Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Репродуктивные технологии в сельскохозяйственном животноводстве 12
1.2 Индукция суперовуляции у коров-доноров эмбрионов и факторы, влияющие на её результаты 15
1.2.1 Влияние физиологического состояния донора на результаты индукции суперовуляции 17
1.2.2 Влияние сезона года и условий содержания коров на результаты индукции суперовуляции 19
1.2.3 Влияние гормонального фона донора на результаты суперовуляции 22
1.2.4. Влияние вида гонадотропинов на результаты индукции суперовуляции 25
1.2.5. Применение гонадотропинов с модифицированным высвобождением 28
1.3 Геномная нестабильность и микроядерный тест 32
1.4 Тимические факторы как корректирующий инструмент репродуктивной функции у коров 35
2 Собственные исследования 40
2.1 Материалы и методы исследований 40
2.2 Результаты исследований 45
2.2.1 Сравнительная оценка эффективности индукции суперовуляции препаратом ФСГ и его композициями с пролонгаторами 45
2.2.2 Разработка фармацевтической композиции с пролонгированным действием гонадотропинов на основе высокомолекулярного полимера полиэтиленгликоль и способа её применения для индукции суперовуляции у коров 53
2.2.3 Применение тимических факторов, их влияние на метаболизм коров–доноров 60
2.2.3.1 Динамика гормональных изменений в крови коров-доноров после применения тимических факторов 62
2 2.2.3.2 Динамика биохимических показателей крови коров-доноров после применения тимических факторов 69
2.2.3.3 Динамика гематологических показателей у коров-доноров эмбрионов после применения тимических факторов 75
2.2.3.4 Влияние тимических факторов на эмбриопродуктивность 79
2.2.3.5 Гормональный фон коров-доноров перед и во время индукции суперовуляции при различных режимах введения тимомиметиков 81
2.2.4 Анализ эффективности применения различных методов и режимов введения тимических факторов при подготовке коров-доноров к процедуре индукции суперовуляции 85
2.2.4.1 Эффективность синхронизации половых циклов у коров-доноров при различных режимах применения тимомиметиков 86
2.2.4.2 Продолжительность половой охоты и оплодотворяемость яйцеклеток при различных режимах применения тимомиметиков 90
2.2.4.3 Продолжительность половой охоты и стадии развития полученных эмбрионов при различных режимах применения тимомиметиков 93
2.2.4.4 Сравнительный анализ полученных результатов при различных режимах введения тимомиметиков 96
2.2.5 Фронтальный метод гормональной обработки коров-доноров с целью подготовки и проведения процедуры индукции суперовуляции 99
2.2.5.1 Анализ эффективности фронтального метода подготовки и проведения индукции суперовуляции у коров-доноров по сравнению с классическим способом проведения данной процедуры 106
2.2.6 Влияние цитогенетических аномалий, встречающихся в клетках периферической крови у коров-доноров эмбрионов на результаты суперовуляции и характеристики эмбрионов 109
3 Обсуждение 112
4 Выводы 115
5 Список используемой литературы 118
6 Приложения 154
- Применение гонадотропинов с модифицированным высвобождением
- Разработка фармацевтической композиции с пролонгированным действием гонадотропинов на основе высокомолекулярного полимера полиэтиленгликоль и способа её применения для индукции суперовуляции у коров
- Гормональный фон коров-доноров перед и во время индукции суперовуляции при различных режимах введения тимомиметиков
- Фронтальный метод гормональной обработки коров-доноров с целью подготовки и проведения процедуры индукции суперовуляции
Введение к работе
Актуальность. В современном животноводстве репродуктивные биотехнологии
занимают свою нишу в практическом воспроизводстве высокопродуктивного
поголовья на молочных и мясных фермах. В настоящее время в мире проводят
около 1,5 млн. пересадок эмбрионов в год, примерно 60% из них получены методом
in vivo. [Blondin, 2015]. Опыт разработки и применения технологий по получению и
трансплантации эмбрионов коров накапливается уже в течение около 40 лет.
Однако, несмотря на это, многие этапы технологии и сегодня требуют новых
разработок и подходов [Эрнст, Зиновьева, 2008; Ерёмина 2012]. Так, например,
гонадотропная индукция суперовуляции до сих пор отличается не всегда
прогнозируемой ответной реакцией и остается важным ограничивающим фактором
[Rico et. al., 2012]. Одной из проблем применения гипофизарного
фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) для индукции суперовуляции является несовершенство форм и режимов его введения, при которых отмечается высокая скорость его инактивации, что определяет необходимость многократных инъекций [Бабенков, 2010]. В тоже время перед научными коллективами широко и повсеместно ставятся задачи по разработке новых лекарственных средств и форм для повышения эффективности животноводства [Самуйленко и др., 2009]. Недостаточно разработанным остается вопрос о подборе коров-доноров эмбрионов с исключением животных с повышенной геномной нестабильностью для снижения вероятности получения эмбрионов пониженного качества [Косовский, 2014; Глазко, 2013]. Таким образом, вариативность ответной реакции на введение гонадотропинов, несовершенство процедуры индукции суперовуляции, возможный вклад коров-доноров эмбрионов в тиражирование и накопление генетического груза, определяют необходимость поиска новых подходов и режимов введения гонадотропинов в тактике индукции суперовуляции, новых биорегуляторов для повышения результативности индукции суперовуляции, а также изучения влияния геномной нестабильности коров доноров на результативность суперовуляции и получение жизнеспособных эмбрионов. Степень разработанности. К настоящему времени разработаны схемы и режимы введения гонадотропных препаратов с целью индукции суперовуляции у коров [B et. al., 2014], имеются разработки использования различных биологических активных веществ [Дегтярёв, 2006; Леонов, 2006], а также попытки сокращения количества инъекции гипофизарных гонадотропинов [Trbulo et. al., 2011, Yang 2007]. Тем не менее, практическое применение общепринятых схем и методов индукции суперовуляции сопряжено с рядом сложностей, в частности, с высокой вариативностью ответной реакции [Кононов, 2009; Полянцев, 2010], трудоёмкостью, возникновением стрессов у доноров [Бабенков, 2010] и т.д. В литературе [Глазко и др., 2013] имеется ограниченное количество данных о связях между стабильностью генетического аппарата и репродуктивным здоровьем у ряда видов [Косовский, 2014], что требует дальнейших исследований.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка новой
фармацевтической композиции для индукции суперовуляции у коров, а также
методических подходов и тактики индукции суперовуляции для снижения
вариативности ответных реакций и получения максимального количества
жизнеспособных эмбрионов. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие основные задачи:
-
Изучить эффективность применения препаратов ФСГ с пролонгаторами с целью индукции суперовуляции и сравнить со стандартной схемой индукции суперовуляции препаратами ФСГ.
