Введение к работе
Актуальность теми. Лептоспироэ относится к числу наиболее распространенных природноочаговых зооантропонозных, весьма опасных в социальном и экономическом отношениях болезней.
Для предупреждения распространения болезни и выбора средств профилактики и борьбы необходима эффективная диагностика.
При лабораторной диагностике лептоспироза применяют в основном серологический метод ( реакцию микроагглютинации - РМА ). Несмотря на высокую чувствительность и специфичность этот тест нельзя признать оптимальным методом,так как он достаточно трудоемок, сопряжен с необходимостью постоянно поддерживать набор референтных живых культур лептоспир и соблюдать режим работы с ними.
Перспективным направлением исследований является внедрение в ветеринарную лабораторную практику ДНК-зондов, которые с успехом используются для обнаружения многих вирусов,бактерий и паразитов (Prem S. Р. ,1990).
Мэлекулярно-биологические методы играют в настоящее время важную роль для изучения систематики патогенных лептоспир,поиска возможностей их дифференциации и идентификации, на основании сравнения генотипов ( Nielsen J.N. ,1989; Ramadass P. ,1990,1992).
За рубежом ведутся интенсивные исследования генома многочисленных сероваров лептоспир с целью практического применения рестриктазного анализа и различных вариантов ДНК-ДНК гибридизации (Le Febure R. В., Thiemann А. В. ,1987; Mi Пат B.D. et al. ,1987; Terpstra W. J., Schoone u J. ,1987; Zuerner R. L , Bolin С A. ,1988; PaccJarint M.L et al. ,1992; Merien F. et al. ,1992).
В нашей стране Ежов Г. И. ,1974,1988 и Артюшин С. К. ,1980 изучали нуклеотидный состав и степень подобия нуклеотидных последовательностей у паразитических и сапрофитных штаммов лептоспир.
Однако методы идентификации и дифференциации лептоспир путем молекулярного клонирования ДНК L. interrogans серовара pomona в доступной литературе отсутствуют..
Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследования являлось молекулярное клонирование ДНК L interrogans серовара pomona и получение гибридизационного зонда для идентификации и дифференциации лептоспир. В соответствии с поставленной целью выполнялись следующие задачи :
-
Клонировать ДНК L. pomona в плазмидном векторе и создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащих случайные фрагменты генома L. роїюпа.
-
Получить банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир различных серогрупп.
-
Провести серию гибридизаций отдельных клонированных фрагментов ДНК с полученными препаратами нуклеиновых кислот лептоспир и выявить фрагмент ДНК L interrogans серовара pomona , пригодный для использования в качестве видоспецифичного гибридизационного зонда.
-
Исследовать возможности применения некоторых клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибрвдизации.
Научная новизна работы. Впервые осуществлено молекулярное клонирование ДНК L. interrogans серовара pomona штамма ВГНКИ-б и получена клонотека рекомбинантных плазмид.
Получен банк препаратов нуклеиновых кислот производственных и референтных штаммов, полевых изолятов лептоспир из коллекций ВГНКИ ветпрепаратов.НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и университета Дружбы Народов им. IL Лумумбы.
Епервые изучена гибридизационная активность отдельных клонированных Фрагментов L. pomona по отношению к образцам ДНК
- 5 -' референтных штаммов лептоспир,полевым изолятам серогруппы Pomona и другим представителям бактериального мира
В результате проведенных экспериментов выделен Фрагмент ДНК, который может быть использован в качестве гиОридизационного зонда :
для дифференциации патогенных лептоспир от сапрофитных ;
для выявления Leptospira interrogans как диагностический тест;
для идентификации штаммов лептоспир , используемых в производстве вакцины против лептоспироза животных.
Практическая зиачкность работы. Полученный банк рекомби-нантных плазмид, содержащих фрагменты ДНК лептоспир, служит ис-ТОЧНИ.СОМ специфичных гибридиэационных зондов, предназначенных для изучения генома лептоспир.
Разработан метод выделения вьюокоочищенных препаратов ДНК из биомассы лептоспир.
Предложено использовать рекомбинантную плазмиду pLp 41 в реакции ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации вида L. interrogans от L. ЫПеха и других родов бактерий, а также для дифференциации производственных штаммов лептоспир.
Материалы диссертационной работы использованы при составлении " Мэтодических рекомендаций по идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации вида Leptospira interrogans от Leptospira ЫПеха в реакции ДНК-ДНК гибридизации", Мэто-дические рекомендации предназначены для использования в научно-исследовательской работе и практике при паспортизации производственных штаммов лептоспир и изучении культур лептоспир, выделенных от сельскохоэяйственнных и диких животных.
Апробация реаужтатов исследований . Основные положения
диссертации доложены и одобрены на научной
конференции" Научные основы технологии промышленного производства ветеринарнных биологических препаратов" ( Москва , 1991 г.);
- б -на Международной научной конференции .посвященной проблемам леп-тоспироза ( ЬЬсква, 1991 г.}; на научно-практической конференции " Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных" ( Москва, 1993 г.).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в четырех научных работах.
Объем работы. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов : введения,обзора литературы,результатов собственных исследовании,. обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Список цитируемой литературы содержит 150 отечественных и иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 12 рисунками .