Содержание к диссертации
Введение
1. Список сокращений 5
2. Введение 7
3. Обзор литературы. Наночастицы как адъюванты
3.1. Введение. Классификация адъювантов по механизму их действия 9
3.2. Эмульсии 12
3.2.1. Коммерческие адъювантные препараты на основе эмульсий 13
3.2.1.1. Адъюванты на основе эмульсий «вода в масле» 13
3.2.1.2. Адъюванты на основе эмульсий «масло в воде» 3.3. Липосомыи виросомы 16
3.4. Сапонины и ИСКОМЫ 19
3.5. Полимерные наночастицы 22
3.6. Неорганические наночастицы 24
3.7. Влияние размеров частиц адъювантов на свойства вакцин 25
3.8. Заключение 30
4. Обсуждение результатов 31
4.1. Введение 31
4.2. Методы исследования 32
4.3. Получение наночастиц из природных соединений 33
4.3.1. Получение наночастиц на основе тритерпеноидов бересты 33
4.3.1.1. Характеристика наночастиц из тритерпеноидов бересты 33
4.3.1.2. САНЧ из СТБ с мирамистином и олеиновой кислотой 34
4.3.1.3. Влияние кофеата бетулина на формирование САНЧ и их стабильность 38
4.3.1.4. Стадии формирования сферических аморфных наночастиц
4.3.2. Получение наночастиц на основе дигидрокверцетина 43
4.3.3. Получение наночастиц на основе гликосфинголипидов 44
4.4. Исследование биологических свойств наночастиц 47
4.4.1. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови: клетками, белками и метаболитами 47
4.4.1.1. Взаимодействие САНЧ с клетками крови 47
4.4.1.2. Взаимодействие САНЧ с белками крови
4.4.1.3. Взаимодействие САНЧ с билирубином 52
4.4.2. Исследование адъювантных свойств наночастиц 54
4.4.2.1. Экспериментальные вакцины против гепатита В 54
4.4.2.2. Экспериментальные вакцины против вируса гриппа 56
4.4.3. Исследование токсичности НЧ in vitro 59
4.4.3.1. МТТ-тест 60
4.4.3.2. Окрашивание трипановым синим 64
4.4.3.3. Оценка цитотоксичности с использованием проточной цитометрии 67
4.4.3.4. Выявление окислительного стресса 69
4.4.3.5. Оценка гемолитической активности 71
4.5. Разработка и испытание экспериментальных установок для получения сферических
аморфных наночастиц 72 4.5.1. Установки для получения САНЧ из СТБ 72
4.5.2. Разработка методов контроля 4.5.2.1. Определение концентрации САНЧ в дисперсиях 77
4.5.2.2. Определение концентрации ТГФ в дисперсиях САНЧ 78
4.5.3. Подбор криопротектора для лиофилизации САНЧ из СТБ 79
5. Экспериментальная часть 81
5.1. Материалы и методы 81
5.2. Получение наночастиц из природных соединений 83
5.2.1. Получение НЧ на основе тритерпеноидов бересты 83
5.2.1.1. САНЧ без модификатора по «стандартной» методике 83
5.2.1.2. САНЧ с модификатором (олеиновой кислотой или мирамистином) 83
5.2.1.3. САНЧ из СТБ, меченные 3-метоксибензантроном 84
5.2.1.4. Влияние рН среды на формирование САНЧ 84
5.2.1.5. Влияние состава СТБ на формирование САНЧ 85
5.2.1.6. Стадии формирования САНЧ 86
5.2.2. Получение НЧ на основе ДГК
5.2.2.1. Дисперсии дигидрокверцетина 86
5.2.2.2. Дисперсии ДГК с мирамистином 86
5.2.3. Получение НЧ на основе ГСфЛ и мирамистина 87
5.2.3.1. Методика определения «зоны эквивалентности» 87
5.2.3.2. Отработка способа и порядка прибавления компонентов дисперсии 87
5.2.3.3. НЧ из ГСфЛ и мирамистина 88
5.2.3.4. НЧ из ГСфЛ и мирамистина с добавлением ДГК
5.3. Образцы для биологических испытаний адъювантной активности 88
5.4. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови
5.4.1. Взаимодействие САНЧ с клетками крови 89
5.4.2. Взаимодействие САНЧ с белками крови 90
5.4.3. Взаимодействие САНЧ с билирубином 91
5.5. Культивирование клеток 92
5.5.1. HeLa 92
5.5.2. Jurkat 92
5.6. Токсикологические исследования наночастиц in vitro 92
5.6.1. Оценка цитотоксичности наночастиц с помощью МТТ-теста 92
5.6.1.1. Использование адгезионной культуры клеток линии HeLa 92
5.6.1.2. Использование суспензионной культуры клеток линии Jurkat
5.6.2. Оценка жизнеспособности клеток методом окрашивания трипановым синим 93
5.6.3. Оценка цитотоксичности дисперсий с помощью цитофлуориметрии
5.6.3.1. Окрашивание клеток пропидий йодидом 94
5.6.3.2. Окрашивание клеток флуоресцеин диацетатом
5.6.4. Выявление окислительного стресса 95
5.6.5. Оценка гемолитической активности наночастиц 96
5.7. Разработка экспериментальных установок для получения САНЧ. Методы получения
САНЧ отличные от «стандартной» методики 96
5.7.1. Установка с дроссельным элементом смешения 96
5.7.2. Смеситель закрытого типа с мешалкой 97
5.7.3. Ультрафильтрация 97
5.7.4. Получение САНЧ многоступенчатым методом 97
5.8. Разработка методов контроля 98 5.8.1. Определение концентрации САНЧ в дисперсиях 98
5.8.2. Определение концентрации ТГФ в дисперсиях САНЧ 98
5.9. Подбор криопротектора для лиофилизации САНЧ 99
6. Выводы 100
7. Благодарности 102
8. Список литературы 103
- Адъюванты на основе эмульсий «вода в масле»
- Получение наночастиц из природных соединений
- Получение НЧ на основе тритерпеноидов бересты
- Окрашивание клеток флуоресцеин диацетатом
Введение к работе
Актуальность проблемы
Разработка новых классов адъювантов является перспективным направлением современной иммунобиологии. За последние десятилетия произошли значительные изменения в технологии производства вакцинных препаратов. В результате многие вакцины, которые проходят в настоящее время клинические испытания, значительно отличаются от традиционных вакцин. Это касается, прежде всего, перехода от цельновирионных и субъединичных вакцин к рекомбинантным вакцинам на основе очищенных белков, что послужило причиной поиска новых адъювантов.
