии и биохимии
Национального исследовательского Мордовского государственного
университета имени Н.П. Огарёва за поддержку при выполнении диссертационного исследования.
Клиникодиагностическое значение ферментемий
Стафилококки – грамположительные клетки диаметром 0,5 – 1,5 мкм, имеющие шаровидную форму, не имеющие жгутиков и не образующие спор. Обчно образуют скопления в виде гроздьев, каталазопозитивны, содержание Г+Ц в ДНК составляет 30-39 мол %. Многие способны к росту при 450 C, а также в присутствии 15 % NaCl, что определяется наличием у них особых трансмембранных транспортных белков (Vijaranakul, 1998). Восстанавливают нитраты в нитриты, активно гидролизуют белки и жиры, сбраживают в анаэробных условиях глюкозу, с образованием кислоты без газа. По типу питания они являются хемоорганотрофами, по типу дыхания – факультативными анаэробами. Процесс дыхания может регулироваться составом сред культивирования. Рост на средах, содержащих 0,1% глюкозы, стимулирует гликолиз, но подавляет цикл Кребса. При таком культивировании происходит подавление активности фумарат редуктазы, а также на 40% снижение концентрации цитохромов (Strasters, 1963). В анаэробных условиях наблюдается рост активности внутриклеточной ЛДГ, утилизирующий пируват до лактата (Collins, 1962; Strasters, 1963), в аэробных условиях образующийся при гликолизе пируват превращается в ацетилкоэнзим А, поступающий в цикл Кребса. Дерепрессия цикла трикарбоновых кислот происходит при исчерпании катаболизируемых углеводов и глутамата и сопровождается снижением ацетата в среде (Somerville, 2003).
Секреция факторов патогенности стафилококками связана со стадией роста микроба. Клеточно-ассоциированные факторы инвазии, такие как белок А и адгезины, продуцируются в экспоненциальной фазе роста и репрессируются в постэкспоненциальной фазе. Постэкспоненциальный рост характеризуется повышением синтеза внеклеточных факторов вирулентности, например, бета-гемолизина (Somerville, 2003). По функциональному принципу факторы патогенности стафилококков можно объединить в шесть основных групп (Smith, 1995), каждая из которых реализуется на определенном этапе развития стафилококковой инфекции: это факторы адгезии, межмикробного антагонизма бактерий, инвазии, альтерации, токсичности и иммунорезистентности (Дерябин, 2000).
При попадании в макроорганизм стафилококк, как и любая инфекция, сталкивается, в первую очередь, с неспецифическими факторами защиты.
К неспецифическим факторам защиты, свойственным всем животным, относят покровы тела, физиологические, гуморальные и клеточные факторы (Вершигора, 1990; Карр, 1986). Покровы тела - кожа и слизистые оболочки – обладают самостерилизующими свойствами. Антибактериальными агентами кожи являются ненасыщенные жирные кислоты, выделяемые сальными железами, молочная кислота пота, а также локально высокое осмотическое давление, создаваемое солями выделений. Слизистые оболочки также обладают бактерицидным действием. Они колонизированы комменсальными микроорганизмами, препятствующими внедрению чужеродной микрофлоры (Борисов, 1994).
При столкновении с первичными иммунологическими барьерами стафилококк реализует факторы адгезии, инвазии и межмикробного антагонизма бактерий. К факторам адгезии, детерминирующим процесс прикрепления стафилококков к различным поверхностям, относятся специализированные лиганды бактериальной клеточной стенки. Стафилококк способен прикрепляться как к клеткам, так и к межклеточным веществам различных тканей (фибронектин, коллаген, фибриноген и др.). За адгезию стафилококков на клетках эпителия ответственны тейхоевые кислоты. ClfA protein способствует прикреплению бактерий к гамма-цепи человеческого фибриногена (Bairoch, 2003). Всвязи с этим стафилококки не прилипают к тромбам, если они покрыты гноем, так как в этом случае фибронектиновые рецепторы заблокированы. К факторам адгезии относятся и капсульные полисахариды, способствующие присоединению к эндопротеазам. (Aly, 1977).
