Введение к работе
Актуальность темы. Разработіса ноеых способов утилизации органического комплекса возобновляемого растительного сырья в целях получения продуктов микробиологического синтеза является одной из наиболее важных задач биотехнологии (Dekker et.al., 1979; Кузнецов и др., 1992). В этом отношении несомненный интерес представляет биоконверсия .богатой D-ксиловой гемицеллшгоэы в этиловый спирт и ксилит. В настоящее время микробиологическим способом производят только этанол путем сбраживания гексоз. По оценкам зарубежных экспертов уже в ближайшем будущем микробиологический способ получения ксилита и этанола из Сахаров лигноцеллюлозы будет конкурентноспособен альтернативным химическим методам производства этих продуктов (Бойлс,'1987).
Среди микроорганизмов, ферментирующих D-ксилозу, приоритет как продуцентам ксішитз и этанола принадлежит дрожжам (Квасников, 1992; Ojamo, 1994). Однако, промышленные технологии получения данных продуктов с помощью дрожжей пока не созданы. Это обусловлено, прежде всего, недостаточной изученностью ферментных систем, участвующих в образовании этанола и ксилита, и чувствительностью биоконверсии D-ксилозы к многочисленным факторам, среди которых наиболее ощутимое влияние оказывает аэрация (Schneider, 1989). Поэтому исследование этапов катаболизма D-ксилозы, отвечающих за образование ксилита и этанола у дрожжей, и условий, способствующих их продукции, является актуальным, так как позволяет определить пути управления и оптимизации биоконверсии кси-лозосодержащих субстратов растительного происхождения.
Цели и задачи исследования. Исследование посеящєно выявлению причин образования дрожжами ксилита и этанола из D-ксилозы и поиску условий их продукции. В соответствии с этим необходимо было решить следующие задачи:
- провести сравнительное изучение способности ксилозо-ассимшшрующих дрожжей ферментировать D-ксилозу и D-глюкозу при ограниченной аэрации среды;
- определить активность, коферментную специфичность и чувствительность к условиям аэрации ферментов ксилозоредук-тазн и ксилитдегидрогеназы, контролирующих начгльные этапы превращения D-ксилозы;
установить зависимость ферментации D-ксилозы в ксилит и этанол от условий аэрации;
показать возможность повышения эффективности спиртовой ферментации ксилозосодержащих субстратов ( растительных гидролизатов и сульфитных щелоков).
Научная новизна. Среди ксилозоассимшшрующих дрожжей выявлено три группы, а именно: накапливающие в условиях ограниченной аэрации ксилит, этанол или одновременно ксилит и этанол. Впервые способность к продукции ксилита из D-ксилозы показана для дрожжей C.didensiae, C.silvanorurn, T.rnolis-hiama и Kl.fragilis.
Впервые показано, что наиболее высокой активностью ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы,. контролирующих начальные этапы превращения D-ксилозы, отличаются дрожжи, продуцирующие этанол. Выявлено, что ксилитдегндрогеназа у всех изученных наїли ксилозоассимшшрующих дрожжей строго специфична к НАД1--коферменту. Ксилозоредуктаза у одних культур специфична только к НАДФН-коферменту, а у других проявляет двойную коферментную специфичность к НЛДФН. и НАДН. Впервые показано, что способность дрожжей к продукции ксилита и этанола зависит от коферментной Специфичности ксилозоредуктазы, а причиной накопления ксилита может быть дисбаланс системы регенерации коферментов, возникающий в' условиях ограниченной аэрации.
Установленої что селективного накопления ксилита или этанола у дрожжей можно достичь путем ограничения аэрации среды, максимально разобщив образование этих , продуктов и рост культуры.
Впервые оценена способность кстшозоассшилирующих дрожжей ферментировать D-глюкозу в условиях ограниченной аэрации, что особенно важко в случае получения этанола из смешанных ксилозосодержащих субстратов.
Практическая значимость работы. Отобраны 4 культуры
ксшюзоаоспшлирующих дрожжей (С. intermedia, О. didensiae, C.parapsilosis, С.si 1 variorum), перспективныэ в качестве продуцентов ксилита.
Подобраны условия аэрации, обеспечивающие направленную конверсию D-ксилогы дрожжами Pa.tannophilus как в ксилит, так и в этанол. Показано, что двухстадийный способ проведения спиртовой ферментации D-ксилозы значительно интенсифицирует процесс брожения (увеличивает выход этанола,' повышает продуктивность и сокращаем время процесса). Параметры ферментации ксилозоассимилируюшими дрожжами субстратов, полученных на основе растительных гидролизатов и сульфитных щелоков, послужили исходными данными для проектирования опытной установки по получению этилового спирта из ксилозо-содержащего растительного сырья.
Связь темы с планом научных' работ." Настоящая работа является частью научных исследований, проводимых по программе "Биотехнология 2000" и развитием работ в соответствии С Госзаказом N 1891-6365-01 и Н 00536506Ш.
Апробация работы и публикации. Результаты исследований .были представлены наг международной конференции "Biotechnology St.-Petersburg--94" (С.-Петербург, 1994); VIII Европейской конференции "Biomass for energy, environment, agricultural and industry" (Вена, Австрия, 1994); I съезде BO-ГиС им. Н.А.Вавилова (Саратов, 1994); VI международной конференции "Biotechnology in the pulp and paper industry" (Вена, Австрия, 1995). По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объем и построение работы. Диссертация состоит из введения, шести глав (обзор литературы, материалы и методы, три главы результатов исследований, обсуждение) и выводов общим объемом 146 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 11 рисунками, 17 таблицами. Список цитируемой литературы содержит наименований 178 наименований.