Адъюванты — это вещества, компоненты вакцин, усиливающие иммунный ответ. Воздействие адъювантов на иммунный ответ в основном обусловлено двумя их свойствами: способностью удерживать антиген в том месте, где он экспонируется лимфоцитам (эффект «депо») и способностью вызывать синтез цитокинов, регулирующих лимфоцитарные функции. Таким образом, адъюванты способны не только вызывать мощный иммунный ответ на различные антигены, но и эффективно управлять им, избирательно воздействуя на лимфоциты ТЫ (клеточный иммунный ответ), Th2 (гуморальный иммунный ответ), цитотоксический Т-клеточный ответ, а также неспецифический иммунитет. Использование адъювантов позволяет уменьшить дозу антигена в вакцине, увеличить иммуногенность «слабых» антигенов, предотвращать конкуренцию антигенов в комбинированных вакцинах, увеличивать скорость развития и продолжительность иммунного ответа у привитых, индуцировать защитные свойства слизистых оболочек, а также увеличивать силу иммунного ответа у детей и лиц пожилого возраста.
Наночастицы (НЧ) в настоящее время рассматриваются как самые перспективные адъюванты. Одной из причин использования НЧ в качестве адъювантов является тот известный факт, что они эффективно поглощаются антигенпредставляющими клетками. Таким образом, если с НЧ связать антиген, то он будет направленно поглощаться макрофагами, что приведет к усилению иммунного ответа.
В настоящее время в качестве адъювантов исследуется целый ряд НЧ: липосомы, виросомы, ниосомы, иммуностимулирующие комплексы, эмульсии, полимерные наносферы, вирусоподобные частицы и др.
На кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова проводятся исследования сферических аморфных наночастиц (САНЧ) из смеси тритерпеноидов бересты (СТБ). В частности, было показано, что САНЧ могут быть использованы в качестве носителей для инкапсуляции гидрофобных лекарственных субстанций, таких как доксорубицин, силимарин, силибинин, метилфеофорбид
1 Список сокращений: ГСфЛ - гликосфинголипиды, ДГК - дигидрокверцетин, НЧ - наночастица, ПДК -
предельно допустимая концентрация, САНЧ - сферические аморфные наночастицы, СГТ - средняя геометрическая титра, СТБ - смесь тритерпеноидов бересты лупанового ряда, ТГФ - тетрагидрофуран, яФХ -яичный фосфатидилхолин, HBsAg - поверхностный антиген гепатита В.
(В. В. Красильникова, 2009). Также в САНЧ включали гидрофобную противотуберкулезную субстанцию рифабутин.
Эти САНЧ, с одной стороны, имеют размер (100-200 нм), характерный для большинства НЧ, исследуемых в качестве адъювантов, с другой стороны, обладают отрицательным зарядом (дзета-потенциал САНЧ -32 мВ). Заряженные НЧ представляют особый интерес, поскольку эффективность НЧ как адъювантов во многом определяется эффективностью связывания с белком-антигеном, а основными взаимодействиями, наряду с гидрофобными, являются электростатические. В связи с этим актуальным являлось исследовать адъювантные свойства САНЧ из СТБ.
Также были исследованы адъювантные свойства НЧ, полученных из дигидрокверцетина (ДГК) и гликосфинголипидов (ГСфЛ).
Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-18-356 «Конструирование композитных субмикронных частиц с улучшенной фармакокинетикой», а также в рамках госбюджетной темы 2Б-39-356, аналитической ведомственной программы Министерства образования науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы, 2009-2011 гг.» (проекты № 2.1.1/2715 и 2.1.1/9349) и гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-3468.2010.4).
Цель настоящего исследования
Получение наночастиц, обладающих адъювантными свойствами, на основе тритерпеноидов бересты, дигидрокверцетина и гликосфинголипидов.
Задачи исследования
1. Получение наночастиц из природных соединений.