-
Разработать фармацевтическую композицию с пролонгированным действием гонадотропинов на основе высокомолекулярного полимера полиэтиленгликоль для индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов, позволяющую повысить количество синхронно созревших фолликулов и выход качественных зрелых яйцеклеток, пригодных для оплодотворения, а также увеличить количество получаемых качественных эмбрионов.
-
Изучить эффективность применения тимических факторов при подготовке коров-доноров эмбрионов к процедуре индукции суперовуляции, выявить их влияния на гормональные, биохимические и гематологические показатели крови и эмбриопродуктивность коров.
-
Провести сравнительный анализ эффективности различных режимов введения тимических факторов при подготовке коров-доноров к процедуре индукции суперовуляции определить их влияние на показатели суперовуляции у коров-доноров эмбрионов и развитие эмбрионов.
-
Разработать метод фронтальной обработки коров-доноров эмбрионов, направленный на повышение выхода пригодных к трансплантации и криоконсервации эмбрионов.
-
Выявить связь между частотой встречаемости отдельных цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у коров-доноров и количеством полученных от них жизнеспособных эмбрионов.
Научная новизна. Впервые проведен анализ эффективности однократной инъекции
препаратов ФСГ с пролонгаторами (поливиниловый спирт и полиэтиленгликоль) в
сравнении со стандартным методом введения препаратов ФСГ для индукции
суперовуляции у коров-доноров. Впервые разработана фармацевтическая
композиция с пролонгированным действием гонадотропинов на основе
высокомолекулярного полимера полиэтиленгликоль для индукции суперовуляции, позволяющая повысить количество синхронно созревших фолликулов и выход качественных зрелых яйцеклеток, пригодных для оплодотворения, а также увеличить количество получаемых качественных эмбрионов. Впервые изучено влияние тимических факторов на отдельные звенья метаболизма, гормональную регуляцию, ряд показателей крови в различные дни эстрального цикла и при индукции суперовуляции. Впервые разработаны и апробированы различные режимы применения тимических факторов с целью подготовки коров-доноров к индукции
супер овуляции, проведена сравнительная оценка их эффективности, изучено влияние тимических факторов во время индукции суперовуляции на синхронизацию половой цикличности, оплодотворяемость яйцеклеток и продолжительность охоты, качество и стадии развития полученных эмбрионов. Впервые разработан метод фронтальной обработки коров-доноров эмбрионов с целью индукции супер овуляции, направленный на повышение выхода пригодных к трансплантации и криоконсервации эмбрионов. Впервые выявлена связь между частотой встречаемости цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у коров-доноров эмбрионов, количеством и качеством полученных от них эмбрионов. Теоретическая и практическая значимость работы. Применение пролонгаторов действия препаратов ФСГ у коров-доноров позволяет сократить количество инъекций препаратов гипофизарных гонадотропинов и увеличить выход пригодных к использованию эмбрионов. Разработанная фармацевтическая композиция с пролонгированным действием гонадотропинов у коров позволяет повысить количество синхронно созревших фолликулов и последующую их овуляцию, выход яйцеклеток, пригодных для оплодотворения, а также количество качественных эмбрионов. Применение тимических факторов снижает вариативность ответной реакции яичников на введение гонадотропинов и способствует увеличению количества жизнеспособных эмбрионов. Метод фронтальной обработки позволяет увеличить эмбриопродуктивность коров-доноров, снизить трудоемкость и временные затраты в 3-4 раза, расход доз семени на 33,3%, в сравнении с рекомендуемыми методами индуцирования суперовуляции. Выявленная связь между частотой встречаемости цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у коров-доноров эмбрионов с высоким уровнем ответной реакции на введение гонадотропинов и качеством эмбрионов, свидетельствует о необходимости проведения цитогенетического контроля при подборе родительских особей. Разработанные методы индукции суперовуляции включены в руководство по трансплантации эмбрионов [Попов и др., 2017], фармацевтическая композиция для индукции суперовуляции применяется в республике Калмыкия в ООО «Калмыцкое» по племенной работе и в г. Оренбург в ООО НПЦ «Инновационная ветеринария» при получении эмбрионов коров методом in vivo, разработанный метод фронтальной обработки коров с целью подготовки и проведения индукции суперовуляции применяется в Московской области в ОАО «Можайское» при получении эмбрионов коров методом in vivo.
Методология и методы диссертационного исследования. Для достижения цели и выполнения поставленных задач применялись биотехнологические, ветеринарные, зоотехнические, лабораторные и статистические методы исследования.
Положения, выносимые на защиту
Применение пролонгаторов действия препаратов ФСГ оптимизирует процедуру индукции суперовуляции и повышает её эффективность у коров-доноров.