Факторы межмикробного антагонизма бактерий – бактериолизины, бактериоцины - ответственны за сохранение стафилококков на поверхности наружных покровов макроорганизма при взаимодействии с представителями нормальной микрофлоры (Thumm, 1997);
Факторы инвазии определяют возможность проникновения стафилококков во внутреннюю среду организма хозяина. К ним относятся гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин (Терновская, 1983; Christner, 1996). Fibronectin-binding protein A способен связываться с растворимыми и иммобилизованными формами фибронектина с помощью уникального сайта связывания локализованного в пределах 17 C-концевых остатков гамма-цепи человеческого фибриногена. Этот белок дает S.aureus возможность вторжения в эндотелиальные клетки, которая опосредуется интегрином альфа-5/бета-1 (Massey, 2001; Wann, 2000). Основным физиологическим фактором иммунитета является температура тела. Повышение температуры при лихорадке является эффективным средством борьбы организма со многими инфекциями (Рослый, 2003). Однако стафилококки способны размножаться в температурных границах от 10 до 430 С (Лебедева, 1969).
Биохимические методы исследования
Активность АСТ определяли кинетическим методом спектрофотометрически без применения пиридоксальфосфата (Laboratory diagnostics…, 1988; Тиц, 1997). Принцип метода заключается в том, что образующаяся при переаминировании под действием АСТ щавелевоуксусная кислота восстанавливается в яблочную кислоту с одновременным окислением НАДH при участии малатдегидрогеназы (Moss, 1999). Процесс сопровождается снижением рассеивания пучка света при длине волны =340 нм, пропорционально активности данного фермента в пробе.
Активность ЛДГ определяли, использовуя оптический тест Варбурга, который основан на реакции восстановления пирувата в лактат (Камышников, 2000; Wroblewski, La Due, 1955). Скорость уменьшения концентрации НАДH, регистрируемая по изменению оптической плотности (ОП) образца (=340 нм) прямо пропорциональна активности ЛДГ. Недостатком метода, основанного на обратной реакции, является более узкий по сравнению с прямой реакцией диапазон линейности. Если измеренная активность ЛДГ оказывается выше 70 мкКат, образец необходимо развести физиологическим раствором в соотношении 1:9, а результат, полученный при повторном измерении, умножить на 10 (Laboratory diagnostics…, 1988).
Активность КК определяли ферментативным кинетическим методом (Камышников, 2000; Оливер, 1955; Розальски, 1965; Cessi, 1979; Pesce, 1982). Метод основан на способности креатинкиназы катализировать разрушение креатинфосфата с одновременным превращением АДФ в АТФ, которая далее участвует в ферментативном фосфорилировании глюкозы (Карр, 1986; Deamer, 1976). Окисление глюкозо-6-фосфата с участием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы сопровождается превращением НAДФ+ в НAДФH (Камышников, 2000; Лаптева, 1970). Скорость возрастания концентрации НАДФH, определяемая фотометрически (=340 нм), пропорциональна активности КК.
Активность ЩФ определяли с помощью кинетического метода с использованием -нафтил-фосфата в качестве субстрата (Камышников, 2000; Bessey, 1946). Принцип метода заключается в том, что ЩФ катализирует гидролиз п-нитрофенилфосфата с образованием эквимолярного количества п-нитрофенола и неорганического фосфата (Kaplan, 1972). Скорость образования п-нитрофенола прямо пропорциональна активности ЩФ и измеряется по изменению ОП (=405 нм).
Активность КФ определяли методом количественного определения в сыворотке крови (Bodansky, 1972; Chapatwala, 1982). Принцип метода: КФ катализирует гидролиз 1-нафтилфосфата до 1-нафтола и фосфата. 1-нафтол дает в реакции с 2-аминотолуолом комплексное соединение – диазокраситель (Heller, 1987; Passing, 1983). Изменение окраски пропорционально активности КФ в образце.