1.1. Получение НЧ на основе тритерпеноидов бересты.
1.1.1. Влияние кофеата бетулина на формирование сферических аморфных наночастиц и их стабильность; стадии формирования САНЧ.
Получение НЧ на основе дигидрокверцетина.
Получение НЧ на основе гликосфинголипидов.
2. Исследование биологических свойств НЧ.
2.1. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови: клетками, белками и
метаболитами.
2.2. Исследование адъювантных свойств НЧ.
Экспериментальные вакцины против гепатита В.
Экспериментальные вакцины против вируса гриппа.
2.3. Исследование токсичности НЧ in vitro.
3. Разработка и испытание экспериментальных установок для получения САНЧ.
Установки для получения САНЧ из СТБ.
Разработка методов контроля.
3.2.1. Определение концентрации САНЧ в дисперсиях.
3.2.2. Определение концентрации ТГФ в дисперсиях САНЧ.
3.3. Подбор криопротектора для лиофилизации САНЧ из СТБ.
Научная новизна работы
Разработаны методы получения НЧ на основе гликосфинголипидов и дигидрокверцетина. Продемонстрирована ключевая роль кофеата бетулина в стабилизации дисперсий САНЧ, определены стадии формирования таких НЧ. Получены данные о взаимодействии САНЧ из тритерпеноидов бересты с белками и клетками крови. Показано, что САНЧ в концентрациях до 55 мкг/мл практически не взаимодействуют с эритроцитами, но ассоциируются почти со 100% клеток иммунной системы (гранулоциты, лимфоциты, моноциты). Выявлены основные белки плазмы крови, которые адсорбируются на САНЧ: альбумин, ApoA-IV, АроЕ, IgG. Биологические испытания на сплит-вакцине вируса гриппа H5N1 и поверхностном антигене гепатита В (HBsAg) показали, что разработанные адъюванты на основе НЧ из СТБ гораздо эффективнее гидроксида алюминия, используемого в настоящее время. Исследована токсичность САНЧ на клеточных линиях HeLa и Jurkat, показано, что дисперсии САНЧ не токсичны вплоть до концентрации 512 мкг/мл; токсичность НЧ на основе ГСфЛ на порядок выше.
Практическая значимость работы
Разработанные методы получения НЧ могут быть использованы для других соединений.
Биологические испытания выявили эффективные НЧ с точки зрения иммуногенности. Вакцины на основе расщепленного вируса гриппа птиц H5N1 А/Вьетнам/1194/2004 и рекомбинантного HBsAg с применением адъювантов на основе тритерпеноидов бересты проходят расширенные испытания на предприятиях «НПО «Микроген». Есть хорошие перспективы для расширения спектра антигенов на основе разработанных адъювантов.
Основные положения, выносимые на защиту
Методы получения НЧ на основе дигидрокверцетина, гликосфинголипидов и САНЧ, модифицированных олеиновой кислотой и мирамистином.
Влияние кофеата бетулина на формирование САНЧ и стабильность дисперсий. Выяснение стадий формирования САНЧ.
3. Биологические свойства нанодисперсий.
3.1. Взаимодействие САНЧ с компонентами крови: клетками, белками и
метаболитами.
Результаты биологических испытаний экспериментальных вакцин на основе расщепленного вируса гриппа птиц H5N1 и рекомбинантного HBsAg с применением разработанных адъювантов на основе НЧ.
Результаты оценки токсичности САНЧ из тритерпеноидов бересты и НЧ из ГСфЛ и мирамистина на клеточных линиях HeLa и Jurkat.
4. Разработка и испытание экспериментальных установок для получения САНЧ; методы определения концентрации СТБ и ТГФ в дисперсиях САНЧ. Подбор криопротектора для лиофилизации САНЧ из СТБ.
Публикации и апробация работы
По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезиса докладов на международных конференциях, 1 патент и заявка на получение патента РФ.
Результаты диссертации были доложены и представлены на международных научных конференциях: 15-й Международной выставке «Химия 2009» (Москва, 28 сентября - 2 октября 2009), V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта 2009), Международной научно-практической конференции «Биотехнология: Экология крупных городов» в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 15-17 марта 2010).
Структура и объем работы
Адъюванты на основе эмульсий «вода в масле»
Эмульсии могут быть трех типов: эмульсии типа «масло в воде», «вода в масле» и множественная эмульсия (типа в/м/в). К первому типу относятся такие адъюванты, как MF59, AS03, ко второму — адъювант Фрейнда, Montanide ISA-51 и др.
Эмульсии требуют высоких концентраций ПАВ. В качестве поверхностно-активных веществ могут использоваться различные соединения, способствующие улучшению солюбилизационного потенциала масла, например, такие как Твин 80, Pluronic Р84, додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия и др. [8].
В отличие от эмульсий «вода в масле», формирующих «депо» в месте инъекции, эмульсии «масло в воде» имеют свойство быстро распространяться по лимфатической системе. Тенденция не образовывать локальные «депо» уменьшает возможность возникновения хронического воспаления, разрушения тканей, осложнений в области введения антигена, что делает эти эмульсии более предпочтительными для использования в терапевтических вакцинах [9]. Адъювант MF59 состоит из 5% сквалена, 0.5% Твин 80 и 0.5% сорбитан триолеата (Span 85) [7].
