Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Технология получения холерной химической вакцины и математическое моделирование процессов микробиологического синтеза 11
1.1.1 Технология получения холерной химической вакцины 11
1.1.2 Математическое моделирование процессов микробиологического синтеза 15
1.2 Обзор технологий и аппаратурного оформления процессов изготовления твердых лекарственных форм 27
1.2.1 Таблетированные вакцины 27
1.2.2 Прямое прессование и гранулирование в технологиях твердых лекарственных форм 31
1.2.3 Вспомогательные вещества для формирования твердых лекарственных форм 42
1.2.4 Оборудование для нанесения покрытий на таблетки 46
1.2.5 Виды пленочных покрытий и особенности их нанесения на таблетки 52
1.3 Заключение по обзору литературы 60
2 Экспериментальная часть 62
2.1 Материалы и методы исследований 62
2.1.1 Материалы 62
2.1.2 Методы исследований 63
2.1.2.1 Биологические методы 63
2.1.2.2 Физико-химические, физические и биохимические методы 66
2.1.2.3 Статистическая обработка результатов 69
2.2 Результаты исследований и их обсуждение
2.2.1 Математическое моделирование процессов микробиологического синтеза протективных антигенов холерного вибриона 70
2.2.1.1 Модель процесса синтеза О-антигена Vibrio cholerae М-41 Огава 71
2.2.1.2 Модель процесса синтеза токсина и О-антигена Vibrio cholerae 569В Инаба 76
2.2.1.3 Разработка программ для ЭВМ 81
2.2.1.4 Апробация результатов моделирования при культивировании Vibrio cholerae М-41 Огава и Vibrio cholerae 569В Инаба 92
2.2.2 Совершенствование процессов изготовления твердой лекарственной формы вакцины холерной бивалентной химической таблетированной 99
2.2.2.1 Проведение исследований по гранулированию компонентов холерной химической вакцины 99
2.2.2.1.1 Оценка возможности применения метода гранулирования в псевдоожиженном слое с существующим компонентным составом таблеточной смеси 99
2.2.2.1.2 Разработка нового состава вспомогательных веществ и экспериментальное обоснование оптимальных технологических параметров проведения влажной грануляции в псевдоожиженном слое 115
2.2.2.2 Выбор оптимальных технологических режимов нанесения пленочного покрытия 128
2.2.3 Характеристика холерной вакцины, полученной по разработанным технологическим решениям 139
3 Выводы 144
4 Список использованных источников 146
- Математическое моделирование процессов микробиологического синтеза
- Вспомогательные вещества для формирования твердых лекарственных форм
- Физико-химические, физические и биохимические методы
- Проведение исследований по гранулированию компонентов холерной химической вакцины
Математическое моделирование процессов микробиологического синтеза
При применении коутера О Нага 30" Pan: масса таблеток - 40 кг; температура входящего воздуха - 46 С; расход воздуха, поступающего в бара-бан - 935 м /ч; давление атомизации - 3,0 бар, распыла - 2,8 бар; скорость подачи напыляемого раствора - от 115 до 120 г/мин; скорость вращения барабана - 8 об/мин.
При применении коутера О Нага 48" Pan: масса таблеток - 140 кг; температура входящего воздуха - 53 С; расход воздуха, поступающего в бара-бан - 2600 м /ч; давление атомизации - 2,8 бар, распыла - 2,1 бар; скорость подачи напыляемого раствора - 350 г/мин; скорость вращения барабана - 6-8 об/мин.
При применении коутера Accela-Cota 150: масса таблеток - 120 кг; температура входящего воздуха - 53 С; расход воздуха, поступающего в ба-рабан - 2600 м /ч; давление атомизации - 3,0 бар, распыла - 2,6 бар; скорость подачи напыляемого раствора - 320 г/мин; скорость вращения барабана - 7 об/мин.
При применении коутера Accela-Cota 60 DXL: масса таблеток - 360 кг; температура входящего воздуха - 54 С; расход воздуха, поступающего в ба-рабан - 6800 м /ч; давление атомизации - 3,6 бар, распыла - 3,0 бар; скорость подачи напыляемого раствора - (550±50) г/мин; скорость вращения барабана - от 3,5 до 4,5 об/мин.
