Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .11
1.1 Антибиотики – определение, общее представление об их роли,
продуцентах и проблеме поиска новых веществ 11
1.2 Антибиотики, продуцируемые микроскопическими грибами 15
1.3 Грибы, образующие соединения с антимикотической активностью .22
1.4 Нерибосомальные антимикробные пептиды грибов с антифунгальной активностью и антибиотики на их основе 26
1.5 Подходы скрининга и идентификации грибных антибиотиков .45
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 56
2.1 Объекты 56
2.2 Методы исследований .58
2.2.1 Методы выделения чистых культур грибов 58
2.2.2 Оценка антимикотической активности микромицетов и первичный отбор штаммов 59
2.2.3 Проверка продукции штаммами антигрибных соединений в жидкой среде и вторичный отбор штаммов с высокой антибиотической активностью 60
2.2.3.1 Оценка антибиотической активности методом дисков .60
2.2.4 Молекулярно-генетическая идентификация выделенных штаммов, активных продуцентов антибиотических веществ 62
2.2.5 Определение спектра усваиваемых соединений активными продуцентами антимикотиков 64
2.2.6 Оптимизация выхода антибиотика для штамма Trichoderma сitrinoviride ВКПМ F-1228 .65
2.2.7 Выделение и изучение свойств антибиотических веществ, продуцируемых штаммом T. сitrinoviride ВКПМ F 1228 .67
2.2.8 Определние токсичности активной фракции штамма T.сitrinoviride ВКПМ F-1228 71
2.2.9 Определение цитотоксической активности активной фракции T. сitrinoviride ВКПМ F-1228 72
2.2.10 Обработка данных и повторности 73
ГЛАВА 3. Распространенность среди микроскопических грибов способности к образованию антимикотиков и отбор активных продуцентов .74
3.1 Общая оценка антимикотической активности грибных культур .74
3.2 Антимикотическая активность микроскопических грибов, выделенных из почв различных природных зон
3.3 Антимикотическая активность микроскопических грибов из разных экотопов 76
3.4 Антимикотическая активность микроскопических грибов различных таксонов отдела Ascomycota .79
ГЛАВА 4. Отбор активного продуцента антимикотиков
4.1 Оценка способности к синтезу антимикотиков у наиболее активных культур микромицетов в жидкой среде .84
4.2 Характеристика спектра антибиотической активности и утилизации соединений у отобранных штаммов рода Trichoderma
4.3 Оптимизация условий культивирования штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 – продуцента антимикотических веществ 93
4.4 Оптимизация содержания С и N в среде для накопления антибиотиков T. citrinoviride ВКПМ F-1228 методом полнофакторного эксперимента .96
ГЛАВА 5. Выделение, идентификация и характеристика антибиотического комплекса T. сitrinoviride ВКПМ F-1228 .102
5.1. Спектр антимикробной активности экстрактов T. сitrinoviride ВКПМ F-1228 102
5.2 Очистка и разделение антибиотического комплекса и оценка токсичности T. сitrinoviride ВКПМ F-1228 10
4 5.3 Антимикробная активность пептаиболов T. citrinoviride ВКПМ
F-1228 110
Глава 6. Лабораторный регламент получения комплекса антимикотических веществ - пептаиболов из T. citrinoviride ВКПМ F 1228 114
6.1 Область применения .114
6.2 Характеристика препарата 114
6.3 Субстраты и материалы 115
6.4 Технология и экономические затраты на производство препарата в лабораторных условиях 117
6.4.1 Стадия подготовки .119
6.4.2 Ферментационная стадия .120
6.4.3 Стадия выделения и очистки .120
6.4.4 Побочные продукты .
6.5 Экономические затраты 124
6.6 Технические требования .125
6.7 Упаковка и маркировка .126
6.8 Требования безопасности .126
6.9 Приемка 1 6.10 Методы контроля .127
6.11 Хранение 130
Заключение .131
Выводы .134
Список используемой литературы .