Безопасность и иммуногенность MF59 в. качестве адъюванта вакцины против гриппа - FLUAD были подтверждены клиническими испытаниями, вследствие чего MF59 был лицензирован в Италии в 1997 г. (Novartis, Италия) и в ряде других стран [3, 10, 11]. Использование MF59 в качестве адъюванта вакцины против вируса гепатита В также подтверждено клиническими испытаниями, в которых было показано, что иммуногенность вакцины, содержащей MF59, во много раз превосходит иммуногенность вакцины с использованием соединений алюминия. Было показано, что MF59 поглощается макрофагами и дендритными клетками, как в месте введения, так и в локальных лимфоузлах. Клинический опыт (около 20000 иммунизированных пациентов в клинических исследованиях, проведенных компанией Chiron, Италия) иммунизации против ВИЧ, вируса простого герпеса, вируса гепатита В и гриппа еще раз показал, что MF59 безвреден и хорошо переносится человеком [12].
Адъювант AS03 был лицензирован в 2009 г. (GlaxoSmithKline, Великобритания). Он состоит из сквалена, Твин 80 и а-токоферола [3]. Использование этого адъюванта в вакцине против гриппа повысило эффективность вакцины для всех возрастных групп.
Стабильная эмульсия сквалена и полимер Pluronic L-121 служат универсальным переносчиком для нацеливания антигенов к АПК. Из 130 протестированных аналогов МДП [13] в качестве адъювантов М-ацетилмурамил-Ь-треонил-Б-изоглутамин показал наименьшее количество побочных эффектов. Комбинация этой эмульсии с треониловым аналогом МДП (т-МДП) известна как синтетическая адъювантная композиция - SAF [14]. Данная композиция повышает эффективность вакцин против вируса гриппа, гепатита В, вируса простого герпеса и рака в опытах на животных. Синтетический адъювант SAF на основе эмульсии «масло в воде» был получен в 1980-х годах, как замена адъюванта Фрейнда. Полный адъювант Фрейнда (ПАФ) [15] содержит убитые микобактерии. Неполный адъювант Фрейнда (НАФ) содержит только эмульгирующий агент Arlacel А (маннид моноолеат) и биодеградируемое масло. Он до сих пор применяется в вакцинах против рака и в составе иммунотерапевтической вакцины против ВИЧ.
На сегодняшний день разработано значительное количество адъювантов [16], большинство из которых представляют собой эмульсии типа «вода в масле» и могут быть классифицированы как иммуностимулирующие масляные эмульсии [17]. Коммерчески доступные эмульсии «вода в масле» можно разделить на две группы: в первой группе используются слабометаболизируемые минеральные масла, а во второй - хорошо метаболизируемые масла.
Спекол (ID-DLO, Нидерланды) представляет, собой адъювант, состоящий из очищенного минерального масла (Markol 52) с эмульгаторами Спан 85 и Твин 85. В экспериментальных исследованиях на животных (мышах, кроликах, свиньях, попугаях) было показано, что Спекол вызывает иммунный ответ с образованием антител, сравнимый с иммунным ответом при использовании адъюванта Фрейнда [16]. Тканевое поражение, вызываемое Спеколом, обычно меньше, чем при использовании полного адъюванта Фрейнда и сходно с поражением, вызванным применением НАФ, хотя в одном из исследований показано, что Спекол вызывает более сильные повреждения, чем ПАФ/НАФ [18]. Информация о болевых ощущениях при введении Спекола ограничена и сходна с подобной информацией для ПАФ/НАФ. Montanide ISA adjuvants
Адъюванты Montanide (Seppic, Франция) представляют собой серию адъювантов полученных при использовании различных масел, эмульгаторов и иммуномодуляторов для получения эмульсий с различными свойствами [16]. Адъюванты ISA50V и ISA70 представляют собой эмульсии, изготовленные из очищенного минерального масла и схожи с НАФ. При сравнении этих адъювантов с адъювантом Фрейнда было показано, что они вызывают сходный гуморальный иммунный ответ, однако часто с меньшей воспалительной реакцией. Другие адъюванты группы Montanide являются в большинстве своем профилактическими, имеют различный состав и проходят разные стадии клинических исследований [19]. Адъюванты TiterMax и TiterMax Gold
Рассматриваемые адъюванты (CytRx, США) содержат сквален, сорбитан моноолеат 80 в качестве эмульгатора, запатентованный блок-сополимер (CRL8941 или CRL8300) и микрочастицы окиси кремния. TiterMax, по сравнению с ПАФ, приводит к равному или большему титру антител [20]. Неионные блок-сополимеры состоят из линейных цепей гидрофильного полипропилена. Высокий молекулярный вес сополимеров обеспечивает адъювантную активность посредством антиген-презентации, активации системы комплемента, активации макрофагов и увеличения хемотаксиса. TiterMax и TiterMax Gold используются для проведения лабораторных исследований только на животных.
