Введение к работе
1.1. Актуальность темы исследований. ИРТ КРС причиняет значительный ущерб промышленному животноводству, вызывая поражение органов дыхания, пищеварения и размножения. Особенно тяжело болезнь протекает в крупных животноводческих хозяйствах, где большое количество животных разного возраста содержится на ограниченных площадях, что, в значительной степени, способствует быстрому распространению вирусных инфекций, поражающих дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт и репродуктивные органы. Вирус, повреждая чувствительные клетки дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и репродуктивных органов способствует размножению различных микроорганизмов -эшерихий, пастерелл, сальмонелл, протея на пораженных клетках (Плещакова В.И., 2012; Пчельников А.В., 2017; Прасолова О.В., 2017 и др.).
Актуальность проблемы ИРТ КРС состоит в следующем:
широкое распространение болезни среди крупного рогатого скота всех возрастов;
недополучение приплода молодняка крупного рогатого скота из-за по-вышения уровня абортов и мертворождений (до 30%);
рождение нежизнеспособных телят (до 10%);
снижение удоя коров во время болезни (до 60%);
гибели телят от пневмоэнтеритов (до 60%);
недополучение привесов живой массы у телят (до 70%);
увеличение числа коров с многократным непроизводительным осеменением (до 30%);
увеличение затрат на профилактику и лечение больных животных (Мищенко В.А., 2012; Пчельников А.В., 2017).
В связи с особенностями патогенеза и течения ИРТ КРС, выражающихся в скрытом течении заболевания, персистенции вируса в организме и выделении вируса во внешнюю среду, существует необходимость в своевременном выявлении таких животных для исключения их как источника инфекции в эпизоотической цепи.
В настоящее время важное значение приобретает разработка молекулярно-генетических методов, основанных на выявлении генома вируса в биологическом материале, а также совершенствование серологических тестов для выявления противовирусных антител. К таким методам относятся полимеразная цепная реакция (ПЦР), способная выявлять возбудителя на любой стадии заболевания, включая латентную, а также иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), позволяющие значительно сократить время на постановку диагноза.
В комплексе лечебно-профилактических мероприятий при ИРТ КРС важную роль играет специфическая профилактика. Разработка новых подходов к
конструированию вакцин, особенно инактивированных, имеет большое значение. При современном ведении животноводства, связанном с концентрацией поголовья, важным моментом является облегчение процесса иммунизации. Такой метод, как внутрикожная иммунизация, является одним из самых перспективных современных методов. При иммунизации животных, осуществляемой на фоне недостатков и несбалансированности кормления, нарушении микробиоценоза, при которых зачастую отмечается угнетение иммунной системы, специфическая профилактика не всегда достигает нужного эффекта. При этом для снятия иммунодепрессивного эффекта стимуляция поствакцинального иммунитета с помощью различных препаратов, особенно пробиотиков, оправдана.
Важным подходом к терапии вирусных инфекций на современном этапе является использование физических методов (поляризованного полихроматического и лазерного излучения), энергетических средств и рекомбинантных штаммов бактерий, содержащих геном вирусов [Л. Е. Козловская, 1999; П. А. Красочко, 2009; К. Н. Мукантаев, 2016; К. К. Муканов, 2015; J. E. Farley, 1979 и др.)
В связи с вышеизложенным, изучение современной эпизоотической ситуации по ИРТ КРС, разработка новых средств и способов иммунологической диагностики, профилактики и терапии вышеуказанной болезни является актуальной задачей ветеринарной науки и практики.
1.2. Степень разработанности темы. Работы по изучению ИРТ КРС в
различных аспектах (биология возбудителя, диагностика, профилактика,
эпизоотология) проводились в нашей стране и за рубежом в различные годы.
Разработкой молекулярно-генетических методов диагностики ИРТ КРС занимались Морозов И.А. (1989), Глотов А.Г. (1991), Котенева С.В. (2006), S. Vilcek (1993), F.S. Kibenge (1994), M.A. Rocha (1999), A. Candido (2000), M. Alegre (2001) и другие. В своих работах они использовали праймеры к генам гликопротеинов В, С и тимидинкиназы, а чувствительность метода повышали, используя гнездовой вариант ПЦР и блот-гибридизацию.
