Введение к работе
Актуальность теми. Исследование дахлодекстрші глюканотрансїеразц (ЦГТгзы) л получение х неп мояоклоиальных антител является заяной к актуальной задачей. Изучению ПТТгз посвяпеяо множество работ, число публикации по этой теме постоянно растет. ЦГТаза является $ерілентом миг ровного происхождения с уникальной способностью к синтезу днхлодекстрппоз СЦЛ) -углеводных макроднхлнчесхих соединений - из крахмала, ггд образуют комплексы включении с различными молекулами, причем при включении з полость ЦД другого вэдестза свойства последнего могут заметно изменяться. 5отя немало веществ мозет образовывать подобные соединения вхлкченпя в кристаллическом состоянии , особенность ннклюзпопних соединений пд заключается з том, что снн устойчивы з растворе.
Способность 1|Д к комплексообразсвгаию к беззредность для челсгоческсго организма обусловили возможность их широкого применения для улутаенпя свойств пищевых продуктоз я лекарственных преиаратоз , з косметике, химической промышленности, для моделирования разнообразных биохимических явлений. Сэра их приыепеппя расширяется с кандым годом.
Удалось установить целый ряд микроорганизмов -продуцентов ЦГТаз. изучить условия их культивирования, определить некоторые $ерментативные свойства этих їерментов. Недавно били установлены аминокислотные последовательности ЦГТаз нескольких микроорганизмов и трехмерная структура двух ЦГТаз. Однако з области исследования этой группы 5эрментов остается множество нерешенных вопросов. До сих пор в литературе отсутствуют данные о антигенных свойствах ЦГТаз. Молекулярно-кммунологпческие исследования с ними не проводились. Установление антигенной структуры ЦГТазы дает возможность полнее изучить взаимосвязь между структурой
белка и его Функциями. Наличие точных методов детектирования малых количеств фермента позволяет определить ЦГТаау в сложных сіі«*сях, а также в ферментативно неактивном состоянии.
Изучение диклодскстринов и циклодехстрин глкканотранс$ераз являлось одним из важных направлений работ кафедры органической к биологической химии ТТУ. Исследования были связаны с выполнением работы РС-6060/1 и PC-6012, которые входили в программу ГКНТ 0.74.05-
1|ель и ьадачи чсследочання елыо настоящей работы является раорабэтказ$$ог.тивннх методов очистки фермента из культуральной жидкости бактерии Bacillus mzcerans, получение антител к нему, изучение антигенных свойств ЦГТазы Bacillus macerans, сравнение антигенных свойств ЦГТаз различные микроорганизмов» разработка методики определения малых количеств IjrTae, а такзке иммунобнотехнилогЕческого метода получения никлодекстриков. В конкретные садачк работы входят:
-
Выделить дгтазу из культуральной жидкости Bacillus macerans. '
-
Получить гнбркдомкые линии клеток , сегрегирующие .
моноклонгльны^ антитела (МХА) к ГТазе Bacillus macerans, а такжэ получить полнклональные антитела к этому {ерменту.
3- Ргзработать чувггвительнух. Еммуно^ермектную методдку для оьррделоЕЕЯ малых количеств дгтааы Bacillus macerans.
4. Исіильоуя полученные ІЛКа, изучат*, антигенную структуру дгтазы Bacillus macenans. Установить, Б каким эпитопам получены МКА.
!>. Определить спепя^ичностг полученных антител к ЦГТазам, продуцируемым различными микроорганизмами. 6. Разработать метод иммунобяотехнологического получения укклодекстрийов при помощи ЦГТазы, иммобилизованной на иммуносорбенте.
Научнар новизна и практическая значимость работы. Разработана эмэктивная методика выделения дГТазы из
культуральной жидкости Bacillus macercns. Фермент очищен до гомогенного состояния по данным электрофореза в полиакрил амидном геле.
Предложен новый экспресс-мете д определения ахтиэности ЦГТазы, позволяющий біїстро определить активность фермента п минимальных объемах проб.
Впервые получены мэнохлональные антитела к этому $ерменту, которые являются также первыми МКА к ЦГТазам. Проведено изучение иммунологических свойств фермента, дана характеристика полученных антител. Установлено, что антитела узнают как катионую, так и денатурированную ЦГТазу Bacillus macerans Наиболее детально' изучена МКА 5В1, они получены из асцитной жидкости в препаративных количествах. Определена локализация эпитопа, узнаваемого МКА 5В1, на молекуле ЦГТазы Bacillus macerans.
разработан обладающий высокой чувствительностью иммуно$ерментный метод детектирования малых количеств ЦГТазы (чувствительность 10 иг/мл). Изучено взаимодействие поли- и монохлональных антител с ЦГТаоамч Bacillus macerans , Bacillus circularise Klebsiella pneumoniae.
Показана принципиальная возможность получения циклодекстринов с помощью иммобилизованной на В г С М-агарозе ЦГТазы Bacillus macerans.
ЦГТаза является ферментом большой промышленной значимости. Исследованиям структурно-функциональных свойств ЦГТаз посвящены десятки работ в год. Иммунологическая характеристика ермента поможет глубже понимать его струхтуру. Разработанный микрометод определения ферментативной активности ЦГТаз поээоляет массовый экспресс-анализ, что может быть применено для нахождения новых штаммов - продуцентов ЦГТаз. Полученные моно- и поликлональные антитела могут быть применены для детекции ЦГТаз в разных образцах (поликлональные антитела уже использовались в группе доктора Алана Шульыэпа в Институте Биотехнологии Университета Хельсинки для определения ЦГТазы в
трансгенных растениях). Предлагаемый в работе микрометод для определения ЦГТазной активности целесообразна использовать в ахадемических и отраслевых научно-исследовательских српшизаиикх. занимающихся проблемами биотехнологии.
Основные результаты, излоггепнк* в диссертапик. получены в соавторства с Резбен МЗ. Автор выражает благодарность за помоць при иммунизации кнзої них е при получении гибридом х.м.к.Халлигаг Т.. Алликметс Э. к Самюэль К., за ценные советы при проведения иммунологических исследовании к.бл. Яргеі;юлг А.. сехвенировании пептидов Поога М.
Апробапия работы. Результаты нсследоваияй были доложены на VII биохимической кон^ереипии прибалтийских республик "Теоретические н прикладные аспекты созремекной биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии" (Каунас. 1990). VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная знзимология" (получение и применение биокатализаторов в народном хозяйстве и медицине) (Москва, 1991). И Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1931). ВЮВА1Л" ,92 83 td Event of the -Eutnpasn Federation of Biotechnology (Таллинн, 1992). а также на семинарах кафедры органической и биологической химии Таллинского технического университета и Института химической и биологической {изихк Академии Наук Эстонии.
Публикации результатов исследований. Материалы исследований опубликованы в б печатных работая.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на I стр. машинописного текста, включает 4 таблицы н 21 рисунок. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, а также выводов н списка пнтируемон литература (138 источников).