Концентрацию глюкозы в сыворотке крови определяли унифицированным глюкозооксидазный методом (Биохимические методы…, 1969; Камышников, 2000). Принцип метода состоит в том, что при окислении -D-глюкозы кислородом воздуха с участием глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество пероксида водорода. Пероксидаза катализирует окисление 4-аминоантипирина пероксидом водорода в присутствии фенольных соединений. В результате образец окрашивается с интенсивностью, пропорциональной концентрации глюкозы. Концентрацию общего белка в плазме крови определяли по методу Бредфорда (Bradford, 1976). Принцип метода состоит в том, что белки в щелочной среде образуют комплекс с ионами меди, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации белка в пробе. Оценка интенсивности окраски проводится фотометрически (540 нм). Концентрация альбумина определялась фотометрическим методом по конечной точке (Блинов, 1996; Козинец, 1997). Принцип метода: альбумин в слабокислой среде в присутствии детергента взаимодействует с бромкрезоловым синим. При этом образуется окрашенное комплексное соединение. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации альбумина в пробе. 2.2.4. Биотехнологические методы
Изготовление липосом: Липосомы изготавливали методом гидратирования липидной пленки. Принцип метода заключается в том, что липидная пленка способна самопроизвольно образовывать бислойные структуры, содержащие растворенные в воде вещества (Швец Патент RU 2325150, 2008; Torchilin, 2003).
Методы работы с животными Сыворотку и плазму крови получали по общепринятым методикам (Кондратьева, 2001). Забор крови проводили у кроликов - пункцией ушной вены, у грызунов – из хвостовой вены, у цыплят – из подкрыловой вены, у морских свинок – пункцией сердца. Иммунизация животных: Морских свинок иммунизировали клетками стафилококков, прошедших термообработку (100оС, 1 ч.). Клетки суспендировали в неполном адъюванте Фрейнда. Иммунизацию проводили уколом в три точки вдоль позвоночника дозой 3 млрд клеток на голову.
Иммунизацию мышей карбодиимидными конъюгатами проводили внутрибрюшинно по 100 мкл конъюгата на 20 г веса.
Кроликов иммунизировали подкожно в три точки вдоль позвоночника: 1) липосомами (2мл), 2) смесью 2-х мл липосом с инактивированной кипячением биомассой E. coli Б-5 (4 млрд микробных тел), 3) смесью инактивированной биомассы S. aureus (8 млрд клеток) и E. coli Б-5 (4 млрд клеток) в 2 мл физиологического раствора. В качестве протяженной фазы суспензии липосом использовали 199 среду + фиколл (до концентрации 12,5%). Выбор среды 199 определялся ее питательными свойствами для иммунокомпетентных клеток. Использование фиколла определялось его индифферентностью для клеток иммунной системы и вязкостью, что позволяет создавать депо для липосом.
Изучение вирулентности исследуемых изолятов стафилококка
Были изучены морфологические и биохимические особенности 20-и клинических изолятов S. aureus, выделенных от животных с острыми и хроническими инфекционными заболеваниями. По морфологическим свойствам все изолированные стафилококки были грамположительны и неподвижны, имели шаровидную форму, в мазках располагались гроздьями.
При изучении культуральных свойств установлено, что все стафилококки формировали средние и крупные колонии. Восемнадцать изолятов S. aureus образовывали каротиноидный пигмент.
Определение биохимических характеристик указанных изолятов показало, что все они были каталазоположительными, плазмокоагулирующими, продуцировали лецитиназу, ферментировали глюкозу, мальтозу, маннит, но различались по продукции гемолизинов и протеолитических ферментов. Изучали зависимость проявления гемолитических и протеолитических свойств изолятов от условий выращивания инокулятов (табл. 2).