Серологические методы диагностики ИРТ КРС на основе ИФА и РНГА разрабатывали и совершенствовали Васильев А.В. (1980), Непоклонова И.В. (1984), Стеценко В.И. (2003), Кузнецов Д.П. (2001), Ахметсафин Р.Г. (2005), V.E. Vengris (1971), H.J. Cho (2002), L. Bertonni (2005) и другие.
Проблему специфической профилактики ИРТ КРС решали с помощью своих разработок Лобастов А.Е. (1983), Музычин С. И. (1988),Стеценко В. И. (1990), Сюрин В.Н. с соавт. (1982, 1981); Крюков Н.Н., Вечеркин А.С. (1983); Белявская Т.В. (1998), Красочко П.А. (2009), Хитрова А.Е. (2003) и другие. При этом разрабатывались живые или инактивированные эмульгированные вакцины. Однако, разработка сухих инактивированных вакцин против ИРТ КРС для внутрикожной иммунизации не достаточно широко проработана.
Изучению морфологии вируса ИРТ КРС посвящены работы Надточей Г.А., Сюрин (1977), Brees S.S. (1971), Rockborn G. (1990), Hoferer M. (2017) и других. Примененный ими метод электронной микроскопии позволял получать четкие изображения вируса, позволяющие судить о структурной организации вирионов. Аналогичный по разрешающей способности, но отличный по способу формирования изображения вируса, метод атомно-силовой микроскопии для изучения вируса ИРТ КРС не применялся.
Рекомбинантные технологии в профилактике ИРТ КРС применялись для получения маркерных вакцин Bosch J. C. (1996), Flores E. F. (1998), Brownlie R. (2015) и другими, которые успешно внедрены и имеют коммерческий успех, а также для получения рекомбинантных белков и ДНК-вакцин для иммунизации животных S. Van Drunen Littel-vanden Hurk (1993), Caselli E. (2005), Langellotti C. A. (2011), Blanc A. M. (2012), Mackenzie-Dyck S. (2014). Однако последние технологии апробированы только на лабораторных животных.
Предложения по стимуляции иммунного ответа на введение вакцин против вирусных инфекций, в том числе и ИРТ КРС с помощью иммуномодуляторов были выдвинуты П.А.Красочко (1997), с помощью пробиотических средств Неминущей Л.В. (2011), продуктами пчеловодства С.М.Усовым (1998), но использование физических факторов, таких как поляризованный полихроматический свет или лазерное излучение не достаточно изучено.
Таким образом, возникла необходимость применения новых методов изучения вируса ИРТ КРС, разработки средств диагностики, профилактики и терапии данной болезни и повышении эффективности лечебно-профилактических мероприятий новыми способами и препаратами.
1.3. Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилась разработка и совершенствование молекулярно-генетических, физических и биотехнологических средств и методов диагностики, специфической профилактики и терапии ИРТ КРС.
Для выполнения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать и усовершенствовать методы диагностики ИРТ КРС с использованием ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) и РНГА.
-
Провести серологический мониторинг распространения ИРТ КРС в хозяйствах Республики Беларусь, изучить клиническое проявление, состояние иммунитета и обменных процессов при различных формах течения инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.
-
Провести исследования по изучению дрейфа возбудителей вирусных и бактериальных болезней при формировании экологических ниш ассоциациями ИРТ со сходными по клиническим проявлениям возбудителями инфекционных болезней телят.
-
Применить новые подходы к изучению морфологии вируса и дать генетическую оценку штаммов вирусов, входящих в биопрепараты для профилактики ИРТ на территории Республики Беларусь.
-
Разработать средства и способы специфической профилактики ИРТ КРС с использованием инактивированных вакцин и активизации поствакцинального иммунитета с использованием пробиотических препаратов.
-
Теоретически обосновать и применить способ иммунотерапии ИРТ КРС с использованием штамма Bacillus licheniformis КМИЭВ-В202, имеющего участки генома вируса ИРТ.
-
Отработать новые подходы неспецифической профилактики и терапии животных, больных ИРТ КРС с использованием физических способов, пробиотических и энергетических средств.