Разработана фармацевтическая композиция для индукции суперовуляции у коров-доноров, позволяющая повысить количество синхронно созревших фолликулов и
выход качественных зрелых яйцеклеток, пригодных для оплодотворения, а также увеличить количество получаемых качественных эмбрионов.
Применение тимических факторов синтетического и природного происхождения при подготовке и проведении индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов повышает её результаты, выражающиеся в повышении количества и качества получаемых от них эмбрионов.
Разработан метод фронтальной обработки коров-доноров гормональными и профилактическими препаратами с целью подготовки и проведения индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов, повышающий выход качественных эмбрионов.
Геномная нестабильность, оцениваемая по частотам встречаемости клеток с цитогенетическими аномалиями в клетках периферической крови коров-доноров эмбрионов, коррелирует с результатами суперовуляции, а также количеством и качеством полученных эмбрионов.
Степень достоверности и апробация работы
Результаты работы докладывались и вошли в ежегодные отчёты ФГБНУ ЦЭЭРБ (2013-2016 г.г.); а также изложены в материалах: Международной конференции «Актуальные проблемы развития ветеринарной науки», Самара 16 октября 2014 г.; VIII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» - 2015; Международной конференции, посвященной 55-летию ВНИИФБиП (г. Боровск, 15-17 сентября 2015) «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» -2015 г.; Международной научно-практический конференции, посвященной 20-летию Конституции Республики Казахстан и Ассамблеям народа Казахстана, «Наука и образование 21 века: опыт и перспективы» 2015 г.; на Международной конференции «New Insights in Reproductive medicine from Asia to the World» (г. Гент, Бельгия, 2015). Разработки удостоены 2 дипломов, 2 золотых медалей Российской агропромышленной выставки «Золотая осень», Москва (2013 г., 2015 г.); гран-при в номинации «Лучшая научная разработка» Международной специализированной выставки животноводства и племенного дела «AgroFarm», Москва (2016 г., 2017 г.).
Работа проводилась в рамках Программы фундаментальных научных исследований на 2013-2020 годы, п. 19 «Теоретические основы молекулярно-генетических методов управления селекционным процессом с целью создания новых генотипов животных, птиц, рыб и насекомых с хозяйственно-ценными признаками, системы их содержания и кормления» по направлению «Методы коррекции репродуктивного статуса стад в молочном скотоводстве с применением усовершенствованных приемов эмбриотрансплантаций, новых технологий подготовки к оплодотворению и ранней диагностики стельности коров». Соответствие диссертации паспорту специальности. Выполненная диссертационная работа соответствует пункту 10 паспорта специальности 03.01.06 -Биотехнология (в том числе бионанотехнологии).
Личный вклад автора. Основная экспериментальная работа - проведение процедур по индукции суперовуляции и извлечению эмбрионов, оценка эмбриосборов, взятие проб крови и лабораторные исследования, статистическая обработка результатов -выполнена автором самостоятельно. Постановка задач и выбор стратегии их решения, разработка фармацевтической композиции, разработка схем и режимов введения препаратов проводились совместно с Косовским Г.Ю. Обработка, и интерпретация результатов проводились вместе с Косовским Г.Ю., Глазко Т.Т., Глазко В.И. и Дегтярёвым В.П.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 печатных работы, в том числе 9 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 14 тезисов докладов в материалах конференций. Получено 9 патентов Российской Федерации – 6 на полезную модель и 3 патента на изобретение. Выпущено одно руководство по получению и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах, содержит 21 таблиц, 9 рисунков. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методика, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы. Список литературы включает 289 источника, в том числе 110 на иностранных языках.
Оптимизация методов индукции суперовуляции заключалась в сокращении
количества инъекций гонадотропинов гипофизарного происхождения при
выполнении процедуры индукции суперовуляции, в сокращении вариативности ответных реакций и повышении выхода качественных эмбрионов.
Исследования проводили на 688 коровах-донорах эмбрионов молочных и мясных пород с 2007 по 2017 гг. в следующих хозяйствах: в Белгородской области – «Интеко-Агро»; в республике Калмыкия – ООО «Калмыцкое» по племенной работе, ООО ПР «Агрофирма Уралан»; в Московской области – ОАО «Можайское» и ОАО «Московский конный завод №1»; в Калужской области «Русский фермер». Животных подбирали с высокой продуктивностью, со сроком после отела не менее 2 месяцев, гинекологически здоровых, с регулярно чередующимися эстральными циклами. Опытные и контрольные группы животных формировали по принципу пар-аналогов. Для индукции суперовуляции использовали препарат ФСГ-супер российского производства ООО «Агробиомед» г. Боровск Калужская обл. по рекомендации производителя на 10-, 11-, 12-е сутки эстрального цикла соответственно в дозах: 12, 8, 4, 4 мг/гол/сут. Для пролонгации действия препарата ФСГ-супер использовали поливиниловый спирт (ПВС) и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Осеменение доноров проводили трёхкратно [Кононов, 2009; Полянцев, 2010] ректоцервикальным способом; при фронтальном методе обработки с целью индукции суперовуляции сокращали количество процедур осеменений до двух и соответственно доз семени на 33,3%.
Схема исследований
Изучение влияния частоты встречаемости
цитогенетических аномалий в клетках
периферической крови на уровень
суперовуляции и характеристики эмбрионов у
коров-доноров
Микроядерный тест
Получение
эмбрионов коров
методами
индукции
суперовуляции
Терапевтические и
технологические способы
коррекции и оптимизации
методов индукции суперовуляции у коров
Отбор доноров по
фенотипическим
признакам
>2% м.я.
