Введение к работе
Актуальность работы. Одним из путей совершенствования лекарственных средств, имеющихся в арсенале современной медицины, является использование для создания фармакологических препаратов новых, ранее не использовавшихся групп биологически активных веществ. К числу таких веществ можно отнести ростовые факторы. К ростовым факторам традиционно относят вещества пептидной или гликопротеидной природы, вырабатываемые в организме и способные в наномолярных концентрациях опосредованно за счет их связывания со специфическими рецепторами, расположенными на поверхности клеточных мембран, стимулировать синтез ДНК и пролиферацию клеток. Ростовые факторы участвуют в таких процессах, как эмбрио- и онтогенез, регенерация, иммунный ответ. Открытия последнего десятилетия значительно расширили представления о роли этих биологически активных веществ в развитии многих патологий, например, воспалительных и шоковых реакциях, дистрофических процессах, онкологических заболеваниях, склеродермии, остеопорозах и многих других. Такой широкий диапазон биологических эффектов определяет и большой интерес к ним как к основе для создания новых фармакологических препаратов.
Однако следует отметить, что до сих пор лекарственные средства на основе ростовых факторов не вошли в широкую медицинскую практику. Основной причиной такого положения является крайне низкое содержание этих веществ в биологических тканях и жидкостях, составляющее обычно мкг/г ткани, что делает нерентабельным выделение и очистку ростовых факторов из биологического материала, а, следовательно, и разработку на их основе лекарственных препаратов. Только с созданием рекомбинантных штаммов микроорганизмов, способных синтезировать ростовые факторы, появилась возможность получения этих пептидов в количествах, необходимых для проведения доклинических и клинических испытаний.
Одним из таких ростовых факторов является эпидермальный фактор роста (ЭФР) - видоспецифичный пептид с молекулярной массой около 6 кДа. В многочисленных экспериментальных работах показана способность ЭФР стимулировать регенерацию эпителиальных клеток, заживление язв желудка и двенадцатиперстной кишки, восстановление поврежденной роговицы глаз, что позволяет предполагать возможность его широкого использования в медицине. Кроме того, в последние годы в нашей стране получены перспективные рекомбинантные штаммы, в том числе на основе непатогенных микроорганизмов - дрожжей Saccharomyces cerevisiae, способные синтезировать ростовой фактор человека (чЭФР) и секретировать его в культуральную жидкость. Однако для получения чЭФР необходимо было разработать новые технологии, обеспечивающие сохранение секретирующей способности штаммов-продуцентов и включающие оригинальные методы выделения, очистки, контроля и стандартизации ростового фактора, в том числе с использованием биотест-систем. До сих пор подобной технологии получения ЭФР, а также лекарственных и диагностических средств на его основе с использованием указанных рекомбинантных штаммов разработано не было. Это направление является актуальным также в связи с тем, что позволяет создать комплексную технологию переработки микроорганизмов за счёт выделения ростового фактора из культуральной жидкости и других биологически активных веществ из отработанной биомассы.
В связи с этим целью настоящей диссертационной работы являлось изучение биологических особенностей рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae - продуцентов эпидермального фактора роста и разработка научно-методических основ комплексной технологии получения чЭФР и других биологически активных веществ, перспективных для медицинской практики.
В задачи настоящего исследования вошли:
1.Разработка методологии отбора наиболее перспективных дрожжевых штаммов-продуцентов и способов их консервации, обеспечивающих сохранение жизнеспособности и специфической секретирующей активности микроорганизмов.
2.Исследование возможностей экзогенной регуляции рекомбинаитных штаммов Saccharomyces cerevisiae и выбор параметров, позволяющих оптимизировать условия культивирования и увеличить продуктивность микроорганизмов.
3.Разработка методов выделения, очистки и стандартизации эпидер-мального фактора роста из культуральной жидкости рекомбинаитных штаммов Saccharomyces cerevisiae.
4.Разработка способов комплексной переработки рекомбинаитных штаммов дрожжей за счет выделения чЭФР из культуральной жидкости и биологически активных веществ из отработанной биомассы, а также использования отходов биотехнологического процесса в качестве компонентов питательных сред.
5.Конструирование эритроцитарных диагностических тест-систем, позволяющих определять ростовой фактор в культуральной жидкости на различных этапах процесса получения чЭФР.
6.Разработка и апробация биотест-системы для изучения действия ЭФР на процессы метаболизма клеток животных и человека.
7.Изучение возможности получения готовой лекарственной формы на основе чЭФР (глазные капли) в качестве средства, избирательно стимулирующего процессы регенерации.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. На основании изучения биологических особенностей рекомбинаитных штаммов Saccharomyces cerevisiae - продуцентов чЭФР, применения ори-
гинальных методов выделения, очистки и стандартизации, контроля эффективности биотехнологического процесса с помощью диагностикумов и биотест-систем, разработаны научно-методические основы комплексной технологии получения чЭФР и других БАВ, обеспечивающей возможность создания лекарственных и диагностических средств нового поколения с использованием эпидермального фактора роста человека.