Было показано, что гемолитические свойства культур стафилококков при выращивании инокулятов на среде №8 проявляются лучше, чем при выращивании на среде 199 и сахарном бульоне. Для стимуляции протеолитических свойств стафилококков выбор среды инокулирования культур не имеет определяющего значения. Установлено, что наиболее выраженной гемолитической активностью обладают изоляты стафилококков №№ 1, 5 и 12. Протеолитическая активность наиболее выражена у изолятов №№ 1; 18 и 20. Таблица 2 - Различие изолятов Staphylococcus aureus 1-20 по продукции гемолитических и протеолитических ферментов изолятS. aureus№ ГЕМОЛИЗ ПРОТЕОЛИЗ Зоны просвета даны в мм. Р-гемолиз - зона полного просвета, а гемолиз - зоны просвета со следами эритроцитов. Изучали динамику накопления/разрушения лецитиназы, гемолитических и протеолитических ферментов в КЖ изолятов стафилококков, выращенных на различных питательных средах (рисунки 3, 4, 5). Было показано, что протеолитические ферменты лучше всего проявляются при культивировании на сахарном бульоне в течение трех суток, гемолизины - при культивировании в течение трех суток на среде 199, а лецитиназы - после двух суток культивирования на среде №8. Самая высокая активность протеолитических ферментов была выявлена в КЖ трехсуточной культуры стафилококка № 12, выращенного на среде 199. Рисунок 3 – Протеазная активность КЖ на 6-й час культивирования
Все культуры исследовали in vivo на вирулентность для белых мышей. Мышей (по 3 головы на каждый изолят) заражали введением в хвостовую вену 0,5 млрд. КОЕ S. aureus в 0,1 мл четырехсуточных КЖ данного изолята. Наблюдение проводили в течение 5 суток. Было установлено, что патогенными для мышей являются изоляты №№ 1, 2, 3 и 14. Из сердца и почек павших животных высевом на ЖСА и 5%-ный кровяной агар была выделена монокультура S. aureus.
Наличия факторов инвазии и альтерации у изолятов стафилококков определяли in vitro на культуре перевиваемой клеточной линии почки эмбрионов свиней СПЭВ - б. В матрацы с полностью сформированным монослоем СПЭВ – б вносилось по 1 мл культуральной жидкости (КЖ) бульонных культур изолятов стафилококков. Образцы инкубировались при 37оC в течение 20-и часов. Далее матрацы просматривали под микроскопом в проходящем свете (Рюмина и др., 2009).
Изоляты № 1 и № 10 полностью разрушили монослой (рисунок 6, А). Изоляты № 3 и № 8 повредили монослой в значительной степени. Изоляты № 2 и № 9 тоже оказали губительное действие на культуру СПЭВ – б (рисунок 6, Б). Монослой в матрацах, обработанных супернатантом остальных культур, не отличался от контрольного (рисунок 6, В, Г).
Изменение ферментативной активности энзимов плазмы крови и метаболической активности лейкоцитов кроликов под влиянием липосом in vivo
Способность различных изолятов стафилококков вызывать иммунный ответ изучали на морских свинках. В работе использовали 15 изолятов Staphylococcus aureus. Каждое животное иммунизировали убитыми кипячением клетками одного из 15-и изолятов в дозе 3 млрд КОЕ в неполном адъюванте Фрейнда, подкожно, в три точки вдоль позвоночника. Контрольным морским свинкам вводили 0,9% NaCl. Параметры иммунизации изучали через две недели.
Важной особенностью вакцинного штамма должна быть способность стимулировать родоспецифическое или видоспецифическое антителообразование, защищающее организм животного от заболевания при столкновении с вирулентным микроорганизмом (Галактионов, 2004).
Для изучения способности отдельных изолятов стафилококков вызывать антителообразование от всех подопытных животных были получены образцы гепаринизированной плазмы крови. Наличие антител определяли по реакциям агглютинации и опсонизации. Образцы плазмы крови каждой морской свинки проверяли на наличие АТ к изоляту, которым проводилась иммунизация, и ко всей группе исследуемых стафилококков в реакции агглютинации на стекле (табл. 3).
Реакция агглютинации показала, что 13 из 15-и изолятов оказались иммуногенными. Образцы плазмы крови иммунизированных морских свинок (ПлИм) агглютинировали не только тот изолят, которым было иммунизировано данное животное, но и от 40% до 100% других изолятов. Плазма крови интактных животных не агглютинировала ни один изолят.
