Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время во многих отраслях народного хозяйства широко используются биологически активные вещества, получаемые в результате жизнедеятельности широкого круга организмов-продуцентов: микроорганизмов различных таксономических групп, перевиваемых культур клеток животных и растений.
Процессы производства биологически активных' веществ многостадийны, однако несмотря на разнообразие технологических схем производств, начальными этапами являются: проверка исходных свойств продуцента, подготовка посевного материала к культивированию.
Конечный результат производства в значительной степени 'зависит от исходных свойств продуцента, качества посевного материала. Таким образом одна из самых важных проблем при создании произ-зодств различных биопродуктов - создание запасов посевного материала, сохранившего основные биологические свойства продуцента. Эта проблема может быть решена за счет разработки способов хране-шя посевного материала в течение длительного времени.
Единственным надежным способом сохранения клеточных культур в речение длительного времени является криоконсервирование - хране-ше при низких температурах. Наиболее распространенным способом фиоконсервирования является хранение клеток в жидком азоте при гемпературе -196 С.
Вопросам криоповреждений и криозащиты клеток посвящена обшир-іая литература. Теоретический аспект проблемы подробно рассмотрен ю многих публикациях. В то же время экспериментальные работы, гаевященные разработке методов криоконсервирования, часто имеют шлюстративный характер. Авторы ограничиваются тем, что приводят
- 4 -конкретный резким процесса для определенного биологического объек та, а вопросы о том, почему были выбраны именно такие услови криоконсервирования, оптимальны ли они, остаются в стороне. Де монстрируется факт сам по себе, а систематическое исследование н проводится. Такие результаты, как правило, имеют незначительну практическую ценность и в теоретическом плане интереса н представляют.
На наш взгляд при проведении исследований, направленных н. разработку методики криоконсервирвоания клеточной культуры, сна чала .необходимо выявить основные факторы, определяющие конечны результат процесса, определить параметры самого процесса криокон сервирования, влияющие на эти основные факторы, а затем провеет: систематическое исследование зависимости результатов криоконсервирования от выбранных параметров.
Существенным условием бесперебойной работы биотехнологическоп производства является постоянное обеспечение посевными культурам со стандартными свойствами в больших объемах. Для этих целей ні производстве применяются специальные посевные аппараты. Перио, разгонки и восстановления процесса при проростах и других аварийных состояниях занимает длительный период времени.
В литературе данный вопрос не нашел должного отражения. Поэтому важно было разработать такие методы криоконсервирования, которые позволили бы устранить данный недостаток.
Цели исследования:
Цели диссертационной работы - разработка методики криоконсервирования клеточных культур ВНК-21 и Vero при температуре -196" ( в контейнерах объемом до 500 мл; разработка методик криоконсервирования клеточных культур ВНК-21, Vero и продуцента тилозин;
- 5 -Streptomyces fradiae при температуре -70 С.
Задачи работы:
изучить зависимость сохранности клеток от параметров процесса криоконсервирования: режима замораживания, вида и концентрации криопротектора, плотности клеточной суспензии, формы и объема контейнера для замораживания, продолжительности хранения клеток при низких температурах;
изучить влияние криоконсервирования на ростовые свойства и морфофункцжжальные показатели клеток;
изучить влияние криоконсервирования на чувствительность культуры клеток ВНК-21 к действию вирусов;
- изучить влияние криоконсервирования на способность Streptomyces fradiae к антибиотикообразованию при культивировании в лабораторных и промышленных аппаратах.
Научная новизна. Проведено систематическое исследованеие зависимости сохранности биоматериала от параметров процесса криоконсервирования. В результате была разработана методика криоконсервирования клеточных культур ВНК -21 и Vero в контейнерах объемом от 10 до 500 мл. Это позволяет проводить засев ферментационных аппаратов непосредственно из контейнера без предварительной наработки биомассы в культивационных сосудах малых объемов.
Впервые показана возможность криоконсервирования клеток ВНК-21 и Vero при температуре -196С без изменения жизнеспособности и ростовых свойств, а для культуры ВНК-21 - без снижения чувствительности к действию вирусов.
Показана возможность криоконсервирования и хранения в течение длительного времени клеток ВНК-21 и Vero при температуре -70 С.
Впервые показана возможность криоконсервирования штамма Streptomyces fradiae 25А при температуре -70С, позволяющая сохранять штамм в течение длительного времени без снижения способности к антибиотикообразованию.
Практическое значение работы.
Разработанные методики криоконсервирования позволяют создавать запас посевного материала культур ВНК-21, Vero и Streptomyces fradiae в условиях лаборатории и производства.
Весьма важной в практическом плане является разработанная методика криоконсервирования концентрированных клеточных суспензий в контейнерах объемом 500 мл: технологическая схема наработки биомассы клеток путем последовательных пересевов в культивационные сосуды и аппараты возрастающих объемов, позволяющая из ампулы с посевным материалом получить биомассу клеток для засева аппарата объемом 630 л, требует для реализации около 2 месяцев. В то же время при засеве аппарата непосредственно из контейнера срок разворачивания производства сокращается до 3 суток.
Разработанная методика криоконсервирования клеток при температуре -70С отличается простотой реализации и может быть применена в условиях лаборатории и производства без использования в качестве хладоагента жидкого азота.
Предложенная методика криоконсервирования штамма Streptomyces fradiae 25А позволяет получить посевной материал, в полной мере сохранивший способность к антибиотикообразованию и пригодный для засева лабораторных и промышленных аппаратов.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на общеотраслевой конференции молодых ученых
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 печатные
работы.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
Работа изложена на f53 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 рисунками и 23 таблицами. Список цитируемой литературы включает 237 наименований, из них 112 на русском языке.