Можно привести ряд данных о технологических аспектах применения покрытия Acryl-EZE, доступные на сайте производителя. При обосновании количественных показателей теста «распадаемость» были применены следующие параметры процесса нанесения покрытия 20 % раствора Acryl EZE на 1 кг 20 мг таблеткок плацебо и омепразола в коутере О Нага LabCoat I: нанесение оболочки до 12 % увеличения массы таблеток: температура входящего воздуха - от 37 до 40 С, что позволило поддерживать температуру продукта ЗО С; скорость подачи напыляемого раствора - (9,5±0,5) г/мин; давление атомизации и распыла - 0,21 МПа; скорость вращения барабана - 20 об/мин; расход воздуха, поступающего в барабан - 80 м /ч [166]. Исследования качества таблеток показало на их соответствие требованиям теста «распадае-мость».
При исследовании процесса нанесения покрытия Acryl-EZE на 40 кг 325 мг таблетки аспирина в коутере О Нага Labcoat II исследователями были рекомендованы следующие характеристики: нанесение оболочки до 8 % увеличения массы таблеток: температура продукта - 30 С; скорость подачи напыляемого раствора - от 115 до 120 г/мин; давление атомизации - 3,0 бар, распыла - 2,8 бар; скорость вращения барабана - 8 об/мин; расход воздуха, поступающего в барабан - 945 м /ч [136].
При сравнении эффективности двух кишечно-растворимых покрытий Sureteric и Acryl-EZE в условиях промышленного производства было исследовано влияние различного количества покрытия на 81 мг таблетки аспирина. Препараты с нанесенной оболочки до 5, 6, 7, 8, 9 и 10 % увеличения массы таблеток успешно выдержали испытания по тестам «растворимость» и «распадаемость» [168].
Нанесение оболочки Acryl-EZE на таблетки 200 мг ибупрофена, 500 мг ацетомефина, и 50 мг диклофенака до 8 % увеличения массы производили на 15 кг таблеток в коутере с 24-дюймовым барабаном при следующих параметрах: температуры входящего и выходящего воздуха - 55 С и 33 С; температура продукта 30 С; скорость подачи напыляемого раствора - 60 г/мин; давление атомизации и распыла - 2,4 бар; скорость вращения барабана - 12 об/мин; расход воздуха, поступающего в барабан - 425 м /ч [137].
Кроме данных производителя Acryl-EZE, исследователями при разработке технологии нанесения покрытия на таблетки предложены различные характеристики процесса. Так, индийскими учеными при разработке нового состава вспомогательных веществ таблеток эзомепразола были исследованы различные концентрации нанесения покрытия Acryl-EZE - от 6 до 12 %. Было показано, что все таблетки проходят испытания по тестам «растворимость» и «распадаемость», при этом прибавка массы таблеток после прохождения последнего испытания составляла от 3,06 до 4,43 %, что свидетельствует о хорошем качестве покрытия [161].
При обосновании состава вспомогательных веществ 100 мг таблеток эзомепразола в качестве кишечно-растворимого покрытия использовался 25 % водный раствор Acryl-EZE. Процесс нанесения покрытия осуществлялся в коутере Neocoata coating pan. Покрытие наносили до (9±1) % увеличения массы таблеток. Характеристики процесса: температура входящего воздуха -(51±1) С, что позволило поддерживать температуру продукта от 28 до 30 С; скорость подачи напыляемого раствора - 10 мл/мин; давление атомизации и распыла - от 0,15 до 0,21 МПа; скорость вращения барабана - 22 об/мин; расход воздуха, поступающего в барабан - 85 м /ч; время процесса - от 70 до 90 мин [156].
