Моделирование стресса обезвоживания в культуре изолированных тканей пшеницы и его биологические последствия Тучин, Святослав Викторович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Реализация клеточных технологий в селекции на засухоустойчивость растений связана с использованием факторов, моделирующих стресс обезвоживания при их воздействии на культивируемые ткани. Однако, теоретические обоснования такого способа повышения засухоустойчивости сельскохозяйственных культур и первые опыты, проделанные в этом направлении, совершенно не затрагивают вопрос других биологических последствиях обезгожичания клеток для вегетпру-ющих растений, происходящих от них, з ряду половых поколений.

Более того, до настоящего зремени практически отсутствуют данные, демонстрирующие справедливость наиболее важного для обоснования теории селекции клеточных культур постулата - о существовании положительной корреляции между устойчивостью изолированных тканей к обезвоживанию и проявлением этого признака у растений в ввде способности сохранять урожай в условиях засухи.

Попытки экспериментального решения данной проблемы были предприняты в основном для двудольных растений, в результате которых было показано наличие такой коррелятивной связи. В то же время исследования на злаковых культурах, и особенно на пшенице, носят фрагментарный характер, не дают ответа на главный вопрос и совершенно оставляют без внимания ряд проблем, тесно связанных с ним.

Прежде всего это касается выбора наиболее эффективно действующего агента, способного в изолированной культуре адекватно моделировать стресс обезвоживания, отбирая устойчивые клетки, способные регенерировать растения с генетической устойчивостью к данному фактору, а также доз и сроков его воздействия на клеточные культуры, оценки экспрессии приобретенной устойчивости и ее трансмиссии в ряду половых пополений.

Кроме того, выяснение биологических закономерностей адаптации растений к обезвоживанию остается, по-прежнему, актуальной задачей для всех сельскохозяйственных видов-мезофитов, анатомически не приспособленных к сохранению воды, но особенно для пшеницы, ареал возделывания которой в Российской Федерации приходится в основном на зоны, периодически стпздающие от недостатка влаги и высоких температур.

Изучению влияния на пшеницу зтах главных лимитирующих факторов среды в засушливых регионах посвящено громадное количество исследований, выполненных с использованием всего арсенала средств, имеющихся в современной науке. Тем не менее, до настоящего времени не удалось создать целостную физиолого-генетическую модель признака засухоустойчивости, основанную на понимании биологических реакций растений, адекватно отражающих процессы адаптации и формирования урожая в условиях длительного обезвоживания тканей.

Во многом это связано с недостаточной проработанностью вопросов, касающихся роли клеточных механизмов в подобного рода реакциях пптс-

ницы на данный фактор внешней среды, что объясняется, прежде всего, методическими трудностями, возникающими при работе на клеточном уровне. Однако, значительный прогресс, достигнутый в разработке методов культивирования изолированных тканей пшеницы, открывает широкие перспективы для выяснения истинного значения клеточного компонента в формировании адаптивных реакций пшеницы в ответ на обезвоживание.

Цель исследования: ш.'чить влияние факторов, моделирующих обезвоживание in vitro, на поведение молекулярных маркерных систем, изолированных тканей и целостных растений пшеницы; изучить биологические последствия обезвоживания культивируемых тканей пшеницы; разработать научно обоснованные селективные схеиы дл:: отбора сомаклонов пшеницы с хозяйственно-ценными признаками и создать на этой основе исходный материал для селекции.

Задачи исследования:

1. Провести анализ использования методов культуры тканей и клеточной селекции для получения генотипов пшеницы, устойчивых к стрессорам;

2. Изучить влияние факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro - абсцизовой кислоты, Ь-азетидин-2-карбоновой кислоты и полиэти-ленгликоля, на интегральные характеристики процессов роста и развития тканевых культур и целостных проростков пшеницы. Установить дозовые зависимости биологического эффекта этих факторов и степень их соответствия для изолированных тканей и целостных растений.

3. С помощью молекулярных маркерных систем выяснить прігчиньї, синхронизирующие ответные реакции на обезвоживание, и показать последствие этого явления для культивируемых тканей пшеницы, затрагивающие молекулярный уровень. Привести доказательства трансмиссии молекулярных изменений от клеточных культур, подвергнутых обезвоживанию, в половые потомства растеннй-регенерантов.