- Грибы, образующие соединения с антимикотической активностью
- Проверка продукции штаммами антигрибных соединений в жидкой среде и вторичный отбор штаммов с высокой антибиотической активностью
- Антимикотическая активность микроскопических грибов, выделенных из почв различных природных зон
- Характеристика спектра антибиотической активности и утилизации соединений у отобранных штаммов рода Trichoderma
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ограниченное число антимикотиков, их довольно высокая
стоимость и токсичность, возникновение резистентных форм возбудителей, ухудшение
экологической обстановки и снижение защитного статуса иммунной системы у
пациентов приводит к серьезным проблемам в лечении многих болезней
существующими лекарственными препаратами, в частности, рост заболеваемости
глубокими (инвазивными) микозами. Они характеризуются высокой смертностью и
тяжестью течения, и все чаще вызываются резистентными формами патогенных и
условно-патогенных микроорганизмов (Schmitt et al, 2015). Поэтому необходимо
постоянное совершенствование и разработка новых лекарственных средств, которые
были бы более эффективны, менее токсичны и способны преодолевать
резистентность микробных возбудителей к антибиотикам. Кроме того,
онкологическим заболеваниям часто сопутствует развитие микозов, в связи с этим перспективно наличие у новых антимикотиков способности ингибировать рост опухолевых клеток.
Микроскопические грибы, и особенно порядков Eurotiales и Hypocreales,
представляют особый интерес как продуценты антигрибных антибиотиков. Широко
известны штаммы Penicillium chrysogenum, Tolypocladium inflatum, на основе которых
созданы антибактериальные препараты и иммуносупрессоры, совершившие
революцию в медицине. Среди этих таксонов микромицетов выявлены штаммы –
продуценты антибиотиков, подавляющих дрожжевые и мицелиальные грибы
(Penicillium nigricans - гризеофульвина, Aspergillus aculeatus и A. nidulans -
эхинокандинов, Emericellopsis salmosynnemata - зервамицина IIB) (Егоров, 2004; Abid
et al., 2014; Berdy, 2012). Новые антимикробные соединения недавно были
обнаружены среди метаболитов штаммов родов Acremonium, Emericellopsis,
Cordyceps, Trichoderma и ряда других. Интересны для поиска антимикотиков
представители рода Trichoderma, среди которых установлены продуценты новых
мембранно-активных пептидов – пептаиболов (триховиринов, трихорзинов,
сузуказилинов), которые позволяют преодолеть антибиотикорезистентность
возбудителей (Ajesh et al., 2009; Daniel et al., 2007; Khan et al., 2014).
Проведение в последние годы анализа геномов и метаболомов дали новые сведения о богатстве вторичного метаболизма микроскопических грибов, о существовании еще не выявленных у них разнообразных антибиотиков, в том числе с антигрибной активностью. Об этом указывают данные по расшифровке области геномов нерибосомальных пептидсинтетаз (NRPSs), поликетидных синтаз (PKSs) и терпеновых синтаз (ТЭС), ответственных за синтез антимикотиков (Balde et al., 2010; Krasnoff et al., 2005; Mendoza-Figueroa et al., 2014).
Все это указывает на перспективность скрининга среди грибов-микромицетов указанных таксономических групп продуцентов соединений, активных в отношении условно-патогенных и патогенных грибов и разработке на их основе новых лекарств.
Целью работы была оценка распространенности среди микроскопических грибов порядков Eurotiales и Hypocreales способности к продукции соединений – антимикотиков, отбор и оптимизация условий культивирования перспективного штамма-продуцента пептаиболов, выделение и первичная очистка этих антибиотиков.
Задачи исследования
1. Оценка распространенности среди микроскопических грибов отдела Ascomycota c акцентом на представителей порядков Hypocreales и Eurotiales,
способности образовывать соединения с антимикотическими свойствами и выявление наиболее активных штаммов.
2. Определение спектра биологической активности, идентификация и физиолого-биохимическая характеристика штаммов, обладающих наибольшей ингибирующей активностью в отношении условно-патогенных и патогенных грибов.
3. Оптимизация условий культивирования для одного из лучших штаммов,
образующего антигрибные соединения, характеристика спектра его биологической
активности.
4. Выделение и очистка антибиотических веществ, образуемых наиболее
активным штаммом, установление их принадлежности к конкретной группе
химических соединений.
5. Проверка эффективности этих соединений in vitro на условно-патогенных и
патогенных штаммах грибов и бактерий, включая антибиотикоустойчивые культуры,
и оценка их токсического действия на клетки млекопитающих и опухолевые клетки.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Среди микроскопических грибов отдела Ascomycota высокая и умеренная антигрибная активность наиболее часто обнаруживается у представителей порядка Hypocreales, и относящиеся к нему виды рода Trichoderma (анаморфа рода Hypocrea). Для поиска активных продуцентов антимикотиков перспективными являются экониши, богатые органическим веществом - разлагающиеся растительные остатки, верхние гумусовые и торфяные горизонты почв.