Бразильскими учеными при исследовании возможности применения нового состава вспомогательных веществ таблеток ибупрофена (200 мг) в качестве кишечно-растворимого покрытия использовался 20 % водный раствор Acryl-EZE. Нанесение оболочки до 8 % увеличения массы таблеток производили в коутере с двенадцатидюймовым барабаном при его вращении с числом оборотов в минуту, равным 12. Масса таблеток составила 1 кг. Температура входящего и выходящего из коутера воздуха составляла (60±5) С и от 35 до 40 С соответственно. Давление воздуха было (1,6±0,1) бар [127].
Вспомогательные вещества для формирования твердых лекарственных форм
Продуцентами антигенов являлись штаммы V. cholerae 569 В серовара Инаба и V. cholerae М-41 серовара Огава, относящиеся к 2 группе патогенно-сти. При испытаниях вакцины на иммуногенность применяли вирулентные штаммы V. cholerae eltor 879-М серовара Инаба и V. cholerae eltor 3122-Р серовара Огава.
Состав питательной среды, используемой для культивирования холерных вибрионов, был следующий: бульон из ферментативного перевара казеина с содержанием аминного азота - 200 мг%; Na2HP04 - 0,06 %; NaCl - 0,5 %; пептон - 1 %. В качестве источника углеводного питания микроорганизмов применяли 40 % раствор глюкозы. Значение рН корректировали 10 % раствором аммиака.
Применялись лиофилизаты холерогена-анатоксина штамма V. cholerae 569В серовара Инаба, О-антигена штамма V. cholerae 569В серовара Инаба и О-антигена штамма V. cholerae М41 серовара Огава, полученные по производственной технологии приготовления холерной химической вакцины. В экспериментах по гранулированию использовались следующие вспомогательные вещества: лактозы моногидрат (Applichem, Германия), соответствующий требованиям Фармакопеи США; целлюлоза микрокристаллическая марки Comprecel (Mingtai Chemical, Тайвань), соответствующая требованиям Европейской, Британской и Японской Фармакопеи; поливинилпирролидон (Plasdone К-90) производства ISP, Швейцария, соответствующая требованиям Европейской Фармакопеи.
Нанесение покрытия на таблетки осуществляли кишечно-растворимым покрытием Acryl-EZE 93A (Colorcon, Великобритания).
Испытания на иммуногенность, микробиологическую чистоту, токсичность и антигенную активность осуществляли в соответствии с фармакопейной статьей предприятия [15].
При определении иммуногенности {ЕДы) в качестве биомоделей использовали белых беспородных мышей массой от 10 до 12 г. Иммунизацию мышей дозами по 0,5 мл, соответствующими 1:1000, 1:5000, 1: 25000, 1:125000 доли таблетки, по 16 животных для каждой дозы, проводили внут-рибрюшинно. Заражение иммуннизированных мышей осуществляли спустя 2 недели после иммунизации штаммами V. cholerae М-879 серовара Инаба и V. cholerae Р-3122 серовара Огава дозой 300 LD50. Мышей контролировали на протяжении 72 ч, учитывая количество павших. LDso заражающих штаммов определяли на 25 мышах для каждого штамма, используя 5 групп животных с равным количеством. Заражение проводили внутрибрюшинно, используя культуры штаммов V. cholerae М-879 серовара Инаба и V. cholerae Р-3122 серовара Огава после их роста в течение (4±1) ч на плотной питательной среде и разведенные до концентрации 6 м.к., 12 м.к., 24 м.к., 48 м.к. и 96 м.к. в 1 мл. Для контроля проводили заражение по 10 неиммунизированных мышей этими же штаммами холерного вибриона. Значения ЕД$о холерной вакцины и ЬД о заражающих штаммов определяли согласно метода Кербера-Ашмарина [6]:
Контроль токсичности осуществляли путем подкожного введения 10 белым мышам по 0,5 мл физиологического раствора 1/160 части таблетки. Животных контролировали на протяжении 7 сут. Препарат считали нетоксичным, если животные оставались живыми, без видимых признаков заболевания и масса каждой мыши в день окончания наблюдения была не меньше исходной.