Индукция суперовуляции (классический способ)
Критерии оценки:
-
Количество прореагировавших животных
-
Уровень суперовуляции
-
Выход эмбрионов (общее количество, пригодных, дегенерированных яйцеклеток)
Применение пролонгаторов
Применение тимических факторов
Индукция
суперовуляции
с ФСГ+ПЭГ
Классический способ
индукции
суперовуляции
(контроль)
Тимический фактор
(0-10 день полового
цикла) + классический
способ индукции
суперовуляции
Метаболизм у коров-доноров в разные дни полового цикла:
1. Динамика гормональных изменений
2. Изменения биохимических показателей в крови
3. Изменения гематологических показателей крови
Тимический фактор (1-5 день полового цикла) + классический способ индукции суперовуляции)
Классический
способ индукции
суперовуляции
(контроль)
Тимический фактор (6-10 день полового цикла) + классический способ индукции суперовуляции)
Критерии оценки:
-
Уровень половых гормонов перед и в период индукции суперовуляции
-
Количество прореагировавших животных
-
Уровень суперовуляции
-
Выход эмбрионов (общее количество, пригодных, дегенерированных яйцеклеток
Для разработки фармацевтической композиции с пролонгированным действием гонадотропинов и способа её применения использовали препараты ФСГ-супер российского производства ООО «Агробиомед» и Плюсет, содержащие гипофизарные гонадотропины - ФСГ и лютеинизирующий гормон (ЛГ) при соотношениях ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1), и пролонгатор действия ФСГ ПЭГ с молекулярной массой 6000 Дальтон (Да). В состав композиции дополнительно включали 0,25% раствор новокаина. Полученную смесь однократно инъецировали животному-донору либо в подкожную клетчатку, либо внутримышечно на 10 или 11 день полового цикла. Через 48 часов вводили препарат-аналог простагландина F2 (эстрофан) в соответствии с инструкцией по применению.
Для изучения влияния тимических факторов на индукцию суперовуляции у коров-доноров применяли тимомиметики (Хавинсон, 2003) синтетического происхождения - Тимоген (ЗАО «Медико-биологический научно-производственный комплекс «Цитомед», г. Санкт-Петербург) и природного происхождения - Тималин (ООО «Самсон-Мед», г. Санкт-Петербург).
Извлечение эмбрионов проводили нехирургическим способом с
использованием разработанных нами и запатентованных ФГБНУ ЦЭЭРБ катетеров и устройств различных модификаций, а также коммерческих инструментов [Патенты РФ №156767, №156768; Патенты РФ №160215; №160216]. При вымывании эмбрионов использовали также разработанное нами оригинальное устройство для сбора эмбрионов [Патент РФ №153867].
Подсчет полученных эмбрионов и оценку их качественных характеристик выполняли под стереомикроскопом при 150-200-кратном увеличении. Оценку качества проводили, учитывая стадию развития эмбриона и ее соответствие возрасту, обращали внимание на состояние клеточной массы и оболочек, характер связи между бластомерами, прозрачность перивителлинового пространства [ГОСТ 28424-2014; B, Mapletoft, 2013].
Исследования содержания гормонов эстрадиола, прогестерона, тироксина,
кортизола и ФСГ проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа
на иммуноферментном иммуноанализаторе «Санрайс Текан» с использованием
тест-систем для прогестерона, ФСГ, кортизола «Алкор-Био» (г. Санкт-Петербург) и
«Хема Медико» (г. Москва) для эстрадиола-17 [Головченко, Польщев, 2000;
Кондрахин, 2004]. Определение биохимических показателей в крови коров-доноров:
белковых фракций; ферментов; аланинаминотрансферазы (АлАТ);
аспартатаминотрансферазы (АсАТ); щелочной фосфатазы (ЩФ); холестерина и триглицеридов проводили согласно общепринятым методикам [Бажибина, Блинов, 1974; Сентебова, 1978; Титов, Творогова, 1995; Reitman, 1957]. Для определения гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов и лейкоцитарной формулы использовали автоматический гематологический анализатор Abacus Junior Vet 5 (Diatron Messtechnik GmbH).
Кровь для цитогенетических исследований забирали из хвостовой вены
животных перед началом гормональной стимуляции суперовуляции.
Краткосрочную культуру клеток крови готовили обычным способом на среде Хенкса-199 с добавлением антибиотиков и фитогемаглютинина. Клетки культивировали в течение 72 часов, затем в термостате при температуре 37С, инкубировали в гипотоническом растворе KCl (0,54%) на протяжении 50 минут, далее фиксировали смесью метилового спирта с уксусной кислотой (3:1). Суспензию клеток наносили на охлажденные предметные стекла, затем окрашивали красителем Гимза. Оценивали: частоты встречаемости метафаз с ассоциациями хромосом по центромерным районам по типу робертсоновских транслокаций; хромосомными аберрациями (хромосомные, хроматидные разрывы; кольцевые хромосомы, фрагменты); асинхронным расщеплением центромерных районов хромосом; доли полиплоидных и анеуплоидных клеток. Частоты встречаемости рассчитывали относительно всей выборки просмотренных метафаз.
Статистическую достоверность межгрупповых отличий оценивали по критерию Стьюдента. Коэффициенты корреляции и их достоверность рассчитывали при использовании стандартной компьютерной программы Statistica.