-
Максимальную антигрибную активность продемонстрировали штаммы рода Trichoderma (T. citrinoviride, T. viride, T. gamsii, T. asperellum, T. koningii, T. harzianum), из которых наиболее высокой антимикробной активностью и широким спектром утилизации различных соединений обладает T. citrinoviride ВКПМ F-1228.
3. Оптимальным способом культивирования T.citrinoviride ВКПМ F-1228 для синтеза
антимикотиков является поверхностное выращивание на жидкой среде Сабуро (рН
7,5) с содержанием глюкозы – 50,0 г и пептона – 12,5 г в 1 л при 28оС в течение 13-14
суток.
4. Штамм T. citrinoviride ВКПМ F-1228 образует комплекс внеклеточных
антибиотиков-пептаиболов с антибактериальным, фунгицидным и цитотоксическим
действием, который не нетоксичен для клеток млекопитающих. В него входят
трихорзин и четыре неизвестных ранее пептаибола.
Научная новизна.
Проведен анализ распространенности способности к образованию антигрибных соединений среди микроскопических грибов с акцентом на представителей порядков Hypocreales и Eurotiales. Из 914 штаммов умеренная и высокая антимикотическая активность в отношении тест-культуры A.niger 2К установлена у 38% и 2% штаммов. Cреди представителей порядка Eurotiales (298 штаммов) умеренной и высокой антигрибной активностью обладали 39% и 0,4%, порядка Hypocreales (из 198 штаммов) - 52% и 9%, рода Trichoderma - 59% и 13%, , соответственно.
Наиболее активные штаммы обнаружены среди видов рода Trichoderma (порядка Hypocreales). Большинство из них выделены из разлагающихся органических субстратов и верхних гумусовых горизонтов почв лесостепной и степной зоны. В образцах экстремальных местообитаний высокоактивные штаммы не были выявлены, но есть перспективные изоляты родов Emericellopsis и Acremonium с умеренной активностью.
Установлено, что штамм T.citrinoviride ВКПМ F-1228 продуцирует пептаиболы с антимикотической, антибактериальной и цитотоксической активностями. Наряду с пептаиболом - трихорзином штамм синтезирует по предварительным данным четыре новых, не известных гидрофобных соединения пептидной природы, не имеющих аналогов в интерактивной базе .
Практическая значимость работы.
В результате скрининга 914 природных изолятов отобрано 9 штаммов 6 видов рода Trichoderma, продуцирующих внеклеточные антибиотики гидрофобной природы в отношении условно-патогенных грибов, которые могут быть использованы в дальнейших разработках с целью получения новых лекарственных препаратов.
Для поиска высокоактивных штаммов перспективно использовать образцы почв южных регионов (черноземных и темно-каштановых) и интразональных торфяных почв или верховых болот, а также – из разлагающихся растительных (древесных) остатков и местообитаний, ассоциированных с беспозвоночными.
Один из наиболее активных из отобранных штаммов - T. сitrinoviride TYVI 4/11 депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ F-1228 и на него как продуцента мембранно-активных пептидов, обладающих антибактериальной, антигрибной и цитотоксической активностью в отношении раковых клеток получен патент РФ №2564577. Показано отсутствие токсичности образуемого этим штаммом антибиотического комплекса по отношению к клеткам млекопитающих.
Подобраны оптимальные параметры культивирования штамма T. сitrinoviride ВКПМ F-1228 для синтеза комплекса антибиотических веществ, и на основе этого штамма разработан лабораторный регламент получения антибиотиков – пептаиболов. Продуцент может быть использован в разработках новых медицинских препаратов для лечения микозов и бактериальных инфекций, в том числе у онкобольных.
Апробация работы. Основные положения, выводы и предложения диссертационного исследования прошли апробацию на Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (XVI Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2012), на VI Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2013), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2014).
Личный вклад автора. Проведение опытов, анализ экспериментальных
данных и оформление полученных результатов осуществлено автором
самостоятельно, в соответствии с планом, согласованным с научными
руководителями. Масс-спектрометрический анализ и обращено-фазовая
высокоэффективная жидкостная хроматография активных фракций отобранного штамма выполнен совместно с к.х.н., н.с. Е.А. Рогожиным и д.х.н., зав. отдела В.А. Коршуном, цитотоксичность оценена на линиях опухолевых клетках совместно с к.б.н., с.н.с. Свирщевской Е.В. в ИБХ РАН. Токсичность к клеткам млекопитающим определяли в лаборатории экотоксикологического анализа почв МГУ при консультировании зав. д.б.н., Тереховой В.А. Исследования фунгицидной активности индивидуальных пептаиболов проводили на клинических аспергиллах совместно с в.н.с., к.б.н. Кулько А.Б. в ГКУЗ «МНПЦ борьбы с туберкулезом».