Образцы плазмы крови морских свинок, иммунизированных S. аureus 7 и 20, дали хорошую агглютинацию со всеми исследуемыми изолятами.
В то же время, ряд изолятов аглютинировался подавляющим большинством образцов плазмы крови. Так, S. аureus 4; 6 и 13 агглютинировались всеми ПлИм, а №№ 3; 8 и 16 – четырнадцатью ПлИм из пятнадцати.
При изучении опсонизирующих свойств плазмы крови иммунизированных животных in vitro было выявлено, что образцы плазмы крови морских свинок, иммунизированных изолятами № 6 и № 13, усилили интенсивность адгезии клеток данных изолятов на моноцитах более чем в 2 раза (табл. 4).
Примечания: Жирным шрифтом выделен уровень адгезии иммунизирующего штамма в присутствии плазмы иммунизируемого им животного. Для образцов плазмы крови морских свинок, иммунизированных изолятами №№ 4; 6 и 7, было отмечено значительное увеличение интенсивности адгезии клеток других изолятов на моноцитах. Это позволяет сделать вывод, что указанные изоляты имеют антигенное сродство с широким спектром представленных стафилококков.
Было показано, что АТ, вырабатываемые в процессе иммунного ответа при иммунизации индивидуальными культурами исследуемых стафилококков, активны в отношении изолятов №№ 4, 6, 7, 11, 13, 16 и 19. Изоляты №№ 1, 2, 5, 8, 9 и 10 в образцах с плазмой крови иммунизированных животных становятся более устойчивыми к связыванию моноцитами, чем в образцах без добавления плазмы крови. Возможно, низкая адгезия и фагоцитируемость этих стафилококков связана со снижением их опсонизации, что в свою очередь может являться следствием наличия на поверхности клеточных стенок этих стафилококков белка А, обладающего способностью адсорбировать на себя антитела IgG через Fc фрагмент. В этом случае плазма крови иммунизированных животных служит источником АТ, маскирующих микробные клетки стафилококков, что затрудняет процесс захвата возбудителя фагоцитами.
На основании способности стимулировать антителообразование все исследуемые изоляты стафилококков были разделены на 3 группы: высоко иммуногенные, умеренно иммуногенные и низко иммуногенные (табл. 5).
Плазма крови животных является единой системой, позволяющей поддерживать жизнеспособность клеток организма (Овчинников, 1989). Бактерицидные свойства плазмы крови обусловлены наличием в ней антител, комплемента, лизоцима и других защитных факторов (Галактионов, 2004), ростовые - наличием растворенных в сыворотке крови питательных веществ (Иммунобиология…, 1977). Суммарный эффект может быть как бактериостатическим, так и стимулирующим рост бактерий.
Изучали зависимость бактериостатического действия плазмы крови от иммунизации на примере роста 15-и изолятов стафилококков в плазме крови морских свинок, иммунизированных тем же изолятом, в сравнении с ростом в плазме крови интактных морских свинок (ПлИн) и в питательном бульоне (ПБ) in vitro (рис. 7). Рисунок 7 – Рост изолятов стафилококков в плазме крови иммуннизированных и неиммунизированных животных
При иммунизации возросла бактериостатическая активность плазмы крови морских свинок, иммунизированных изолятами S. аureus 7, 8, 9 и 13. Несколько возросла бактериостатическая активность плазмы крови животных, иммунизированных изолятами №№ 4; 5; 6; 10 и 16. Остальные стафилококки росли в плазме крови иммунизированных животных лучше, чем в образцах неиммунной плазмы крови.
Изучали ингибирующее действие плазмы крови морских свинок, иммунизированных одним из изолятов, на другие изоляты стафилококка (табл. 6).
Было установлено, что плазма крови животных, иммунизированных изолятом № 9, ингибировала рост большинства изолятов стафилококков. Плазма крови животных, иммунизированных изолятом № 1, показала наиболее низкий бактериостатический эффект в отношении всех изолятов.