Применение гонадотропинов с модифицированным высвобождением
В выборе препарата для индукции суперовуляции у коров-доноров на практике предпочтение отдают препаратам, содержащим гонадотропины гипофизарного происхождения (ФСГ) по сравнению с препаратами, содержащими сывороточный гонадотропин (ГСЖК) [9,10,282]. Это обусловлено тем, что длительное стимулирующее воздействие больших доз ГСЖК может оказать отрицательное влияние на овуляцию и вызвать образование второй фолликулярной волны и, как следствие, возникновение поликистозных образований на яичниках [202]. Но в тоже время по причине короткого периода инактивации в крови многоразовое введение ФСГ не только трудоемко по исполнению, но и является источником стресса у животных. Поэтому возможность пролонгации действия препаратов ФСГ привлекает внимание многих исследователей [10,257], так как, имея пролонгатор для поддержания стабильного эффективного уровня гормона в крови обрабатываемого донора, значительно повышается возможность получить более высокий ответ на индукцию суперовуляции, выражающийся в количестве и качестве получаемых эмбрионов [149,162]. Использование пролонгаторов при применении гипофизарных гонадотропинов для индукции суперовуляции может быть продиктовано рядом факторов, чем и обусловлен интерес к поискам пролонгированной формы гипофизарных гонадотропинов для индукции суперовуляции у коров-доноров.
Были проведены исследования, направленные на продление действия однократной инъекции ФСГ с использованием в качестве пролонгаторов карбокси-метил-целлюлозы и поливинилпирролидона, но они оказались малоэффективными [196,279,281,287]. Применение 3,2%-го раствора желатина было более успешным [15,32]. При сокращении числа инъекций ФСГ вдвое была получена сходная полиовуляция.
Были проведены исследования по выявлению адъюванта, который при смешивании с гонадотропином, приведет к медленному высвобождению ФСГ в течение долгого времени, что вызывает реакцию суперовуляции аналогичную нескольким традиционным инъекциям [277].
Установлено, что введение желатинизированного ФСГ один раз в день приводит к большему образованию желтых тел и жизнеспособных эмбрионов в сравнении со стандартным протоколом - двумя инъекциями в день[241].
Введение единичного болюса 400 mg of NIH-FSH-Pl of Folltropin-V подкожно за плечом животного дает аналогичный результат введению ФСГ корове дважды в день внутримышечно в течение 4 дней [192].
Исследования, проведённые на Японских черных коровах по индукции суперовуляции в виде единичной внутримышечной инъекции комбинации геля гидроксида алюминия с 30 mg pFSH, показали хорошие результаты, наличие ФСГ в плазме фиксировалось до 4 дней после инъекции [223].
Хорошие результаты также были достигнуты с использованием пролонгирования действия гипофизарных гонадотропинов с помощью полимера поливинилового спирта[10,11,150]. Интересно отметить, что уровень суперовуляции практически не отличался между опытом и контролем. При этом основной показатель, количество пригодных для трансплантации эмбрионов в опытной группе было больше на 1,2 (7,5 против 6,3). Это было связано не только с общим числом извлеченных зародышей, но и с повышением выхода качественных эмбрионов за счет уменьшения дегенерированных эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток. В 2009 г. этой группой исследователей получен патент на изобретение средства, пролонгирующего действие ФСГ для индукции суперовуляции у коров-доноров [9,10,11,12].
Однако, по мнению авторов, гипофизарный ФСГ связанный с ПЭГ является компетентным в активации рецептора in vitro, снижает иммунологическую реакцию, не затрагивая при этом биологическую активность in vivo, однако необходимы дополнительные исследования, чтобы определить влияние на устойчивость периода полураспада [283].
Лоу с соавторами[241] показали, что ФСГ, связанный с областью Fc домена IgG, сохраняет активность in vivo. В исследованиях других авторов [229] было показано, что вводимый через вагинальные подкожные инъекции hФСГ спровоцировал адекватную суперовуляторную реакцию при использовании минимального количества гормона, при меньшем количестве инъекций.
На разных животных, в том числе коровах, овцах и т.д., применялась единичная инъекция ФСГ комбинированная с поливинилпирролидоном (PVP) или гиалуроновой кислотой. В таком случае носитель рассасывался медленно в течение нескольких дней [196,199,279,281].
Сравнительно недавно проводились исследования на Bos taurus с использованием Folltropin-V (Bioniche), восстановленным 0.5% медленно высвобождаемой формой разбавителя на базе гиалуроновой кислоты [224, 240].
Разработка фармацевтической композиции с пролонгированным действием гонадотропинов на основе высокомолекулярного полимера полиэтиленгликоль и способа её применения для индукции суперовуляции у коров
Для проведения индукции суперовуляции у самок млекопитающих была разработана фармацевтическая композиция с пролонгированным действием гонадотропинов, а также определена её эффективность. При разработке данной фармацевтической композиции ставились следующие требования к ней как к гормональному средству для индукции суперовуляции у самок млекопитающих данная фармацевтическая композиция должна быть однократного введения и повышать выход яйцеклеток пригодных к оплодотворению и повышать количество эмбрионов высокого качества. Выполнение данных требований достигалось тем, что разработанная фармацевтическая композиция с пролонгированным действием гонадотропинов содержала следующие компоненты: гипофизарные гонадотропины - фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ) при следующих соотношениях ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1); пролонгатор действия фолликулостимулирующего гормона биологически деградируемый полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 Да и 0,25 % раствор новокаина. Данные компоненты в фармацевтической композиции находились в следующих соотношениях, вес.%: ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) активностью 1000 МЕ в 0,25 %-ном растворе новокаина -75; ПЭГ с массой 6000 Да - 25. При этом ФСГ и ЛГ в данной композиции являлись активными (действующими) веществами, а 0,25 % раствор новокаина и ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да – вспомогательными веществами. Для практического применения разработанную фармацевтическую композицию готовили следующим образом - во вспомогательное вещество 0,25% раствор новокаина объемом 7,5 мл добавляли действующие вещества ФСГ/ЛГ (1/0,001 или 1/1) активностью 1000 МЕ и добавляли вспомогательное вещество ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да в количестве 2,5 г. При этом, фармацевтическая композиция содержала полную дозу действующего вещества, которая необходима для проведения индукции суперовуляции у самок крупного рогатого скота и подлежала однократному введению в полном объеме. В тоже время в случае, когда надо провести процедуры индукции суперовуляции самкам других видов млекопитающих, то однократно вводят часть данной фармацевтической композиции, в которой количество МЕ активного вещества было бы необходимо на одну самку в зависимости от вида млекопитающего.