Публикация результатов. На основе полученных результатов было подготовлено и опубликовано 10 научных публикаций, в том числе 4 статьи в журналах перечня ВАК и 1 патент.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 180 страницах компьютерного текста, состоит из введения, глав, заключения, выводов, лабораторного регламента и приложений, включает 27 таблиц, 19 рисунков, 2 приложения. Список использованной литературы состоит из 207 источников, в том числе 195 иностранных.
Грибы, образующие соединения с антимикотической активностью
Полусинтетические препараты на их основе представляют собой липопептиды, состоящие из больших циклических пептидов, связанных с длинной цепью жирных кислот. Спектр активности эхинокандинов включает виды родов Aspergillus (включая штаммы, резистентные к амфотерицину В), Candida (в том числе изоляты резистентные к флуконазолу и итраконазолу), они также обладают ингибирующим действием в отношении родов Acremonium, Curvularia и Bipolaris, но не активны в отношении представителей родов Cryptococcus, Scedosporium и Fusarium. Склеротиды - циклические гексапептиды, образование которых показано для галофильного штамма A. sclerotiorum G.A. Huber 1933 (Путянь, Китай). Склеротиды ингибировали рост C. albicans при МИК 7.0 и 3.5 мкМ, соответственно. Культивирование этого штамма на обогащенной питательной среде и 10% содержанием соли позволило обнаружить 11 новых аспохрациновых циклотрипептидов - склеротиотидов A–K [202]. Эти гексапептиды проявили антимикробную активность в отношении C. albicans с МИК 7.5, 3.8, 30 и 6.7 мкМ, соответственно. Изолят A. unsulicola из образца грунта, собранного у берегов Гавайев, продуцировал пресклеротиотид F (302), N-деметилированное производное 62 склеротиотида F (296) [188,189].
Крисоспермины A-D из нового Вьетнамского штамма Xerocomus langbianensis Drfelt, Kiet and A. Berg bis 2004 (Boletaceae, Boletales) [64]. В отличие от этого примера, в примерах [23,111,112] продуцирование соответствующих пептаибиотиков тексеномицина, болетусина и тилопептина было отнесено к извлеченным веществам плодовых тел. Вполне вероятно, что произошло незамеченное инфицирование X. langbianensis Drfelt, Kiet and A. Berg bis 2004 с Sepedonium sp., которое и послужило причиной обнаружения четырёх крисосперминов [99]. Впервые крисоспермины были обнаружены у S. chrysospermum (Bull.) Fr. 1832 [65] – широкого распространенного паразита грибов порядка Boletales [76]. Штамм Coleophoma empetri (Rostr.) Petr. 1929 F-1899 продуцирует пептиды WF 11899 A, B, С, которые более эффективны в отношении C. albicans чем флуконазол.
Ауреобазидины продуцируются Aureobasidium pullulans (de Bary and Lwenthal) G. Arnaud 1918. Они практически не токсичны и обладают высокой биодоступностью. Активны в отношении грибов рода Candida, Cryptococcus neoformans (San Felice) Vuill. 1901, Blastomyces dermatitidis Gilchrist and W.R. Stokes 1898 и Histoplasma capsulatum Darling 1906. Ауреобазидин А обладает более широким спектром активности, чем эхинокандины, флуконазол и амфотерицин В. Лейциностатины А и В продуцируются P. lilacinum Thom 1910, а лейциностатины D, H и K – Paecilomyces marquandii (Massee) S.Hughes 1951. P. lilacinum так же продуцирует небольшие пептиды 1907-II и 1907-VIII, структуры которых похожи на лейциностатины. Активны в отношении C. albicans и С. neoformans, но, к сожалению, токсичны для клеток млекопитающих.
Хелиоферины продуцируются Mycogone rosea Link 1809. Активны в отношении C. albicans, но так же проявили тератогенное действие в отношении эмбрионов млекопитающих.