-
Разработать комплекс мероприятий по применению молекулярно-генетических, иммунологических и физических средств и методов для диагностики, профилактики и терапии респираторных, желудочно-кишечных и гинекологических болезней крупного рогатого скота, в этиологии которых ведущую роль играет вирус ИРТ КРС.
1.4. Научная новизна. Для контроля эффективности иммунизации, проведения диагностических и мониторинговых исследований при ИРТ КРС разработаны:
- тест-система для определения генома вируса методом ПЦР-РВ путем
использования участков высококонсервативных областей генома вируса,
кодирующих синтез гликопротеинов В. Определены оптимальные концентрации
праймеров (к гликопротеиду В в концентрации 5 пмоль/мкл), Taq-полимеразы,
дезоксинуклеозидтрифосфатов (3 и 2 пмоль/мкл), буферных растворов,
флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов (для Taqman-зонда 3 пмоль/мкл, для МВ-зонда 10 пмоль/мкл), что позволило повысить специфичность диагностики до 100%, определять концентрацию вируса в вирусосодержащей жидкости за 14-15 часов по сравнению с классическим методом на культуре клеток;
-набор эритроцитарного диагностикума для выявления антител к вирусу ИРТ КРС в РНГА путем использования стабилизированных глутаровым альдегидом эритроцитов барана, сенсибилизацию которых проводили вирусом с использованием трипанового синего и хлорида хрома, что позволило существенно повысить специфичность, активность и стабильность диагностикума.
Разработанными тест-системами проведен серологический мониторинг по инфекционному ринотрахеиту крупного рогатого скота сывороток крови от невакцинированных коров и телят, который показал наличие антител в среднем у 70,1% обследованных коров и 49,9% у телят.
Предложены новые подходы к изучению морфологии вируса ИРТ КРС с использованием атомно-силовой микроскопии, а особенности генетической структуры - секвенированием, что позволило установить высокий процент гомологии (98-100%) последовательностей вакцинных штаммов - основы противовирусных вакцин, применяемых в Беларуси в сравнении с референтными штаммами из Международного банка нуклеотидных последовательностей.
Разработаны вакцина сухая инактивированная против ИРТ КРС для внутрикожной иммунизации телят с профилактической эффективностью 92,3-93,3%, а также вакцина эмульгированная инактивированная для внутримышечной иммунизации коров и телят с профилактической эффективностью 91,4-96,4%.
Выявлены закономерности формирования иммунного ответа у крупного рогатого скота после иммунизации против инфекционного ринотрахеита на различном фоновом уровне антител - низком или высоком показавшие, что иммунизацию животных в хозяйствах, в которых не проводилась плановая вакцинация, необходимо осуществлять путем двукратного введения биопрепарата, а в хозяйствах, систематически проводящих плановую иммунизацию как живыми, так и инактивированными вакцинами - однократное введение биопрепаратов.
Использование суспензии, инактивированной 0,2% теотропином, Bacillus licheniformis КМИЭВ-В202 внутримышечно двукратно с интервалом в 3 дня позволило получить 100% терапевтический эффект и повышение антителообразования при заболевании телят инфекционным ринотрахеитом, проявившимся поражением органов дыхания.
Определена активизация антителообразования, повышение продуктивно-сти, 100% сохранности и нормализации микробиоценоза кишечника за счет увеличения концентрации бацилл, лакто- и бифидобактерий с одновременным уменьшением эшерихий и кокков у вакцинированных вакциной живой культу-ральной против ИРТ КРС телят на фоне обработки бесклеточными пробиоти-ками «Бацинил» и «Лактимет».
Научная новизна подтверждена патентами Российской Федерации и Республики Беларусь:
патент Республики Беларусь № 11354 «Способ стимуляции поствакцинального противовирусного иммунитета к возбудителям ИРТ КРС, парагриппа-3 и вирусной диареи у теленка». Заявл. 29.03.2006 г., № а 20060271;
патент Республики Беларусь № 12098 «Способ неспецифической профилактики и лечения вирусных пневмоэнтеритов у телят». Заявл. 31.01.2007 г., № а 20070097;
патент Российской Федерации № 2516787 «Способ кормления телят с 20-го по 60-й день выращивания» Заявл. 08.11.2012 № 2012147336/13;
патент Российской Федерации № 2538116 «Биологически активный
комплекс на основе бесклеточного пробиотика, кормовая композиция его содержащая, и способ кормления молодняка сельскохозяйственных животных и птицы». Заявл. 10.01.2013 № 2013100187/13;
патент Российской Федерации № 2 572 215 «Терапевтическое и энергетическое средство для животных». Заявл. 27.06.2014 № 2014126059/15;
патент Российской Федерации № 2 611 351 «Способ лечения болезней бактериальной этиологии у сельскохозяйственных животных и птиц». Заявл. 27.01.2016 № 2016102653;
патент Российской Федерации № RU 2644339 «Вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная сухая» Заявл. 27.01.2016 № 2016102653.