Эффективность разработанной фармацевтической композиции определяли испытанием её терапевтического действия, заключающимся в пролонгированном гонадотропном воздействии и способности индукции суперовуляции у самок млекопитающих.
Одним из объектов нашего исследования по определению эффективности индукции суперовуляции разработанной фармацевтической композицией были лабораторные белые мыши. С этой целью группе 1 (опытной) в количестве 50 штук лабораторных белых мышей, находящихся в возрасте 8-9 недель, провели индукцию суперовуляции однократной подкожной инъекцией, разработанной фармацевтической композиции с содержанием действующих веществ ФСГ/ЛГ (1/0,001) активностью 5 МЕ. Для этого, каждому животному внутрибрюшинно вводили 200-ю часть (0,05 мл рабочего раствора) разработанной фармацевтической композиции, содержащей действующие вещества ФСГ/ЛГ (1/0,001) активностью 1000 МЕ, растворенных в 7,5 мл 0,25% раствора новокаина, и содержащей ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да в количестве 2,5 грамма. Через 48 часов вводили хорионический гормон человека – ХГЧ в дозе 5 И.е. Группе 2 (контрольной), состоящей также из 50 мышей, вводили 0,05 мл. 0,9% раствора NaCl. Через 14 часов после инъекции ХГЧ мышей усыпляли, взвешивали массу тела, затем вскрывали брюшную полость, извлекали матку с яичниками, тщательно очищали от соединительной и жировой ткани, отделяли яичники от матки и взвешивали их на электронных весах. Реакцию считали положительной, если масса яичников мышей в опытной группе была больше как минимум в два раза по отношению к массе яичников в контрольной группе. Определяли массовый коэффициент МК яичников по формуле: МК(%) = Масса яичников (г) / Масса тела (г) 100%. Также из ампулы яйцеводов извлекали выделившиеся ооциты, поиск и подсчёт которых проводили под бинокулярным микроскопом (Nikon SMZ 800). Данные с результатами индукции суперовуляции и выхода яйцеклеток у лабораторных белых мышей после обработки их разработанной фармацевтической композицией представлены в таблице 3.
Данные, представленные в таблице, показывают, что масса яичников у мышей опытной группы в среднем была достоверно больше (p0,01) практически в 3 раза по отношению к средней массе яичников у мышей контрольной группы, также была установлена достоверная разница (p0,01) между массовыми коэффициентами яичников опытной и контрольной группами. Количество полученных ооцитов при этом в группе обработанной фармацевтической композицией составило в среднем 21±7 на одно животное, в контрольной группе этот показатель был равен 4±2 ооцита в среднем на одну мышь. Таким образом, достоверное увеличение (p0,01) средней массы яичников и массовых коэффициентов в группе мышей, обработанных фармацевтической композицией, по отношению к контрольной группе говорит об эндокринной направленности действия данной композиции, а гораздо больший выход ооцитов в опытной группе, чем в контрольной свидетельствует об эффективности её применения с целью индукции суперовуляции у млекопитающих.
Также исследования по эффективности разработанной фармацевтической композиции проводили на коровах-донорах эмбрионов.
Для этого разработанной фармацевтической композицией были обработаны коровы-доноры с целью индукции у них суперовуляции и получения от них эмбрионов, при этом каждому животному на 10 или 11 день полового цикла однократно вводили подкожно разработанную фармацевтическую композицию, содержащую действующие вещества ФСГ/ЛГ (1/0,001-1/1) активностью 1000 МЕ, растворенные в 7,5 мл 0,25% раствора новокаина, и содержащей ПЭГ с молекулярной массой 6000 Да в количестве 2,5 грамма.
В таблице 4 приведены данные, полученные в ходе исследования. Показано, что было обработано 4 группы животных по 20 голов коров в каждой, в группах 1 и 2 применяли препарат «ФСГ-супер», а в группах 3 и 4 - препарат «Плюсет». При этом, для объективного выявления эффективности разработанной композиции, доноров в группах 1 и 3 обработывали рабочей смесью без новокаина, а в группах – 2 и 4 рабочую смесь использовали с новокаином. Полученные данные показывают, что количество прореагировавших животных в группах было практически одинаковым и составило в группе 1 и группе 3 16 и 15 голов доноров, или 80% и 75% от обработанных животных, а в группах 2 и 4 - 16 и 16 голов коров-доноров, или 80% от обработанных. При этом количество эмбрионов, полученных от них, также не имело практически значимых различий, и было следующим группа 1 – 158 эмбрионов, или 9,9 эмбриона на одного донора в среднем, группа 2 – 167, или 10,4 эмбриона в среднем на одну корову, группа 3 – 145, или 9,6 эмбрионов в среднем, и от коров 4 группы был получен 161 эмбрион, что в среднем на одного донора составило 10,0 эмбрионов по группе. Количество качественных эмбрионов полученных в группах было следующим: группа 1 – 8,6; группа 2 – 9,5; группа 3 – 8,0; группа 4 – 9,1.
Гормональный фон коров-доноров перед и во время индукции суперовуляции при различных режимах введения тимомиметиков
Считается, что определение гормонального фона у коров-доноров, в частности уровней половых гормонов в крови перед введением гонадотропинов, позволяет уточнить функциональное состояние яичников и способствует правильному отбору животных, отмечается, что объективным критерием фазы эстрального цикла может быть концентрация прогестерона и эстрадиола в плазме крови и молоке.