-
Предложенная методология отбора рекомбинантных штаммов, способы консервации и экзогенной регуляции позволяют выбрать наиболее перспективные продуценты чЭФР, оптимизировать условия культивирования и сохранять специфическую секретирующую активность микроорганизмов.
-
Разработанные методы выделения, очистки и стандартизации чЭФР дают возможность получения биологически активного пептида в высокоочи-щенном состоянии в количествах, необходимых для создания на его основе лекарственных и диагностических препаратов.
-
Сконструированные диагностические эритроцитарные антигенные и антительные тест-системы с различной чувствительностью позволяют контролировать содержание чЭФР на всех этапах биотехнологического процесса получения ростового фактора и создают условия для определения пептида в биологических жидкостях.
-
Предложенная биотест-система с использованием клеток эпидермиса, дает возможность изучать влияние эпидермального фактора роста на процессы клеточного метаболизма и прогнозировать некоторые свойства лекарственных препаратов на основе ЭФР.
-
Разработанная технология получения, состав и условия применения содержащих ростовой фактор глазных капель, обладающих терапевтическим эффектом при деэпителизации роговицы глаз, определяют методические подходы создания лекарственных средств с ранозаживляющими свойствами.
7. Комплексная технология одновременного выделения чЭФР из куль-туралыюй жидкости, иммуномодулирующих полисахаридных препаратов и РНК из биомассы дрожжевых клеток, а также использование побочных продуктов в качестве компонентов питательных сред, обеспечивает снижение отходов и увеличение эффективности процесса получения БАВ.
Научная новизна. В работе впервые изучены биологические свойства отечественных рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae - продуцентов эпидермального фактора роста человека, исследованы возможности экзогенной биорегуляции микроорганизмов, на основании чего предложен состав питательной среды и условия культивирования, обеспечивающие значительное увеличение скорости роста микроорганизмов и их продуктивности.
Разработан оригинальный иммунохимический метод выделения и очистки ростового фактора с использованием поликлональных антител, позволивший повысить выход целевого продукта с чистотой не менее 99% (Патент РФ № 2108343).
Предложена новая модификация способа получения иммуномодулирующих полисахаридов из отработанной биомассы дрожжевых клеток, обеспечившая увеличение их биологической активности. Изучена и доказана возможность использования отходов, образующихся на различных этапах выделения и очистки биологически активных веществ из культуральной жидкости и дрожжевых клеток, в качестве компонентов питательных сред.
На основании результатов проведенного* исследования впервые разработана комплексная технология получения биологически активных веществ с использованием отечественных рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae.
Разработана биотест-система на клеточном уровне, позволившая провести изучение действия эпидермального фактора роста на процессы метабо-
лизма эпидермальных клеток, что дало возможность приступить к созданию лекарственных средств, обладающих ранозаживляющим действием.
Практическая значимость. Разработана комплексная технология получения биологически активных веществ на основе оптимизации условий хранения и культивирования рекомбинантных штаммов S. cerevisiae, применения оригинальных методов выделения, очистки и стандартизации БАВ, позволяющая выделять чЭФР, иммуномодулирующие полисахариды, РНК, компоненты питательных сред в препаративных количествах. Это, в свою очередь, обеспечивает возможность создания новых лекарственных препаратов на основе ростового фактора, обладающих ранозаживляющими свойствами. В частности, разработан состав и технология получения глазных капель, содержащих ЭФР и проявляющих терапевтическую активность при хирургической деэпителизации роговицы глаз.
Сконструированы эритроцитарные диагностические тест-системы с различной чувствительностью, дающие возможность определять ростовой фактор в культуральной жидкости в процессе культивирования дрожжей, а также в биологических жидкостях, что может быть использовано для целей практической медицины.
Предложенная технология может быть адаптирована для получения других веществ пептидной природы с использованием рекомбинантных штаммов.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на конференции "Количественные методы в изучении морфогенеза и регенерации" г. Иваново, 1984 г.; 2-ом симпозиуме "Неинвазивные методы диагностики" г. Москва, 1995 г.; на 2-ом съезде Российского биохимического общества г.Москва 1997г.; конференциях "Биомедицинские технологии", РАМН, ММА им. И.М.Сеченова, РУДН, г.Москва в 1994,1995,1996, 1998 гг.; Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", г.Москва, 1999 г.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа и получен один патент РФ на изобретение.
Объем и структура работы. Структура диссертации традиционна и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, главу, содержащую описание материалов и методов исследования, 4 главы собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы и список литературы, содержащий 465 наименований, из которых 354 на иностранных языках. Диссертация содержит 46 рисунков, 29 таблиц и 1 схему.