Адъювантная система RIBI (RIBI Adjuvant System (RAS)) Адъювантная система RIBI (RAS) (Corixa Corporation, США) - коммерческая адъювантная система, ставшая доступной для экспериментального использования в 1985 г. В системе RAS используется небольшое количество сквалена и Твин 80 в качестве ПАВ. До растворения в воде в эту смесь внедряют антиген. Получаемый адъювант менее вязок, чем стандартные водомасляные адъюванты, стерилизуется фильтрацией и легко вводится путем инъекции [20]. Сама по себе эмульсия является слабым адъювантом, поэтому требуется добавление иммуномодуляторов. Для создания различных адыовантных композиций используются следующие три иммуномодулятора [16]:
Трегалоза-6,6 -димиколат (ТДМ) - липидный компонент микобактериального корд-фактора, неиммуногенного компонента вирулентных штаммов микобактерий. ТДМ усиливает как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ в комбинации с другими иммуномодуляторами и антигенами. ТДМ находится во всех трех адъювантных RAS композициях;
МФЛ - химически модифицированная форма липида А, который является одним из бактериальных липополисахаридов ответственных за эндотоксический эффект. МФЛ сохраняет большую часть иммуностимулирующей активности липида А с уменьшением токсичности [21]. МФЛ проявляет себя как антагонист TLR-4 и увеличивает как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Он присутствует в двух адъювантных композициях RAS и отсутствует в третьей, рекомендованной при введении сильных антигенов (для мышей);
Получение наночастиц из природных соединений
Mowat и сотр. показали, что иммуностимулирующие комплексы с инкорпорированным антигенным белком - овальбумином вызывают очень сильный иммунный ответ при введении мышам и при этом, не требуют большого количества антигена [52, 53].
В работе [48] было показано, что ИСКОМы приводят к образованию IL-12, играющего ключевую роль в иммуногенности адъюванта. Проведенные исследования показали, что однократная подкожная иммунизация мышей ИСКОМами, содержащими либо очищенный интактный gpl60 поверхностный гликопротеин вируса ВИЧ-1, либо гемагглютинин вируса гриппа, приводит к воспроизводимому и длительному примированию ВИЧ- или грипп-специфичного CD8+ МНС класса I [54]. Имеются данные, подтверждающие использование ИСКОМов в качестве мукозальных адъювантов [55, 56, 57].
В последние десятилетия существенно возрос интерес к направлению, связанному с получением НЧ из биоразлагаемых полимерных материалов. Размер таких частиц варьируется от 10 до 1000 нм [58].
Различают полимерные наносферы, имеющие внутренний матрикс, и нанокапсулы, имеющие центральную полость, окруженную полимерной мембраной. Преимущества использования полимерных НЧ заключаются в следующем. Во-первых, это малый размер частиц, влияющий на поглощение клетками. Так в работе, посвященной исследованию НЧ на основе ПЛГА, было показано, что частицы размером 100 нм поглощались клетками линии Сасо-2 в 2.5 раза лучше, чем частицы размером 1 мкм и в 6 раз лучше по сравнению с частицами размером 10 мкм [59]. Во-вторых, использование синтетических биоразлагаемых материалов для получения частиц позволяет увеличить время выхода лекарственного вещества от нескольких дней до недель, по сравнению с природными полимерами, которые имеют относительно недолгую продолжительность высвобождения лекарственной субстанции.
Для получения полимерных НЧ используются синтетические полимеры, такие как полимеры молочной кислоты [60], сополимеры молочной и гликолевой кислот, природные полимеры (альбумин, желатин, альгинат, коллаген и хитозан) [61]. Из всех этих полимеров наиболее широко были изучены полимолочная кислота (ПЛА) и сополимер молочной и гликолевой кислот (ПЛГА) [62]. Как и природные полиэфиры, они подвергаются гидролизу при введении в организм, образуя биологически совместимые и метаболизируемые компоненты (молочную и гликолевую кислоты), которые, в конечном
счете, удаляются из организма через цикл Кребса. Продукты биоразложения полимера образуются с очень низкой скоростью и, следовательно, не влияют на нормальное клеточное функционирование. Эти полимеры были всесторонне протестированы на токсичность и безопасность на животных и в настоящее время используются в медицинских целях для получения саморассасывающихся нитей, в пересадочных материалах для искусственных органов [63]. Во многих исследованиях НЧ рассматриваются в качестве адъювантов вакцин для подкожного введения [64]. Основные полимерные НЧ, используемые в настоящее время: Включение антигена в ПММА или ПЛГ может осуществляться инкапсуляцией или сорбцией. В случае инкапсуляции антигена иммунный ответ выше, чем в случае адсорбции антигена на поверхности НЧ. Как ПММА, так и ПЛГ являются медленно биодеградируемыми, что дает возможность антигену, содержащемуся в НЧ, высвобождаться в течение нескольких месяцев.
ПММА проявил себя наиболее эффективным адъювантом для инактивированной сплит вакцины против ВИЧ-2 по сравнению с 23 другими адъювантами, включая соединения алюминия. НЧ ПММА увеличивают иммунный ответ и на другие антигены, включая вирус гриппа и сплит вакцину против ВИЧ-1 (вакцину, содержащую частицы разрушенного вируса).