Исследования были выполнены на поголовье коров симментальской породы в условиях промышленного молочного комплекса. Опытные группы животных формировали по принципу пар-аналогов исходя из физиологического состояния, возраста, продуктивности, живой массы и стадии полового цикла. Для исследований подбирали здоровых животных, которые после отела в течение сервис-периода (3 месяца) проявляли полноценную половую цикличность (наличие всех феноменов полового цикла). Первой группе коров-доноров с целью вызывания суперовуляции применяли стандартную схему, включающую внутримышечное введение гормонов ФСГ на 9-, 10-, 11-, 12-е сутки спонтанного эстрального цикла в дозах 12, 8, 4, 4 мг/гол/сут и простагландина магэстрофана - 4 мл/гол внутримышечно однократно, на 12-е сутки. Второй и третьей группам коров-доноров дополнительно к стандартной схеме вводили тимоген 0,01% раствор внутримышечно соответственно на 1-5-е и 5-10-е сутки спонтанного полового цикла в дозе 20 мл/гол/сут.
Исследования гормонального фона в крови коров-доноров перед обработкой ФСГ, и F2a по стандартной схеме индукции суперовуляции и с применением препарата тимоген представлены в таблице 12.
Показано, что уровень гормонов изначально соответствовал физиологически нормальным показателям. У коров-доноров 1-й (контроль) группы, где отмечена высокая суперовуляция, уровень прогестерона находился в пределах 4,8±0,29 нг/мл. Эта концентрация была также и у коров с невысокой суперовуляцией. Концентрация эстрадиола-17 была на 18,1% больше, чем у коров с невысокой суперовуляцией. В то же время уровень ЛГ был больше у коров-доноров с высокой степенью суперовуляции. Превышение ЛГ по отношению к животным с невысокой суперовуляцией составило в 2,7 раза.
У коров-доноров 2-й группы, где к основной схеме вызывания суперовуляции дополнительно вводили тимоген с 1-х по 5-е сутки полового цикла, было отмечено, что содержание прогестерона на 9-е сутки полового цикла у коров с высокой суперовуляцией повысилось до 6,0±0,30 нг/мл. Превышение от коров-доноров 1-й (контроль) группы было на 25,0%. Такой уровень прогестерона (5,9±0,41 нг/мл) оставался и у животных с невысокой степенью суперовуляции. Концентрация эстрадиола была одинаковой у коров-доноров с разной степенью суперовуляции (в пределах 18,2±1,90– 18,0±2,10 пг/мл). Содержание ЛГ у коров с высокой суперовуляцией превышало уровень гормона у животных с невысокой степенью суперовуляции в 1,6 раза. Это соотношение гормона было на 40,0% меньше, чем у коров-доноров 1-й (контроль) группы. У коров-доноров 3-й группы, где к основной схеме вызывания суперовуляции добавляли введение тимогена на 5-е – 9-е сутки полового цикла, уровень прогестерона на 9-е сутки был равен у коров с высокой суперовуляцией 4,3±1,01 нг/мл, а с невысокой – 4,1±0,67 нг/мл. Этот уровень практически соответствовал показателям у коров 1-й (контроль) группы, но был ниже от значений у коров 2-й группы соответственно на 28,4% и 30,6%. Концентрация эстрадиола-17 также мало отличалась от показателей этого гормона в 1-й (контроль) группе, где уровень эстрадиола был больше у животных с низким уровнем суперовуляции. Содержание ЛГ в зависимости от количества овулировавших фолликулов практически не отличалось друг от друга и составило 4,0±3,78 и 3,9±2,98 нг/мл. После гормональной индукции суперовуляции в момент наступления индуцированной половой охоты у коров-доноров 1-й (контроль) группы в обоих вариантах суперовуляции отмечен низкий уровень прогестерона, составляющий 1,0-1,2 нг/мл, что в среднем в 4,4 раза меньше, чем в 1-й (контроль) группе после спонтанной охоты (на 9-е сутки полового цикла).
Концентрация эстрадиола-17 наоборот повысилась по отношению к значениям в 1- й группе (9-е сутки) в среднем в 2,4 раза. При этом содержание ЛГ было повышенным в среднем в 18 раз по отношению к показателям в 1-й (контроль) группе на 9-е сутки полового цикла. Полученные результаты соответствуют данным многочисленных исследований, где отмечено, что в момент половой охоты у животных значительно повышается содержание эстрадиола-17 и ЛГ, а уровень прогестерона должен максимально снижаться. У коров-доноров 2-й группы в период индуцированной половой охоты было отмечено снижение прогестерона в 7,5 раз при реакции суперовуляцией 8-12 фолликулов и в 6,5 раз при реакции 4-6 фолликулов, по сравнению с показателями 2-й группы на 9-е сутки полового цикла. Уровень эстрадиола-17 был практически одинаков при разной реакции суперовуляции в яичниках и превышал в среднем показатели на 9-е сутки в 3,2 раза. Это превышение было на 25,0 % больше, чем у коров этой группы на 9-е сутки полового цикла. Содержание ЛГ также в этот период было наиболее высоким и превышало показатели в контрольной группе в среднем на 17,4 %. У коров-доноров 3-й группы в период наступления индуцированной половой охоты содержание прогестерона составило 1,2±0,44 нг/мл при количестве желтых тел 8-12 и 1,5±0,84 нг/мл при 4-6 желтых телах в яичниках. Эти показатели суммарно на 58,8 % больше, чем у животных 2-й группы и на 22,7 % больше, чем в контроле. Концентрация эстрадиола-17 суммарно была ниже от уровня во 2-й группе на 36,8 % и 1-й (контроль) группы – 16,3 %. Уровень ЛГ также был минимальным и в среднем был меньше этого показателя во 2-й группе на 19,7% и 1- й (контроль) группы – 5,7 %.