Образование нового циклического гептапептида унгуизина E установлено у штамма Aspergillus sp., выделенного из песка прибрежной зоны Тайваньского пролива у города Сямынь (Китай) [59]. Соединение является производным известного унгуизина A, с метилированным по CH2-группе феналаланином. Унгуизин E ингибировал рост C. albicans в концентрации 30 мкг/диск. Пептаиболы и пептаибиотики (липопептаиболы, липоаминопептаиболы, липоаминопептиды) представляют собой семейство пептидных антибиотиков продуцируемых грибами. Количество обнаруженных пептаиболов и пептабиотиков постоянно увеличивается. Они обладают интересными физико-химическими и биологическими свойствами, такими как антибактериальные, антигрибные, противовирусные [195] и противопаразитарные [158]. Как правило, свойства антибиотиков зависят от строения структур, например, формирующих поры в двухслойных липидных мембранах. Так же имеются данные, подтверждающие ингибирование митохондриальной АТФ и остановку окислительного фосфолирования, проявление имуносупрессорных свойств [54,123,125,130,163], ингибирование агрегации тромбоцитов [50], индукцию морфогенеза грибов и нейролептические свойства [81,139,152,205]. Для некоторых из этих соединений показана также противовирусная активность: они препятствуют синтезу капсида вирусов таких как грипп А, везикулярный вирус стоматита, ВИЧ. Перспективность исследования пептаиболов обусловлена тем, что к ним практически не возникает резистентность у клеток-мишеней.
Пептаиболы и похожие на них пептиды (пептаибиотики) продуцируются преимущественно грибами, в основном, почвенными сапротрофами или патогенами растений. Микофилных продуцентов пептаиболов можно обнаружить на плодовых телах или в их пределах аско или базидиомицетов. Большинство пептаиболов и пептаибиотиков были выделены из несовершенных грибов, относящихся к родам Trichoderma, Acremonium, Paecilomyces и Emericellopsis. Было сообщено об обнаружении пептаиболов болетусин [111] и тилопептины А и B [112], выделенных из нескольких плодовых тел базидиомицетов Boletus ssp. и Tylopilus neofelleus Hongo 1967. Авторы утверждают, что сделали подобные выводы на основании гомологи и выделенных структур с выделенными крисосперминами A-D [65]. Однако, данные сообщения вызывают некоторые сомнения, связанные с тем, что авторы не указывают был ли свежим (в случае с Boletus spp.) или высушенным (в случае с Tylopilus neofelleus Hongo 1967) материал, используемый для экстракции. Информация о состоянии материала для экстракции может указать на разложение или заражение микофильными грибами.
Синтез пептаиболов осуществляется мультиэнзимными комплексами – синтетазами, поэтому они являются продуктом нерибосомального синтеза. Мультиэнзимный комплекс содержит различные амикослоты, карбонильные остатки, гидроксильные остатки и другие предшественники, а каждая синтаза продуцирует только один тип пептида. Сам процесс сборки пептаиболов включает 3 последовательные стадии, выполняемые специфичными доменами ферментов. На первой ступени сборки происходит активация аминокислоты А-доменом за счет энергии АТР. Активированная аминокислота прикрепляется тиоэфирной связью к PCP-домену и транспортируется им. На 3 ступени синтеза С-домен формирует пептидную связь между остатками аминокислот, каждая из которых прикреплена к PCP-домену, и пептидной цепочкой, прикреплённой к предшествующему PCP-домену. Сборка завершается только после того, как на C-конец прикрепиться аминоспирт. При циклической структуре пептаибола образуется пептидная связь между первым и последним остатками аминокислот. Таким образом, пептаиболы представляют собой линейные, нерибосомальные пептиды, содержащие от 5 до 20 аминокислотных остатков, а присоединение различных ароматических остатков, как правило, происходит на C- и N-концах цепи [113].
Проверка продукции штаммами антигрибных соединений в жидкой среде и вторичный отбор штаммов с высокой антибиотической активностью
Для определения токсичности активной фракции использовали биотестирование на клетках млекопитающих, а именно сперматозойдов молодого быка. Сперма быка, замороженная в жидком азоте, производится в соответствии с ГОСТ 26030-83 на станциях искусственного осеменения. Хранится и транспортируется в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом. Срок хранения неограничен.