1.5. Теоретическая и практическая значимость работы. Особенности современных подходов к изучению патогенеза и эпизоотического процесса при ИРТ КРС с использованием диагностических тест-систем, разработка новых средств и способов специфической и неспецифической его терапии и профилактики дополняют и расширяют имеющиеся теоретические и практические данные при борьбе с ИРТ КРС.
Установлен дрейф возбудителей вирусных и бактериальных инфекций в экологических нишах, который возможно регулировать с помощью вакцинации, особенно при бактериальных инфекциях, что ведет к элиминации возбудителей из организма и замена их на другие, более патогенные, а иммунизация против вирусных инфекций не приводит к элиминации возбудителя из стада, но способствует снижению инфицированности, заболеваемости и отхода животных.
Выявлен геном вируса ИРТ КРС в бациллах (Bacillus licheniformis КМИЭВ -В202), подтвержденный с помощью ПЦР-РВ с праймерами, гомологичными консервативным участкам генов гликопротеина D и гликопротеина В и секвенирования - сходство генома вируса ИРТ (штамм КМИЭВ-V123) и фрагмента, выделенного из бацилл.
На основе проведенных исследований разработаны:
методические рекомендации по использованию полихроматического поляризованного света для профилактики и терапии пневмоэнтеритов телят;
методические указания по диагностике ИРТ КРС методом полимеразной цепной реакции;
методические указания по использованию полихроматического поляризованного света для лечения и профилактики заболеваний животных;
технические условия и инструкция по изготовлению и применению на тест-системы для выявления и типирования ДНК вируса ИРТ КРС в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени»;
методические рекомендации по специфической профилактике и мерам борьбы с респираторными инфекциями телят;
технические условия (ТУ BY 300002681.028-2015) и инструкция по применению вакцины сухой инактивированной против ИРТ КРС;
технические условия (ТУ BY 300002681.029-2015) и инструкция по применению вакцины инактивированной эмульгированной против ИРТ КРС;
технические условия (ТУ BY 600049853.157-2017) на набор жидких цветных эритроцитарных антигенов и сывороток для диагностики ИРТ КРС;
методические указания по применению набора жидких цветных эритроцитарных диагностикумов с антигеном вируса ИРТ КРС для постановки реакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации;
методические рекомендации по изучению культуральных, антигенных, генетических свойств и инфекционной активности производственных и эпизоотических штаммов вируса ИРТ КРС;
определение микробиоценоза кишечного тракта животных в норме и при дисбактериозах : рекомендации.
1.6. Методология и методы исследования. Методология проведенных
исследований включает стандартные процедуры с использованием различных
материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали
молекулярно-генетические, вирусологические, серологические, клинические,
эпизоотологические, физические и иммунологические методы исследований со
статистической обработкой данных.
1.7. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
разработка и совершенствование диагностических тест-систем для выявления генома и антител к вирусу ИРТ КРС;
мониторинговые исследования, клиническое проявление, состояние иммунитета и обменных процессов при различных формах течения инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в Республике Беларусь;
дрейф возбудителей вирусных и бактериальных болезней при формировании экологических ниш ассоциациями ИРТ со сходными по клиническому проявлению возбудителями инфекционных болезней телят;
новые подходы к изучению морфологии и генетической структуры штаммов вирусов ИРТ, входящих в биопрепараты для его профилактики на территории Евразийского экономического союза;
технологии изготовления вакцин нового поколения для профилактики ИРТ КРС;
способ активизации поствакцинального иммунитета с использованием пробиотических препаратов;
способ иммунотерапии ИРТ КРС с использованием штамма Bacillus licheniformis КМИЭВ-В202, имеющего участки генома вируса ИРТ;
новые подходы неспецифической профилактики и терапии животных, больных ИРТ КРС с использованием физических, пробиотических и энергетических способов и средств;
комплекс мероприятий по применению молекулярно-генетических, иммунологических и физических средств и методов для диагностики, профилактики и терапии респираторных, желудочно-кишечных и гинекологических болезней крупного рогатого скота, в этиологии которых ведущую роль играет вирус ИРТ.