Таким образом, полученные данные о гормональных изменениях в крови обработанных доноров позволяют сделать предварительное заключение о том, что курс инъекций тимомиметиков в 1-5 день полового цикла - наиболее подходящий режим введения тимических факторов коровам-донорам с целью подготовки их к индукции суперовуляции.
Фронтальный метод гормональной обработки коров-доноров с целью подготовки и проведения процедуры индукции суперовуляции
На сегодняшний день основным источником эмбрионов являются коровы доноры с индуцированной суперовуляцией. Однако ни один из разработанных методов не является достаточно надежным для гарантированного получения оптимального числа качественных эмбрионов на взятого в обработку донора.
Исключительное значение для успешного индуцирования суперовуляции являются сведения об индивидуальных временных параметрах полового цикла и его отдельных стадий, что определяется наличием в середине цикла желтого тела с оптимальной циторецепторной чувствительностью. Начало обработки коров доноров при наличии реакционноспособного желтого тела в одном из яичников, в определенной степени, предполагает оптимальную эмбриопродуктивность. С этой целью существующие инструкции рекомендуют использовать в качестве потенциальных доноров, только животных с нормальным чередованием (не менее двух последних) половых циклов, что определяет значительную трудоемкость (визуальное определение клинических признаков половой охоты) и временных затрат. Альтернативным методом является индуцирование половой охоты у потенциальных доноров и вызывание суперовуляции в индуцированный цикл.
Однако современные методы вызывания половой охоты не отличаются достаточной стабильностью и могут негативно сказываться на эмбриопродуктивности доноров. Разработанная нами технология позволяет нивелировать вышеперечисленные недостатки при гарантированном получении высоких показателей суперовуляции и выхода качественных эмбрионов. Обработки проводили на здоровых животных фронтально, вне зависимости от дня полового цикла. Режим введения гормональных и профилактических препаратов представлен в таблице 18.
Введение препарата сурфагон аргументировано необходимостью лютеинизации фолликулов (не зависимо от стадии роста), неизбежно присутствующих у определенной части животных, взятых в обработку. При этом инъекция препарата сурфагон, при наличии желтого тела не зависимо от стадии его роста и не зависимо от наличия одновременно присутствующего фолликула, приводит к потенцированию его циторецепторной чувствительности. Таким образом, у всех взятых в обработку животных введение препарата сурфагон вызывает образование и развитие лютеальной ткани с оптимальной циторецепторной чувствительностью. Если учесть дополнительный аспект, что при фронтальной обработке большой группы потенциальных коров-доноров, как правило, оказываются животные с персистирующими фолликулами или персистентными желтыми телами [168], с учётом проблематичности дифференциальной диагностики, то инъекция препарата сурфагон оказывает позитивное действие, в смысле нормализации интраовариальных процессов.
Гестагенизация (так называемый прогестагеновый блок), интегрированная в предлагаемый режим обработок, блокирует на десять дней функциональную активность гипоталамо-гипофизарной системы, а, следовательно, и интенсивность интраовариальных процессов. За это время происходит полная нормализация возможных морфофункциональных овариальных нарушений [132]. В это же время в результате утероинфузии эндотила-форте происходит нормализация эндометральных нарушений, которые возможны у части взятых в обработку животных. Таким образом, на десятый день у всех обработанных животных в одном из яичников будет хорошо выраженное желтое тело с оптимальной циторецепторной чувствительностью, аналогичной ситуации спонтанного цикла у здоровых коров при гарантированном отсутствии морфофункциональных нарушений органов репродуктивной системы.
На современном этапе развития технологии получения и трансплантации эмбрионов все предлагаемые режимы введения биорегуляторов с целью индуцирования суперовуляции включают в себя сывороточные и гипофизарные гонадотропины. При этом общепризнано, что использование гипофизарных гонадотропинов имеет ряд преимуществ, в том числе и относительно эффективности. Однако при использовании гипофизарных гонадотропинов имеется ряд недостатков, обусловленных быстрым распадом их в организме [95,149,162]. Данное обстоятельство диктует многократное введение дозированных количеств гонадотропинов с равными интервалами (12 часов) в течение 4-5 дней. Многоразовое введение не только трудоемко, но и является источником стресса у животных[95,149,162]. Кроме того, увеличивается вероятность ошибок в случаях работы с большим количеством животных.
Нивелировать данные негативные аспекты позволяет возможность введения пролонгированной формы гипофизарного гонадотропина, ограниченная однократной подкожной инъекцией полной дозы препарата. Возможность пролонгации осуществляется разведением препарата в 7,5 мл физраствора с добавлением 0,9 г поливинилового спирта. При этом эмбриопродуктивность, как правило, не снижается, а даже увеличивается [11].
Известно, что овуляция большого числа индуцированных к росту фолликулов может растягиваться по времени до 60 и более часов, что диктует необходимость проведения трёхкратной процедуры осеменения, в результате чего извлекаемые эмбрионы находятся на разных стадиях развития и создаются условия, при которых увеличивается количество некачественных эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток.
Таким образом, предлагаемая нами интеграция в режим обработок инъекции препарата сурфагон, за 12 часов до начала охоты, может приводить к унификации времени овуляции фолликулов в пределах 24-36 часов. При этом большинство извлеченных эмбрионов должны находиться на близких стадиях развития, при одновременном снижении числа некачественных эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток, а число осеменений может снижаться до двух.
В наших исследованиях проводились стимуляция полиовуляции и получение эмбрионов. Согласно разработанному способу, предлагаемому режиму введения индукторов и терапевтических препаратов была проведена групповая обработка животных, и последующее вымывание эмбрионов и определение характеристик, полученных эмбриосборов, где в количестве коров-доноров было отобрано 98 голов трех пород: Симментальская – 26; Джерсейская – 29; Голштинская черно-пестрая – 43 головы. Результаты представлены в таблице 19.