НЧ на основе ПЛГ, также как и ПММА, были протестированы на адъювантный эффект. Показано увеличение иммунного ответа на различные антигены при использовании ПЛГ-частиц в качестве адъювантов. Захват антигена АПК клетками сильно увеличивается при ассоциации антигена с ПЛГ. Адъювантный эффект ПЛГ может быть повышен добавлением других адъювантов (например, соединений алюминия или CpG олигодезоксинуклеотидов). Raghuvanshi и сотр. показали, что комбинация соединений алюминия и частиц ПЛГ увеличивает иммунный ответ на столбнячный токсин (СТ) так же, как и при двойной иммунизации с использованием СТ, причем больше, чем одноразовая инъекция НЧ, ассоциированных с СТ [65] Предлагается три возможных механизма для объяснения синергетического эффекта: в комбинации адъювантов присутствует инициаторная доза (ассоциирована с соединениями алюминия) и доза для вторичной иммунизации (находится в частицах ПЛГ); соединения алюминия могут привлекать иммунокомпетентные клетки в область инъекции; "в месте инъекции соединения алюминия формируют гель, что замедляет отток - . ПЛГ наночастиц из области введения, в результате улучшается взаимодействие НЧиАПК.
Адъювантный эффект может быть также увеличен повышением гидрофобности полимеров путем смешивания ПЛГ полимеров с другими гидрофобными полимерами, например поликарболактонами. Было обнаружено, что CpG мотив, инкапсулированный в ПЛГ НЧ, также увеличивает иммунный ответ на СТ в линии мышей C57BL/6.
Высвобождение антигена в течение нескольких дней может осуществляться в вакцинах на основе ПАЦА НЧ. Pitaksuteepong и сотр. исследовали ПАЦА НЧ, приготовленные с использованием межфазной полимеризации в микроэмульсии «вода в масле» для доставки вакцин при подкожном введении [66]. Данный способ приготовления ПАЦА НЧ отличается рядом преимуществ перед остальными методами: эффективность инкапсуляции гидрофильных биологических веществ, таких как инсулин, в НЧ оказалась достаточно высокой: 80-95% при концентрации мономеров 1.5% (весовые доли); из-за того, что микроэмульсии формируются спонтанно, можно избежать разрезания полимеров, как при приготовлении ПММА и ПЛГ; полимеризация ПАЦА инициируется гидроксид-ионами, образующимися при диссоциации воды, т.е. не требуется дополнительных затрат энергии на облучение или нагревание.
При использовании дендритных клеток (клеточная линия D1) было показано, что наночастицы ПАЦА увеличивают эффективность доставки антигена к дендритным клеткам по сравнению с растворенным антигеном [67].
Получение НЧ на основе тритерпеноидов бересты
Мы считаем, что в описываемом эксперименте были зафиксированы стадии образования САНЧ из тритерпеноидов бересты.
При смешении двух жидкостей возникший градиент химических потенциалов вызывает массоперенос между фазами [95]. При этом на границе раздела жидких фаз возникает процесс, описываемый как эффект Марангони [96]. В каком-то смысле физические параметры образующихся НЧ представляют собой память о событиях в переходном слое на границе двух жидкостей, где происходил процесс их рождения.
Дисперсии на основе полифенола ДГК получали методом, аналогичным методу получения САНЧ из СТБ. Помимо ДГК для стабилизации НЧ в состав дисперсий включали яФХ (яичный фосфатидилхолин). Были получены две серии дисперсий ДГК: без модификатора (обозначение ДК) и с положительно заряженным амфифилом мирамистином (обозначение ДКМ). По форме частицы напоминали вогнутые диски (рис. 20). Размеры частиц дисперсий представлены в табл. 5.
НЧ получали при смешении в различных соотношениях амфифильных веществ с противоположными зарядами: положительно заряженного мирамистина и отрицательно заряженного цереброзид сульфата, входящего в состав ГСфЛ. В работе [97] подобным образом были получены нанокомплексы из доксорубицина и декстран сульфата.
При смешении разнозаряженных амфифилов образуются НЧ различного размера и заряда в зависимости от их соотношения. В точке эквивалентности зарядов образуется крайне нестабильная дисперсия: частицы быстро агрегируют и осаждаются. До точки эквивалентности частицы имеют заряд одного знака, а после - противоположного, при этом за счет электростатического отталкивания заряженных частиц дисперсии стабильны. Таким образом, зная соотношение ГСфЛ и мирамистина, при котором образуются нейтральные агрегаты, можно получать стабильные дисперсии с определенным поверхностным зарядом НЧ.
Для изучения характера взаимодействия отрицательно заряженных ГСфЛ и положительно заряженного мирамистина и нахождения точки эквивалентности зарядов смешивали водные дисперсии ГСфЛ и мирамистина в различных соотношениях и измеряли оптическую плотность полученных дисперсий (рис. 21). При концентрации ГСфЛ 1.25 мг/мл и мирамистина в пределах от 0.175 до 0.3 мг/мл оптическая плотность достигала высоких значений, что свидетельствовало об образовании крупных агрегатов и нестабильности дисперсий. С минимальным рассеиванием четко выделялись две области концентрации мирамистина: до 0.1 мг/мл и после 0.5 мг/мл. Низкие значения оптической плотности дисперсий были связаны с преобладанием отрицательно заряженных частиц ГСфЛ, в первом случае, и положительно заряженных частиц мирамистина, во втором, которые за счет электростатического отталкивания образовывали стабильные дисперсии. Рис. 21. Зависимость оптической плотности дисперсий (450 нм), содержащих 1.25 мг/мл ГСфЛ и мирамистина, от концентрации последнего.