Специфическую безопасность определяли путем внутрикожного введения взрослым кроликам растворов таблеток. Три таблетки ресуспендировали в 75 мл 0,9% раствора натрия хлорида, брали 0,1 мл суспензии и добавляли 0,9% раствор натрия хлорида, получая конечные разведения 1:4000, 1:6000, 1:8000. Двум кроликам проводили внутрикожную инъекцию каждого разведения в объеме, равным 0,1 мл. Контроль осуществляли через одни сутки. Вакцина признавалась прошедшей испытания, при диаметре отечной реакции не больше (7,5±2,5) мм в разведении, не превышающем 1:6000.
Исследование антигенной активности по анатоксиносвязыванию проводили с использованием 3 таблеток. Из предварительно размельченной смеси таблеток получали пять разведений препарата (от 1000 до 3500). К 0,2 мл каждого разведения вносили 0,2 мл отраслевого стандартного образца анти-холерогенной сыворотки, с активность равной 80 антитоксических единиц. После экспозиции растворов при (37±1) С в течение 30 мин вносили по 0,4 мл отраслевого стандартного образца токсина холерного в каждое разведение, снова выдерживая реакционную смесь в течение 30 мин при (37±1) С. Полученными дозами препарата (разведения от 4000 до 14000) делали внут-рикожную инъекцию двум кроликам, приступая с минимального разведения. Спустя одни сутки регистрировали отечную область на коже, где отмечалась реакция от 5 до 10 мм, одинаковая с отечной областью в ряду служащим для контроля, где одна опытная доза холерного тест-токсина была соединена с одной антитоксической единицей сыворотки антихолерогенной.
Микробиологическую чистоту вакцины определяли с использованием раствора растертых в ступке с 20 мл физиологического раствора 5 таблеток. Полученную смесь в количестве по 0,2 мл рассевали на 5 чашек Петри с мя-сопептонным агаром, содержащим (4±1) % крови; 10 чашек Петри с мясо-пептонным агаром и 1 мл добавляли в 50 мл 10 % желчного бульона. Посевы выдерживали на протяжении 48 ч при (37±1) С. Через 48 ч пробы с желчного бульона в количестве 0,2 мл рассевали на 5 чашек Петри с агаром Эндо и выдерживали на протяжении 48 ч при (37±1) С. Наличие или отсутствие роста микроорганизмов осуществляли макроскопически.
Физико-химические, физические и биохимические методы
Насыпная плотность (до/после утряски) всех трех компонентов была определена на уровне от 0,035 до 0,038/от 0,043 до 0,047 г/см . Соответственно коэффициенты сжимаемости и Хауснера составляли от 18,6 до 19,2 и от 1,29 до 1,09. Значение текучести было равно 0. Величина угла естественного откоса составляла (67±1), что также свидетельствует о крайне низкой сыпучести [111]. Остаточная влажность колебалась от 1,1 до 1,9 %. Все порошки хорошо растворялись в воде.
Можно сделать вывод, что лиофилизированные компоненты вакцины являются аморфными порошками (рисунки 19-21) с значительным разбросом значений по фракционному составу, при этом очень большое количество лиофилизатов находится в виде пыли. Это обуславливает неудовлетворительные для получения таблеток значения таких технологических характеристик, как сыпучесть, насыпная плотность, угол естественного откоса, коэффициенты сжимаемости и Хауснера. Вышесказанное обуславливает необхо 102 димость проведения исследований по гранулированию компонентов таблеточной смеси. Гранулирование «плацебо»
Для оценки возможности применения метода гранулирования в псев-доожиженном слое с существующим компонентным составом таблеточной смеси было принято решение на первоначальном этапе провести исследования без использования активных лекарственных компонентов - холерогена-анатоксина и О-антигенов, заменив их на сахарозу.
Гранулирование проводили на аппарате GPCG 2 LabSystem, реализующем гранулирование материалов методом псевдоожиженного слоя с подачей связующего вещества сверху (рисунок 22). Данная установка позволяет регулировать и контролировать следующие параметры: расход и температуру воздуха для псевдоожжижения; расход воздуха на форсунку для создания направленного движения аэрозоля связующего вещества; расход связующего вещества; режим работы улавливающих технологических фильтров (периодичность и время встряхивания). Имеется возможность контроля ряда характеристик: давление воздуха на входе и выходе грануляционного контейнера; влажность воздуха, подаваемого на псевдоожжижение; температура гранулируемой смеси; температура воздуха на выходе из грануляционного контейнера.