С этой целью использовали анализатор токсичности типа АТ (далее – анализатор). Принцип работы анализатора основан на подсчете подвижных сперматозоидов с использованием объектива микроскопа, компьютера, программ распознавания подвижных клеток, управления и вычисления индекса токсичности. Устройство термостатирования обеспечивало нахождение растворов при постоянной температуре (40 +/- 1,5) C, а устройство перемещения кювет обеспечивало проведение испытаний в автоматическом режиме. Для приготовления растворов использовался блок пробоподготовки, представляющий собой сухой термостат с набором гнезд для пробирок. В качестве кювет для помещения образцов использовали капилляры, Для настоящей методики экспериментально установлены следующие нормативные интервалы величины индекса токсичности: 80% = I = 120% - образец нетоксичен, I 80%, I 120% - образец токсичен.
Для определения индекса токсичности сравнивали опытный и контрольный растворы. В качестве контрольного раствора выбрали глюкозо-цитратную среду (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, дистиллированная вода -100 мл). Контрольная среда одновременно являлась разбавителем для оттаивания замороженной спермы. Опытным раствором являлся испытуемый образец, доведенный до изотонии сухими реактивами глюкозы и цитрата натрия (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, испытуемый раствор -100 мл). Контрольный и опытный растворы по 0,4 мл помещали в пробирки с притертыми пробками и ставили в устройство термостатирования.
Далее оттаивали замороженную сперму. Для этого дозировали в пробирку разбавитель согласно паспорту на сперму быка и помещали ее в устройство термостатирования. Охлажденным до температуры жидкого азота анатомическим пинцетом извлекали из сосуда Дьюара гранулу спермы и опускали ее в пробирку с нагретым разбавителем. Через каждые 1 - 2 минуты содержимое пробирки перемешивали легким встряхиванием. Через 5 - 6 минут в пробирке образовалась маточная суспензия сперматозоидов. Затем в пробирки с контрольным и опытным растворами помещали по 0,1 мл маточной суспензии сперматозоидов. Рабочие образцы переносили в кюветы. Для уменьшения случайной ошибки для каждого рабочего образца использовали выборку из 3 - 5 кювет. Кюветы устанавливали в кюветодержатель, который помещали в анализатор токсичности. Запускали процесс регистрации зависимости количества подвижных клеток от времени для рабочих контрольного и опытного образцов. Процессы, происходящие в кюветах, контролировались визуально на мониторе. По истечении времени, когда сперматозоиды визуально уже не были подвижными, прибор отключали и считали индекс токсичности по полученным данным [11].
Цитотоксическую активность фракции штамма Т. сitrinoviride ВКПМ F-1228 оценивали на 2-х линиях опухолевых клеток: Сolo 357 – клетки панкреатической карциномы и Т3М4 клетки рака печени. Для этого линии клеток культивировали в монослойных культурах во флаконах или планшетах на среде DMEMв термостате при температуре 37С с подачей СО2. В среды добавляли фетальную бычью сыворотку (FBS) 8%, L-глютамин, 300 мкг/мл, ампицилин/стрептомицин (50 мкг/мл), 2-меркаптоэтанол (5х10Е-5М). Для анализа цитотоксичности активной фракции штамма использовали тест с метил-триазолтетразолием (МТТ) (Sigma). МТТ-тест используется для анализа цитотоксичности потенциальных противоопухолевых соединений в эксперименте и основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5 дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического формазана, растворимого в диметилсульфоксиде. Клетки вносили в количестве по 30 тыс. на лунку в плоскодонный 96-луночный планшет, в котором заранее титровали культуральные фильтраты штаммов. Линии клеток инкубировали в СО2-инкубаторе 72чи в последние 4 часа добавляли 250 мкг/мл МТТ-реагента. По окончанию инкубированиянадосадочную жидкость убирали, а в лунки добавляли по 100 мклдиметилсульфоксида (Реахим, Москва) для растворения формазана. Окрашивание клеток анализировали на планшетном спектрофотометре (Titertek, UK), при длине волны 540 нм. Цитотоксическую активность оценивали по индексу ингибирования, рассчитывали по формуле (Iинг=ОП эксперим/ОП контроль) 100 % [32].
Антимикотическая активность микроскопических грибов, выделенных из почв различных природных зон
Углеводы и органический азот являются основными компонентами для конструктивного и энергетического обмена грибов. Обычно в средах для получения пептидных антибиотиков источником азота служат белки и продукты их гидролиза - пептоны, гидролизаты, отдельные аминокислоты [92]. Существенное значение для продукции пептидных антибиотиков грибами имеет также соотношение углерода и азота в среде, и применительно к каждому штамму-продуценту эта величина различна [134].