Поэтому для получения стабильных дисперсий смешивали амфифильные вещества с противоположными зарядами в следующих соотношениях мирамистин/ГСфЛ: 0.08 для получения отрицательно заряженных и 0.40 - положительно заряженных частиц.
На характер взаимодействия разнозаряженных амфифилов также может оказывать влияние порядок и скорость добавления одного к другому. Для определения влияния способа смешения ГСфЛ и мирамистина на свойства образующихся НЧ были приготовлены дисперсии с различным содержанием мирамистина (концентрация ГСфЛ во всех образцах 1.25 мг/мл, концентрация мирамистина - 0 (ГМО), 0.1 (ГМ10), 0.2 (ГМ20), 0.5 (ГМ50) и 1 (ГМ100) мг/мл) четырьмя способами, отличающимися порядком и способом прибавления амфифилов друг к другу. Дисперсии оценивали по значению оптической плотности (рис. 22). Резких отличий между дисперсиями, полученными различными способами, не наблюдалось, за исключением образцов с соотношением амфифилов, соответствующим зоне эквивалентности (максимум оптической плотности). Причем, в случае добавления дисперсии ГСфЛ к раствору мирамистина крупные агломераты образовывались независимо от скорости прибавления амфифилов. При концентрации мирамистина, соответствующей образованию стабильных дисперсий ( 0.1 и 0.5 мг/мл), порядок и скорость смешения амфифильных веществ не оказывали существенного влияния на свойства дисперсий (размер частиц). Поэтому в качестве оптимального метода получения стабильных заряженных НЧ выбрали добавление раствора мирамистина к раствору
Зависимость оптической плотности дисперсий от порядка и способа прибавления мирамистина и ГСфЛ (концентрация ГСфЛ во всех образцах 1.25 мг/мл, концентрация мирамистина - 0; 0.1; 0.2; 0.5 и I мг/мл соответственно). Образцы готовили следующим образом: добавляли к дисперсии ГСфЛ дисперсию мирамистина одной порцией (1) и по каплям (2); к дисперсии мирамистина добавляли дисперсию ГСфЛ одной порцией (3) и по каплям (4).
Были получены дисперсии из ГСфЛ и мирамистина с различным содержанием последнего (концентрация мирамистина: 0, 0.15, 0.2, 0.5 мг/мл, концентрация ГСфЛ — 1.25 мг/мл) (обозначение ГМ) и дисперсии с добавлением ДГК (обозначение ГМД).
Как и ожидалось, с увеличением содержания мирамистина, поверхностный заряд, частиц менялся с отрицательного на положительный, а в зоне эквивалентности был близок к нулю (табл. 6).
Окрашивание клеток флуоресцеин диацетатом
Были разработаны варианты установок для непрерывного процесса получения дисперсии САНЧ с различной конструкцией элемента смешения водного раствора и раствора СТБ в ТГФ: дроссельный и смеситель закрытого типа с мешалкой (рис. 46). Эти установки позволяют ускорить процесс получения дисперсии САНЧ. Для непрерывного процесса возможна автоматизация.
Исходя из наших представлений о механизме образования САНЧ при смешении раствора СТБ в ТГФ с водой, логично предположить, что важнейшую роль в получении НЧ играет интенсивное перемешивание в точке контакта жидкостей - воды и раствора СТБ в ТГФ. Для достижения такого перемешивания в первом варианте использовали дроссель, схема устройства которого представлена на рис. 46, А. Появление резкого сужения на пути непрерывного потока должно привести к возникновению мощных турбулентных завихрений сразу за сужением.
Основная трудность для такого смесителя заключается в сложном гидравлическом расчёте соотношений диаметров трубок для подачи воды и раствора СТБ в ТГФ и необходимых давлений. Другой проблемой является подача компонентов с постоянной скоростью, что должно обеспечиваться постоянным во времени давлением подачи. С помощью компрессора такого постоянства добиться очень сложно.
С помощью тонкой трубки раствор СТБ в ТГФ (5 мг/мл) подавали в поток воды в зону дросселирования. Соотношение объёмных потоков вода/ТГФ - 5/1 (150 мл/30 мл). В связи с неравномерностью подачи компонентов, для исследования отбирали среднюю фракцию, когда поток воды набрал максимальную скорость, а поток ТГФ равномерно поступает в перемешивающее устройство.
На выходе из стеклянной трубки получали готовую дисперсию. Продолжительность процесса зависит только от объема исходных реагентов. В двух пробных запусках в начальный момент в приемном сосуде оказывалась опалесцирующая жидкость, на поверхности которой находилась тонкая, прозрачная плёнка, появление которой, вероятно, обусловлено контактом с воздухом внутри аппарата. Спустя небольшой промежуток времени в дисперсии появлялись крупные агломераты; размер частиц дисперсии 647 нм (до 96%).
Недостатком прибора является присутствие воздуха в последроссельном пространстве, которое можно избежать с помощью точного расчёта диаметра трубок.