Существующая рецептура таблеток содержит два вспомогательных вещества, предназначенных для улучшения скольжения, препятствования прилипания к пресс-инструменту, оказания смазывающего действия и улучшения текучести таблетируемых смесей с очень высокой концентрацией: до 6 % тальк и 6 % стеарат кальция. Общепринятая концентрация этих средств для таблетирования составляет (1,5±0,5) % талька и (0,75±0,25) % стеарата кальция. Поэтому для реализации экспериментов по гранулированию мы разместили общепринятую концентрацию этих компонентов в «Исходные твёрдые материалы» (смесь подвергаемая гранулированию) и остаток в «Внешнюю фазу» (вещества добавляемые при таблетировании). Качественно-количественный состав таблеточной смеси представлен в таблице 6.
Кроме того, проверяли возможность поддержания температуры гранулируемого продукта на этапах производственного процесса в пределах от 20 до 35 С, так как холероген-анатоксин является термолабильной субстанцией.
Три испытания по гранулированию (серии №№ 1-3) были проведены с размером партии 1,22 кг при использовании в качестве исходного материала смеси порошка сахарозы с кукурузным крахмалом, тальком и стеаратом кальция (состав указан в таблице 6). Порошок сахарозы представляет собой очень мелкозернистый материал, который можно сделать текучим при не-большом объеме поступающего воздуха порядка 15 м /ч. Регулирование такого малого объема поступающего воздуха с высокой точностью весьма затруднительно. При небольшом увеличении объема поступающего воздуха во время автоматического регулирования может произойти выдувание исходного твердого материала на фильтр задержки продукта в первые минуты распыления жидкости (сухое состояние порошка). Вследствие этого мелкозер 105
нистый порошок налипает на фильтр и не стряхивается с него, что приводит к уменьшенному выходу продукта в производственном процессе.
Ожидалось, что мелкозернистая порошковая сахароза с ее высокой растворимостью в воде будет проявлять выраженную тенденцию к слипанию. Обычно для такого исходного сырья не требуется никаких связующих веществ. Испытание гранулирования в первой серии проводили, используя в качестве распыляемой жидкости очищенную воду без связующего вещества. Жидкость распылялась с нарастающим расходом (от 2,5 до 5,4 г/мин) при давлении распыляющего воздуха 2,5 бар. Наблюдаемая температура продукта составляла от 26,3 до 22,9 С. Материал образовывал рыхлые агломераты размером в несколько сантиметров. Эти агломераты были очень хрупкими, и их можно было измельчать вручную, но не напором поступающего воздуха. После добавления 190,3 г очищенной воды никакого дополнительного псевдоожижения материала уже не наблюдалось. Выход гранул составил 69,0 %, поскольку мелкозернистый материал, часть которого имела низкую плотность, был обнаружен на фильтре (несмотря на небольшой объем поступаю-щего воздуха 15 м 1ч). Распределение размера частиц в материале, по-прежнему, соответствовало очень мелкой зернистости. Был сделан вывод о том, что в серии № 1 имело место неадекватное гранулирование.
Проведение исследований по гранулированию компонентов холерной химической вакцины
Следующим этапом исследований было определение необходимого количества Acryl-EZE нанесенного на таблетки, при котором обеспечивается успешное испытание таблетки по тесту «растворимость». Испытания подвергали таблетки с нанесенным покрытием до 2, 4, 6, 8 и 10 % увеличения массы таблеток.
На рисунке 28 показано изменение кишечно-растворимого покрытия (2 %) через разные промежутки времени.