Стандартная питательная среда Сабуро содержит 40 г глюкозы и 10 г пептона на литр, в соответствии с матрицей значений нами были апробированы 4 варианта среды соотношения С/N в среде Сабуро: 1) 50 г глюкозы и 12,5 г пептона; 2) 30 г глюкозы и 12,5 г пептона 3) 50 г глюкозы и 7,5 г пептона и 4) 30 г глюкозы и 7,5 г пептона (таблица 17). Оптимизацию проводили по содержанию антибиотика в культуральной жидкости (количество активного экстракта после лиофилизации), при этом учитывали также накопление биомассы продуцента.
Среднее значение, биомасса (г/л) 31,4±0,21 20,4±0,24 24,4±0,025 28±0,10 Количествосухогоэкстрактаантибиотиков,мг/л 33 мг/л 27 мг/л 28 мг/л 30 мг/л Уравнение регрессии имеет следующий вид: y = 6,25 + 1,25x1 + 0,3125x2, где x1 – это значение содержания глюкозы x2 – это значение содержания пептона y – количества экстракта антибиотических веществ из культуральной жидкости. Оптимальное содержание определяемых компонентов среды было 30 г глюкозы и 12,5 г пептона на литр. Такая среда обеспечивала максимальный синтез и выделение штаммом антибиотического комплекса в культуральную жидкость. То есть увеличение содержание глюкозы и пептона по сравнению со стандартной средой оказывает положительный эффект на синтез антибиотика штаммом.
Данные экспериментов по определению оптимального способа выращивания штамма для синтеза антибиотических веществ представлены на рисунках 10, 11 и таблицах 17-21.
Динамика накопления антибиотических веществ при разных способах культивировании штамма T.citrinoviride ВКПМ F-1228 А Б Динамика антибиотической активности экстрактов КЖ T.citrinovinde ВКПМ F-1228 при мембранно-жидкостном (А) и поверхностном культивировании (Б). Тест-объект В. coagulians 429, номер варианта соответствует суткам в таблицах 17-21 Оптимальным для накопления антибиотиков штаммом был поверхностный способ культивирования. Штамм образовывал плотную мицелиальную пленку на поверхности жидкой среды, а после 5-6 суток формировались органы спороношения и начиналась секреция антибиотиков в культуральную жидкость.
Антибиотическая активность экстрактов КЖ Т. citrinoviride ВКПМ F-1228 при мембранно-жидкостном культивировании Вариант Сутки Зона подавления тест-культуры , мм Ка A.nigerINA 00760 B.subtillus АТСС6633
Это согласуется с известным наблюдением, что синтезу пептаиболов у грибов рода Trichoderma предшествует стадия интенсивного конидиогенеза. Так, аспорогенный мутантный штамм Т. harzianum переставал синтезировать комплекс пептаиболов в сравнении с исходным «диким» изолятом [105]. Близкие значения по продукции пептаиболов получены при мембранно-жидкостном культивировании штамма. И в этом случае у штамма создаются более благоприятные условия для конидиогенеза, чем в жидкой среде. В технологическом аспекте данный способ более предпочтителен, поэтому перспективно его применение для синтеза многих метаболитов грибов, включая антибиотики. Выход целевого продукта с его использованием можно повысить путем оптимизации режима подпитки среды.
Оптимизация состава и рН среды, температуры и способа культивирования позволила увеличить выход комплекса антибиотических веществ в 1,83 раза по сравнению с исходными условиями.
Активность антибиотиков в экстракте культуральной жидкости T. citrinoviride ВКПМ F-1228 после оптимизации состава среды, условий и способа культивирования достигала 40 ед. по стрептомицину и 80 ед. – по амфотерицину В.
Итак, оптимальным способом культивирования штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 для синтеза антимикотиков является поверхностное выращивание на жидкой среде Сабуро с содержанием глюкозы – 30,0 г и пептона – 12,5 г в 1 л, при температуре 28оС, рН – 7,5 в течение 12-14 суток.
Характеристика спектра антибиотической активности и утилизации соединений у отобранных штаммов рода Trichoderma
Грибы были первыми источниками антибиотиков, с которых началась успешная эра лечения многих бактериальных инфекций, а позднее и микозов. Но если арсенал антибактериальных препаратов за 70 лет с момента внедрения антибиотиков в медицину значительно расширился, эффективных антигрибных лекарств найдено мало, а к уже применяемым антимикотикам наблюдается появление резистентных штаммов [31,9].