1.8. Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины», ФГБУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины им. К.И.Скрябина», НТС Минсельхозпрода Республики Беларусь, Ветбиофармсовете Минсельхозпрода Республики Беларусь, 11 Московском Международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2003), на международных научно-практических конференциях: Исследования молодых ученых в решении проблем животноводства (Витебск, 2003); Актуальные проблемы ветеринарной медицины в условиях современного животноводства» (г. Минск, 2005); Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов : (Щелково, 2006); Современные технологии сельскохозяйственного производства (Гродно, 2007); Проблемы повышения эффективности производства животноводческой продукции (Жодино, 2007); Исследования молодых ученых в решении проблем животноводства (Витебск, 2008); Экология и инновации (Витебск : ВГАВМ, 2008); «Agricultura modern-realizri i perspective», посвящ. 75-летию аграр. ун-та Респ. Молдова. -Chiinu, 2008; Биоэкология и ресурсосбережение (Витебск, 2010); Инновационные технологии в животноводстве (Смоленск: ФГБОУ ВПО «Смоленская ГСХА», 2011); Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ( Щелково, 2012); Современные технологии сельскохозяйственного производства (Гродно, 2012); 5-й Конгресс Европейской Ассоциации Микробиологов (Лейпциг, 2013); Приоритеты развития АПК в современных условиях (Смоленск : ФГБОУ ВПО «Смоленская ГСХА», 2014); Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК (Щелково, - 2014); Актуальные проблемы биотехнологии в аграрно-промышленном комплексе : материалы (Минск, 2015); 6-й Конгресс Европейской Ассоциации Микробиологов (Маастрих, 2015) Инновационное развитие АПК: проблемы и перспективы (Смоленск : ФГБОУ ВПО «Смоленская ГСХА», 2015); Актуальные проблемы биотехнологии в аграрно-промышленном комплексе ( Минск, 2015); Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК (Армавир, 2016); Современные проблемы ветеринарной
патологии и биотехнологии в агропромышленном комплексе (Минск, 2017); Научные достижения Республики Беларусь (Минск, 2017); Знания молодых для развития ветеринарной медицины и АПК страны (СПб. : ФГБОУ ВО СПбГАВМ, 2017); Наука, образование, культура (Комрат, 2018).
Разработки новых вакцин, пробиотиков, терапевтических энергетических
средств, способов выращивания телят на Международной специализированной выставке Infoinvent-2013 (Кишинэу, Молдова, 2013), Международной выставке изобретений и инноваций (г. Тимишоара, Румыния, 2015 г.), Международной выставке изобретений (г. Клуи-Напока, Румыния 2015 г.), Международной выставке изобретений и инноваций г. Тимишоара, Румыния, 2018 г.) удостоены 6 Золотых медалей.
1.9. Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором
самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам кафедры
радиобиологии и вирусологии ФГБУ ВПО «Московская государственная академия
ветеринарной медицины им. К.И.Скрябина», НИИ прикладной ветеринарной
медицины и биотехнологии УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная
академия ветеринарной медицины», отдела вирусных инфекций РУП «Институт
экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского» за консультативную
помощь и содействие в выполнении отдельных этапов работы.
1.10. Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 76
научных работ, 13 из них в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства
образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций, 17 – в других
изданиях, 7 патентов, 5 монографий, 3 учебных пособий, 31 – в материалах
конференций, 7 методических рекомендаций и указаний.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 414 страницах, содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения. Диссертация содержит 74 таблиц и 42 рисунка. Список использованной литературы включает 403 источника. В приложениях представлены копии документов, подтверждающих достоверность и практическую значимость.