В другом варианте был сконструирован смеситель закрытого типа с мешалкой, схема которого представлена на рис. 46, Б. Смешения в этом случае достигали с помощью магнитной мешалки. Раствор СТБ в ТГФ и воду с помощью двух насосов для ВЭЖХ подавали по капиллярам (внутренний и внешний диаметры - 0.05 и 1.46 мм соответственно) в смеситель, из верхней части которого через капилляр выталкивалась готовая дисперсия (размер частиц дисперсии сопоставим с частицами, получаемыми по «стандартной» методике). Регулировка соотношения воды и раствора СТБ в ТГФ достигалась изменением скорости подачи насоса (от 0.1 до 10 мл/мин с шагом 0.1 мл/мин), через который подавали раствор СТБ в ТГФ. Второй насос имел постоянную скорость подачи - 11.4 мл/мин. Процесс образования НЧ проходит без воздуха, скорость перемешивания регулируется.
Как возможную замену стадии упаривания при концентрировании дисперсии рассматривали ультрафильтрацию (рис. 47, А). Увеличив все загрузки в 100 раз (по «стандартной» методике 26 мл дисперсии подвергается упариванию на вакуумном роторном испарителе), с помощью перистальтического насоса дисперсию подавали в ультрафильтрационную ячейку, получая на выходе дисперсию САНЧ, концентрированную в 13 раз и фильтрат (воду с растворителем). Так были получены САНЧ с размером частиц характерным для дисперсий, получаемых по «стандартной» методике (100-200 нм) (рис. 47, Б), дзета-потенциал частиц составил -36.59 мВ. Пока эта методика не совершенна, существенная часть САНЧ теряется из-за адсорбции на фильтре (более 50%). Тем не менее, по сравнению со «стандартной» методикой, этот метод позволяет уменьшить временные затраты примерно в 10 раз.
Для расширенных биологических испытаний около 12 л дисперсии САНЧ было получено другим методом, в котором вместо воды использовали уже готовую дисперсию САНЧ, повторяя циклы и концентрируя, таким образом, дисперсию в 2 раза (рис. 48). Этот метод позволяет получать дисперсии с большим содержанием действующего вещества, уменьшая расход воды, и, тем самым, снижая энергетические и временные затраты. САНЧ
Несмотря на то, что в дисперсии наблюдались кристаллы, дисперсия была стабильна, размер частиц не превышал 200 нм (рис. 49). Концентрация САНЧ в такой дисперсии почти в 2.5 раза превышала концентрацию в дисперсиях, полученных по «стандартной» методике (1.2 мг/мл вместо 0.5 мг/мл).
Методики получения САНЧ, отличные от «стандартной», показали актуальность разработки простого метода определения концентрации СТБ в дисперсиях.
Самый простой метод основывался на том, что в довольно широких пределах рассеивание света дисперсиями прямо пропорционально зависит от концентрации. Однако, данный метод был не очень удобен, поскольку рассеивание зависит и от размера частиц, и их формы; небольшие изменения в этих параметрах приводят к существенному изменению рассеивания света. Поэтому был разработан метод, основанный на том, что в состав СТБ входит кофеат бетулина, имеющий максимум поглощения в электронных спектрах при 320 нм. Таким образом, на основе калибровочной кривой (рис. 50) для данной партии СТБ - зависимость поглощения при 320 нм от концентрации СТБ в смеси ТГФ/вода — можно легко определять концентрацию СТБ в любых дисперсиях. Необходимым условием для проведения анализа являлось полное растворение САНЧ, что достигалось добавлением к дисперсии десятикратного избытка ТГФ.
Рис. 50. Зависимость поглощения при 320 нм от концентрации СТБ. В качестве метода сравнения использовался гравиметрический метод. Этот метод основан на определении концентрации действующего вещества по массе сухого остатка дисперсии НЧ с заданным объемом. Концентрации дисперсий, определенные двумя этими методам, отличались не более чем на 3%. Но для последнего метода требовался в несколько раз больший объем дисперсии и на порядок больше времени.
Методика получения САНЧ из СТБ, а также частиц ДГК включает стадию упаривания ТГФ и части воды на вакуумном роторном испарителе. ТГФ является слабо токсичным веществом (ЛД5о=2.3 г/кг; ПДК=100 мг/мЗ). Тем не менее, его содержание в дисперсиях необходимо контролировать. В качестве метода определения концентрации растворителя был выбран метод ВЭЖХ. Регистрацию хроматографической информации и обработку результатов осуществляли с помощью программы «МультиХром для Windows» (Ampersand Ltd., Россия). Для определения минимальных концентраций- ТГФ, которые можно зафиксировать данным методом, провели следующий эксперимент. ТГФ и вода смешивались в том же соотношении (1:25), что и для приготовления САНЧ. Дисперсию упаривали на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 40С до следующих объемов, мл: 18-12-5, отбирая каждый раз аликвоты по 1 мл. Пробы анализировали на жидкостном хроматографе, используя обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ (колонка 4.6x120 мм LiChrosorb RP-18, элюент метанол-вода 4:6 (объемные доли), скорость подачи элюента 0.70 мл/мин, объем вводимой пробы 20 мкл). Результаты эксперимента представлены в табл. 15.