4. На основе принципов молекулярно-экологической концепции разработать теоретический подход к отбору клеточных культур пшеницы, устойчивых к стрессу обезвоживания. Выяснить эффективность различных селективных схем для отбора засухоустойчивых сомаклонов пшеницы и получить формы, экспрессирующие этот признак в половых поколениях.

5. Изучить в лабораторных опытах и полевых испытаниях полученные сомаклопы пшеницы и установить биологические последствия обезвоживания изолированных тканей на вегетирующих растениях. Создать коллекцию сомаклонов с хозяйственно-ценными признаками, пригодную для использования в селекции.

6. Оценить перспективы и направления использования молекулярно-экологической концепции для создания методами клеточной селекции устойчивых к обезвоживанию форм пшеницы и возможность ее применения для оценки адаптивности селекционного материала.

Научная новизна. Впервые показано, что ингибирующее влияние низкого химического потенциала воды на процессы роста и развития клеточ-но-тканевых систем пшеницы подчиняется закономерностям функционирования биологического триггера. На основатш этого предложен подход к установлению эффективной дозы селективного давления для получения засухоустойчивых форм пшеницы.

Доказана целесообра"ность одноступенчатого отбора каллусных культур на средах с предельно низким химичєсі.і:м потенциалом воды, который обеспечивает оптимальное соотношение между частотой мутацій, возшгслклцих в культивируемых клетках, и способностью каллусных кул* -тур к регенерации растений.

Э'ллктрименталъно установлено, что культивирование изолир.ж , т;.мх тканей пшеницы на средах с низким химическим потенциалом воды сопряжено с проявлением наследуемых изменений в структурно-функциональных свойствах полиморфных белковых систем. При этом частота мутаций по глиадикодирующим локусам в выборке сомаклонов коррелирует со степенью снижения химического потенциала воды в среде культивирования изолированных тканей, а наиболее подвержены изменениям гли-адинкодирующие локусы генома D.

Показано, что адаптация к обезвоживанию изолированных клеток на уровне различных белковых систем осуществляется в направлении повышения структурной жесткости макромолекул.

Впервые обнаружено, что подавляющая часть сомаклонов, устойчивых на стадии каллусных культур к низкому химическому потенциалу воды, несет мутацию, редуцирующую длину главного побега растений, и в зависимости от генотипа пшеницы, служившего донором культивируемых тканей, - мутацию, повышающую устойчивость сомаклонов к бурой ржавчине.

Анализ большого числа сомаклонов, отобранных in vitro на устойчивость к обезвоживанию, выявил у них натичие изменений и по другим морфологически и физиологическим признакам, которые наследуются в ряду половых поколений.

Получены растения пшеницы с повышенной засухоустойчивостью, проявляющейся в стабилизации химического потенциала воды в тканях и сохранении бносинтетической активности в условиях недостатка влаги, чте реализуется - более высокой урожайности сомаклонов по сравнению с пи ходным сортом.

Впервые обнаружено влияние обезвоживания изолированных клеток пшегащы гибридного происхождения на частоту проявления качественных признаков в расщепляющихся поколениях сомаклонов.

Создана коллекция сомаклонов (около 1000 номеров), представляющая интерес как для включения в селекционные программы, так и для использования в научных целях.

~j

Основные положения, выносимые на защиту:

7. Доказательства существования у пшеницы биологического триггера, контролирующего ответные реакции на воздействие факторов, моделирующих стресс обезвоживания in vitro - абсцизовой кислоты, L-азете-дин-2-карбоновой кислоты и пониженного химического потенциала воды в среде.

8. Анализ селективных схем, используемых для отбора устойчивых к обезвоживанию сомаклонеи пшеницы, с іплщий молекулярно-экологи-ческой концепции и триггерного механизма адаптации растений к стрессорам. Данные о преимуществах одноступенчатой схемы отбора каллус-т.'х культур при использовании низкого химического потенциала воды в качестве селективного фактора и ауксина, как индуктора калл%сооб;азо-вания.