Одними из перспективных антибиотиков являются нерибосомальные пептиды, позволяющие эффективно бороться с антибиотикорезистентными микроорганизмами [95].
Последние достижения в медицинской микологии, геномики и протеомике грибов дают основание считать, что грибы способны продуцировать огромное разнообразие еще не известных антигрибных соединений, в том числе нерибосомальных пептидов, пептаиболов [31,47,166].
Проведенный нами анализ литературы позволил предположить, что одними из перспективных таксономических групп грибов для разработки этой проблемы являются аскомицеты, причем в первую очередь порядков Hypocreales и Eurotiales. Это предположение оказалось верным для порядка Hypocreales среди представителей которого способность к синтезу антигрибных соединений оказалась выше, чем среди евроциевых грибов и других таксонов аскомицетов. В целом же способность к продукции антимикотических соединений с высокой и умеренной активностью обнаружена у более трети проверенных штаммов аскомицетов. И если в данном исследовании для дальнейшей работы были отобраны только высоко активные штаммы по продукции антигрибных веществ в жидкой среде, то в будущем, конечно, более детально должны рассматриваться и многие другие штаммы с умеренной активностью, таксономическое разнообразие которых много выше. Практически все штаммы с высокой антигрибной активностью оказались представителями нескольких видов триходерм. Это согласуется с тем, что уже многие годы при скрининге изолятов для защиты растений от грибных патогенов одними из лучших были штаммы триходерм [141]. В последние годы установлено, что грибы рода Trichoderma синтезируют около 600 различных пептаиболов, проявляющих активность в отношении опухолевых клеток, грамположительных бактерий, патогенных грибов и дрожжей [169]. У представителей T. сitrinoviride наблюдали активность в отношении стафилококков с множественной резистентностью [105], а у штамма T. citrinoviride 2963 был обнаружен антибиотик из группы пептаиболов, подавляющий рост метициллинрезистентного золотистого стафилококка [1].
Данная работа на представительной выборке изолятов показывает, что действительно этот таксон грибов не исчерпал себя и требует дальнейшего изучения. Способность к проявлянию умеренной и высокой активности обладали 59% и 13% штаммов триходерм. В то время как, например, среди пенициллов 42% и 0,4%, аспергиллов 30 % (умеренная активность). У нового штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 обнаружен ряд неизвестных ранее пептаиболов с новым спектром биологической активности.
Следует отметить, что если среди представителей евроциевых (пенициллов, аспергиллов и др.) чаще обнаруживали эффективных продуцентов антибактериальных антибиотиков, нашедших широкое применение в медицине, то среди гипокрейных, по-видимому, есть шанс выявить такие же перспективные для фармацевтики антигрибные препараты.
Огромное разнообразие вторичных метаболитов обнаруживаемых ежегодно у грибов, большой потенциал неизвестных грибных организмов и необследованных регионов Земли позволяют считать, что многие соединения необходимые для лечения инфекционных болезней остаются неоткрытыми. Сравнительный анализ экотопов, в которых наиболее часто выявляются изоляты с высокой и умеренной антигрибной активностью, показал, что это верхние гумусовые горизонты почв, в первую очередь лесостепной/степной зоны, богатые органическим веществом, торфяные горизонты и разлагающиеся растительные остатки и местообитания связанные беспозвоночными (буровая мука и др.). Это вполне согласуется с тем, что в таких экотопах высока плотность микроорганизмов и конкуренция между ними. В экстремальных местообитаниях высоко активных антигрибных штаммов не было обнаружено, что связано в большим экологическим «вакуумом». Вместе с тем, выявлены таксоны с умеренной активностью которые следует использовать в дальнейшей работе по поиску новых антимикотиков.
Важным достижением работы можно считать отработку процедуры оптимизации условий синтеза, выделения и очистки антибиотического комплекса пептаиболов у T. citrinoviride ВКПМ F-1228. Этот этап исследований заложил основу для проверки, имеющихся в настоящее время в коллекции 9 активных штаммов разных видов рода Trichoderma, в более короткие сроки первичное изучение продукции пептаиболов. Предложенный лабораторный регламент дает возможность нарабатывать партии препарата с антибиотическим комплексом пептаиболов для дальнейших испытаний и исследований, так как полученные в данной работе результаты по отсутствию токсичности, спектру антимикробной активности, включая ингибирование резистентных к антигрибным препаратам клинических изолятов аспергиллов имели положительный результат.