Анализируя данные рисунка 28, можно говорить о том, что первые видимые изменения нарушения целостности 2 % покрытия обнаруживаются через 15 мин с начала проведения теста. Через 60 мин таблетка подлежит выбраковке. Что касается 4 % покрытия, то первые изменения оболочки зафиксированы через 25 мин, через 80 мин таблетка имела вид, представленный на рисунке 22, г. Таблетки с 6 % покрытия через 150 мин имели повреждения оболочки как на рисунке 22, в, а через 200 мин - как на рисунке 22, г. Что ка 131 сается 8 % и 10 % покрытия то они не имели видимых повреждений через 220 мин теста (время наблюдения). Таким образом, целесообразно нанесение покрытия Acryl-EZE до 8 % увеличения массы таблеток. факторный эксперимент. В качестве основных факторов, влияющих на проведение процесса, были выбраны: расход раствора пленочного покрытия; давление воздуха, подаваемого на форсунку; масса таблеток; расход воздуха, подаваемого в коутер. Неисследуемыми факторами, которые были постоянны во всех вариантах проведения эксперимента, являлись: давление сжатого воздуха, подаваемого на форсунку для атомизации -1,4 бар; число оборотов барабана - (П±1) об/мин; содержание сухих веществ в водном растворе Acryl-EZE (использовался 20 % раствор). В качестве критерия оптимизации было принято увеличение массы таблеток, при этом раствор пленочного покрытия наносился до максимального теоретического увеличения массы таблеток, равного 8 %. Уровни варьирования факторов и матрица планирования полного факторного эксперимента с его результатами представлены в таблицах 17,18.
Коэффициент при X] положителен. Это значит, что с увеличением этого фактора увеличивается значение параметра оптимизации, т.е. увеличивается масса таблеток. Коэффициенты при Х2 и Х4 отрицательны, это означает, что с уменьшением факторов Х2 и Х4 значение параметра оптимизации будет возрастать, а с увеличением - убывать. Основываясь на том, что близкие к оптимуму значения параметров процесса нанесения покрытия определены в 11 варианте эксперимента (7,9 %) было принято решение не проводить дальнейшую их оптимизацию по плану «крутого восхождения». Таким образом, оптимальные технологические режимы нанесения пленочного покрытия на таблетки будут следующие: давление воздуха на форсунку для распыления и атомизации - 1,0 и 1,4 бар соответственно; расход подаваемого раствора Acryl-EZE - (8,3±0,1) мл/мин; число оборотов барабана - (П±1) об/мин; рас-ход и температура воздуха подаваемого на сушку - от 50 до 55 м /ч и от 40 до 45 С соответственно (это позволило поддерживать температуру таблеток в пределах от 32 до 34 С).
Нанесенное покрытие давало прибавку массы до 8 %, средняя масса таблетки составила (305,8±0,8) мг, что соответствовало требованиям фармакопейной статьи на препарат. Гладкое и равномерное желтое пленочное покрытие закрывало все кромки таблеток, что существенно улучшило ее внешний вид (рисунок 29).
В результате определения распадаемости было выявлено: при выдерживании в децимолярном растворе соляной кислоты в течение 3 ч каждая таблетка вакцины сохраняла форму и оболочку; при воздействии децимолярном растворе натрия гидроксида в течение (32,5±0,5) мин таблетки распада 137 лись до рыхлой массы, без сохранения оболочки. Полученные результаты соответствовали требованиям фармакопейной статьи на препарат.
Дополнительно исследовали впитываемость таблеткой жидкости, хотя это и не является нормируемым показателем. Для этого таблетки, после проведения теста на распадаемость, обсушили и взвесили. Масса таблетки, в среднем, составила (323,3±0,5) мг, что дало прибавку 5,7 %. При этом необходимо отметить, что предельное значение данного показателя в практике производства, хотя это и не является нормируемой величиной, составляет, по разным источникам, от 5 до 10 %. Полученные данные свидетельствует о хорошем качестве кишечно-растворимого покрытия.
Представляло определенный научно-практический интерес исследование динамики процесса впитывания таблеткой раствора соляной кислоты. Полученные данные представлены на рисунке 30, и они свидетельствуют о том, что изменение массы таблеток до величины, превышающей 10 %, составило: для таблетки с новым покрытием - 5,5 ч, для таблетки с традиционным покрытием - между 2,0 и 2,5 ч.