9. Потенцирующий эффект низкого химического потенциала воды в среде на частоту мутаций в культивируемых клетках пшеницы. Множественный характер молекулярно-генегическнх и фенотипнческих изменений, выявляемых у сомаклонов, отселектированных в стадии изолированных клеточных культур под воздействием данного фактора. Наследование мутаций, возникающих в культивируемых клетках, устойчивых к обезвоживанию.

10. Экспрессия засухоустойчивости в растениях - половых потомках регенерантов, полученных из каллусных культур, устойчивых к обезвоживанию, связана с повышением урожайности сомаклонов при засухе и изменениями термодинамических параметров воды в растениях.

Апробация полученных результатов и практическая значимость работы связана с реализацией способов получения наследственно измененных форм пшеницы, оформленныхв виде двух изобретений (А.с. СССР № 1738171А1 и патент РФ № 2095971). На основе указанных изобретений создан исходный материал для селекции, который используется в селекционных программах лаборатории селекции и семеноводства яровой мягкой пшеницы НИИСХ Юго-Востока и Ершовской опытной станции.

Коллекция сомаклонов, насчитывающая около 1000 образцов яровой мягкой пшеницы, содержит формы с новыми генетическими элементами, детерминирующими длину стебля растения, окраску растения, устойчивость к бурой ржавчине, качество клейковины зерна, длину вегетационного периода и другие признаки. Указанные формы используются в генетических и физиологических исследованиях в НИИСХ Юго-Востока и ВИЗРе.

Методические исследования в области совершенствовашія способов культивирования изолированных пыльников пшеницы реализованы в виде создания дигаплоидиого сорта яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 (патент РФ на селекционное достижение № 0344), районированного с 2000 года по Саратовской области.

Практической ценностью для биотехнологических исследований обладают полученные доказательства преимущества использования корот-

ких селективных схем для отбора in vitro стрессустойчивых сомаклонов. При этом предложен научно обоснованный подход к определению дозы воздействия селективного фактора.

Данные о превалирующем значении химического потенциала воды, выступающего в роли сигнала для переключения биологического триггера при адаптации растений к обезвоживанию, открывают широкие возможности для построения прогностических моделей, предназначенных для повышения эффективности отбора засухоустойчивых форм в процессе проработки гибридного селекционного материала.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные материалы, представленные в диссертации, получены при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством. В изучении проростковых генов устойчивости к бурой ржавчине у сомаклонов пшеницы принимала участие научный сотрудник лаборатории микологии и фитопатолопш Всероссийского института защиты растений Е.И. Гультяева.

Связь работы с крупными научными программами. Данная работа выполнялась с 1986 г. в соответствіга с международной программой КП НТП СЭВ по пятому приоритетному направлению «Ускоренное развитие биотехнологии», программой ВРО ВАСХНИЛ и Россельхозакадемии «Биотехнологаческие основы интенсификации селекционного процесса культурных растений и животных», гранта Министерства науки и технологий РФ по направлению 050, проект № 13 «Стрессы растений».

Опубликованность результатов. Основные положения работы представлялись на многих научных конференциях, совещаниях и симпозиумах, среди которых можно выделить: Международный симпозиум «Клеточные и генные биотехнологии для зерновых злаков» (Алма-Ата, 1989), I Всесоюзный симпозиум «Новые методы биотехнологии растений» (Пущино, 1991), II Российский симпозиум «Новые методы биотехнологии растений» (Пущино, 1993), I съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), V Международная конференцій по пшенице (Анкара, 1996), Международная научная конференция «Развитие научного наследия академикаН.И. Вавилова» (Саратов, 1997). Пятая международная конференция «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1999), Международная конференция «Физиология растений - наука III тысячелетия (IV съезд общества физиологов растений России, Москва, 1999).

Результаты, полученные при выполнении данной диссертации, в совокупности опубликованы в 51 научных работах, в том числе в 27 научных статьях в международных и центральных журналах и сборниках, 2 патентах и 1 авторском свидетельстве на изобретение и 21 тезисах в материалах конференций, съездов и симпозиумов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 281 страницах машинописного текста и состоит из 9 глав, разделенных на подплавы и содержащих 72 таблицы и 35 рисунков, введения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, состоящего из 329 источников, включая 142 иностранных.